EMS誘導(dǎo)粒用高粱的突變體篩選和鑒定

于 淼 陳冰嬬 石貴山 馮詠琪 楊永志 李海青 唐玉劼 王 鼐，*

（1吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所，吉林 長春 130033；2吉林省種子管理總站，吉林 長春 130031；3吉林省紅糧種業(yè)科技有限公司，吉林 公主嶺 136100）

高粱［Sorghnm bicolor（L.）Moench］是我國重要的糧飼作物和釀造原料［1］，具有耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿等特性，而且光合效率高、雜種優(yōu)勢強、產(chǎn)量穩(wěn)定，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位［2-3］。高粱新品種的選育是滿足其生產(chǎn)發(fā)展的有利前提，但自1990年以來，高粱品種資源遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄，育成品種間遺傳差異小，品質(zhì)和抗性一直未有提高，突破性品種資源匱乏，因此，創(chuàng)制優(yōu)良高粱新種質(zhì)是拓寬種質(zhì)資源和培育新品種的關(guān)鍵［4-5］。由于化學(xué)誘變技術(shù)具有成本低，使用方便，點突變率高，染色體畸變異少、易于篩選等優(yōu)點，現(xiàn)已成為作物優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)制和基因功能研究的有效方法，被育種者廣泛使用［6］。其中，甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfone，EMS）能打破性狀間的緊密連鎖，促進基因重組，可有效改良作物的個別單一性狀，被認為是最高效、安全的化學(xué)誘變劑，已廣泛應(yīng)用于花生［7］、擬南芥［8］、大豆［9］、玉米［10］、水稻［11］、大麥［12］、小麥［13］、油菜［14］等作物的誘變育種。2008年Xin 等［15-16］利用EMS處理高粱BTx623種子，構(gòu)建了1 個包含矮化、葉色和葉形等不同類型突變體的高粱突變體庫，并從M4突變體庫中獲得可穩(wěn)定遺傳的矮化突變體dw5，構(gòu)建了突變體dw5 與BT×623 雜交的F2代群體。2019年Chen 等［17］利用此群體獲得了1 個矮化新基因，并命名為Dw5。2010年呂鑫等［18］最先在國內(nèi)開展高粱EMS 誘變的相關(guān)研究，獲得了一批有關(guān)株高、穗長和育性及結(jié)實率等性狀的突變體。之后越來越多的研究學(xué)者對山西、山東、四川等地主推的高粱品種和骨干親本進行EMS 誘變處理，為遺傳改良提供了豐富的表型變異材料［19-20］。但是，仍鮮有以北方粒用高粱為材料的化學(xué)誘變相關(guān)研究，因此，本研究以吉林省應(yīng)用的粒用高梁骨干親本恢復(fù)系10125 和保持系2055B 為研究材料，以不同濃度EMS 和浸種時間處理高粱種子，統(tǒng)計處理后高粱的出苗及農(nóng)藝性狀的誘變效應(yīng)，確定2 種類型高粱種子最佳的EMS 誘變條件，并在M2代對誘變材料進行表型的鑒定篩選，以期為高粱突變體庫構(gòu)建、高粱新品種選育提供基礎(chǔ)材料和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試材料為2 個粒用高粱親本系，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所選育。保持系2055B：生育期112 d，分蘗弱，株高70 cm，穗緊圓筒型，穗長21 cm，無芒，單穗粒重65 g，籽粒淺黃白色圓形，千粒重28.8 g。恢復(fù)系10125：生育期120 d，分蘗弱，株高125.6 cm，穗緊棒型，穗長27.0 cm 左右，無芒，單穗粒重72.3 g，籽粒紅色卵形，千粒重30.2 g。

處理所用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變劑購自美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 試驗設(shè)置8 個濃度（0%、0.1%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.5%）的EMS 誘變劑溶液，挑選籽粒飽滿的種子分別進行誘變處理。每個處理300粒種子，3次重復(fù)。置于培養(yǎng)皿中用蒸餾水浸泡4 h，將浸泡后的種子分別用配置好的8 個濃度的EMS 誘變劑分別進行8、14、20、26 h 的浸種處理。處理結(jié)束后用流水沖洗種子4 h，置于通風(fēng)干燥處晾干，2019年5月20日將處理的種子點播于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院公主嶺試驗基地，種子播種距離5 cm，行距60 cm，共80 個小區(qū)（3 m×3 m）。所有田間管理均采用高粱大田常規(guī)管理。

1.2.2 M1代處理 2019年播種后，調(diào)查出苗時間、出苗數(shù)、成苗數(shù)。出苗時間以調(diào)查之后連續(xù)3 d無新苗出現(xiàn)為準(zhǔn)，成苗數(shù)以長至三葉一心的健康幼苗為準(zhǔn)。在M1代開花期對所有單株進行套袋自交，成熟期調(diào)查結(jié)實率。

1.2.3 M2代處理 將M1代自交種子按照相同EMS濃度，不同誘變時間，進行單株收獲。將收獲的M1代自交種子于2020年5月12日種植于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院公主嶺試驗基地，M2代按株系種植，每株系1 行，行長3.0 m，行距0.60 m，株距0.13 m。調(diào)查記載M2代每株的表型，統(tǒng)計各處理的突變率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理、處理及作圖采用Microsoft Excel 2019軟件，方差分析采用SPSS 22.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對高粱種子出苗率的影響

如圖1所示，EMS 處理對兩親本出苗都具有一定抑制作用，出苗率均表現(xiàn)出隨著EMS 濃度增加和誘變時間延長而逐漸降低，但在誘變時間8 h、EMS 濃度小于0.2%時，2055B 和10125 的出苗率均明顯高于CK?？梢?，低濃度短時間的誘變處理對高粱種子出苗有一定的促進作用，高濃度長時間誘變抑制高粱種子出苗。2055B 經(jīng)EMS 處理的誘變時間和濃度在14 h/20 h+0.3%以上時，所有處理組合出苗率均不足50%；10125經(jīng)EMS 處理的誘變時間和濃度在14 h+0.3%/20 h+0.25%以上時，所有處理組合出苗率均不足50%。誘變時間為26 h時，EMS濃度為0.5%，10125種子出苗率為0，EMS 濃度大于0.3%，2055B 種子出苗率為0，表明EMS 達到一定的時間和濃度后，種子致死，不能出苗?？傮w來看，同一水平處理恢復(fù)系10125出苗率高于保持系2055B，說明EMS處理對2055B的出苗率影響更大。

圖1 EMS處理對高粱M1代的出苗率的影響Fig.1 Effects of the EMS treatment on seeding emergence rate on M1 germination

2.2 EMS處理對高粱M1代幼苗成活率的影響

以調(diào)查期內(nèi)最后成苗數(shù)占總出苗數(shù)的百分比來計算幼苗成活率，結(jié)果如圖2所示。對照出苗時間為3～5 d，成苗率高達97.0%；隨著EMS 濃度的增加和誘變時間的延長，出苗時間也延后，26 h+0.25%處理的出苗時間為14～17 d，2055B 和10125 的成苗率分別為49.98%、67.23%，說明EMS 處理延長了M1的出苗時間，且有致死現(xiàn)象。EMS處理對2055B和10125成苗率的影響總趨勢一致，即隨著EMS 濃度增加和誘變時間延長，抑制作用增強，但是在EMS 濃度為0.10%～0.25%、誘變時間為8～20 h條件下，兩親本成苗率與對照相比差異明顯。當(dāng)EMS濃度為0.5%時，不同誘變時間下兩親本成苗率均下降到不足70%，誘變時間為26 h時，成苗率為0%。

圖2 EMS處理對高粱M1代的成苗率的影響Fig.2 Effects of the EMS treatment on seedling rate on M1 germination

2.3 EMS處理對高粱種子結(jié)實率的影響

在成熟期調(diào)查M1代植株的結(jié)實情況，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果如圖3所示。隨著EMS濃度的增加和誘變時間的延長，結(jié)實率逐漸降低。當(dāng)EMS 濃度為0.1%，誘變時間為8、14、20 h 時結(jié)實率均達到50%以上。當(dāng)EMS 濃度為0.2%時，誘變8 h 的2055B 和10125 結(jié)實率分別為70%、85%，而誘變26 h的2055B和10125的結(jié)實率僅有15.3%和25.0%，差異明顯。當(dāng)EMS濃度為0.25%時，除了誘變8 h，其他3 個誘變時間的2055B 和10125 結(jié)實率均不足50%。當(dāng)EMS濃度為0.3%時，2055B的四個誘變時間的結(jié)實率均不足30%，10125 在誘變8 h 的結(jié)實率為70%，其他3 個誘變時間的兩親本結(jié)實率均不足30%。當(dāng)EMS 濃度達到0.4%以上時，誘變8 h 后的2055B 和10125 的結(jié)實率分別為10%、12%，其他誘變時間的兩親本結(jié)實率均為0。

圖3 EMS 處理對M1代種子結(jié)實率的影響Fig.3 Effects of the EMS treatment on seed seting rate on M1 germination

2.4 EMS處理后M2代高粱植株突變率

調(diào)查M2代植株的表型變化來統(tǒng)計各處理的突變率，結(jié)果如圖4所示。EMS 處理濃度和誘變時間在26 h+0.3%以上時，2055B 的出苗率為0；EMS 處理濃度和誘變時間在26 h+0.35%以上時，10125 的出苗率為0，此時兩親本系均沒有突變株。EMS 處理時間和濃度為20 h+0.5%時，2055B 和10125 的突變率最高，分別為21.3%和46.8%；但此誘變處理嚴(yán)重抑制了種子的出苗率和結(jié)實率，且較少的種子數(shù)量不利于突變體庫的構(gòu)建。同一濃度和時間處理水平下，2055B 的變異率明顯高于10125，表明EMS處理后2055B更敏感。

圖4 EMS處理對M2代植株突變率的影響Fig.4 Effects of the EMS treatment on plant mutation rate on M2 germination

2.5 EMS處理后M2代高粱植株表型變異

2.5.1 葉部性狀變異 在10125 和2055B 的誘變?nèi)后wM2代中，均觀察到葉片有白化和黃化出現(xiàn)，其中部分幼苗整株都發(fā)生白化或黃化（圖5-a、c），植株因不能正常光合作用而死亡。部分幼苗葉片有黃色條紋（圖5-b），能正常成熟結(jié)粒。在M2代中，觀察到一些較對照葉片多、葉片寬大的突變體單株，該類突變材料光合作用強，穗型偏散，單株產(chǎn)量高，但不符合現(xiàn)今育種目標(biāo)對親本材料株型耐強、穗型緊湊的要求。在M2代中，還篩選出適于育種的基礎(chǔ)材料，表現(xiàn)為較對照葉片窄小，植株直立上沖，耐密植。高粱葉脈顏色常見的有黃色、綠色和白色。本研究中2055B的葉脈為白色，在2055B 的EMS 處理濃度和誘變時間為14 h+0.25%時M2代發(fā)現(xiàn)一株黃色葉脈突變體（圖5-d、e）。

圖5 2055B EMS誘變后代的葉片突變類型Fig.5 Leaf mutation types of EMS mutagenized offspring for 2055B

2.5.2 株型和穗部性狀變異 恢復(fù)系10125 株高一般在120～125 cm，EMS 誘變時間和濃度在14 h+0.35%處理后的群體中，出現(xiàn)了株高55～70 cm 的矮化突變體（圖6-a）。在10125 的14 h+0.3%EMS 處理中，有1 株3 個分蘗和1 株5 個分蘗的突變體（圖6-c、d）?；謴?fù)系1012為穗緊呈棒型，2055B的穗緊為筒型，在誘變后的M2代群體中，篩選出穗型為穗緊紡錘型穗（圖6-f）、穗緊筒型穗（圖6-g）和散穗傘型穗（圖6-h）的突變體?；謴?fù)系10125粒色為紅色，EMS誘變時間和濃度在14 h+0.3%時有1株白粒突變；2055B的粒色為粉白色，誘變處理后有紅粒突變。

圖6 10125 EMS誘變后代的株型和穗部突變類型Fig.6 Plant type and panicle mutation types of EMS mutagenized offspring for 10125

2.5.3 生育期和結(jié)實率變異 對誘變處理的高粱M2代成熟期進行調(diào)查，結(jié)果見圖7。EMS 處理后，部分突變體比對照提前7 d 左右成熟，部分突變體延后8 d 左右成熟，還有些突變體甚至延后15 d成熟，表現(xiàn)為誘變處理后晚熟材料多于早熟材料。EMS 處理后，高粱M2代種子結(jié)實率降低，結(jié)實率為30%～70%。

圖7 10125 EMS誘變后代的生育期和結(jié)實率突變類型Fig.7 Fertility period and seed set rate types of EMS mutagenized offspring for 10125

3 討論

EMS 誘變處理是構(gòu)建飽和突變體庫的有效途徑，誘變后種子的突變率、出苗率和結(jié)實率是篩選誘變適宜濃度和時間的重要指標(biāo)。高濃度長時間的誘變會嚴(yán)重降低種子的出苗率和結(jié)實率，遺漏可利用的突變體；低濃度短時間的誘變會降低突變率，提高出苗率和結(jié)實率，加大突變體的篩選工作量［21-23］。在同一誘變條件下，恢復(fù)系10125 的出苗率、成苗率、結(jié)實率受抑制作用小于保持系2055B，突變率低于2055B，可能與恢復(fù)系比保持系種子有更強的出苗動力有關(guān)［24］。選用這兩粒用高粱親本系構(gòu)建高粱突變體庫時，恢復(fù)系10125 所需的EMS 處理濃度和誘變時間高于保持系2055B。綜合考慮出苗率、結(jié)實率和突變率，2055B EMS 誘變時間和濃度為14 h+ 0.25%時，田間出苗率為55.53%，成苗率為89.25%，結(jié)實率為20.00%，突變率為12.70%，是較為適宜的處理條件；恢復(fù)系10125 EMS 誘變時間和濃度為14 h+0.3%時，田間出苗率為53.53%，成苗率為97.11%，結(jié)實率為15.30%，突變率為12%，是較為適宜的誘變條件。王春語等［25］和劉言龍等［26］對高粱品種BTx623 的突變種子鑒定篩選時發(fā)現(xiàn)，采用多濃度多時間的處理方式可使突變類型更多樣，從而構(gòu)建飽和的近等基因系突變體庫。因此，本試驗中兩粒用高粱親本系可根據(jù)試驗需求進行組合處理，誘變時間均為14～20 h，保持系2055B 的誘變濃度為0.20%～0.25%，恢復(fù)系10125 的誘變濃度0.25%～0.35%。

多樣的種質(zhì)資源是現(xiàn)代育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，用EMS誘導(dǎo)突變體在較短的時間內(nèi)可以獲得更多的優(yōu)良變異類型［27］。前人研究表明，M2代是選擇突變體的關(guān)鍵時期，因為EMS 誘導(dǎo)的突變屬于隱形突變，誘變當(dāng)代表型不明顯，在M2代開始產(chǎn)生分離［28-29］。本研究通過對EMS 處理的誘變后代M2代進行表型觀察、鑒定和篩選，低濃度短時間的誘變，即誘變時間8～14 h，誘變濃度0.1%～0.2%，M2代突變頻率低，突變類型很少，早熟材料居多；高濃度長時間的誘變，即誘變時間26 h，誘變濃度0.4%～0.5%，M2代突變頻率高，但植株矮稈和畸形突變多，突變類型不豐富。王煒等［29］對甜高粱種子進行誘變，發(fā)現(xiàn)誘變的M2代植株中突變性狀多以單株形式表現(xiàn)，且多為雜合突變體。因此，在構(gòu)建突變體庫時，可以考慮在M2代中，對突變體的鑒定集中于株高、穗型、葉型等表型的鑒定，選擇表現(xiàn)優(yōu)良、正向突變類型的植株標(biāo)記編號，進而篩選品質(zhì)、根系、抗逆等重要性狀的突變體，加快突變體選擇效率，為遺傳改良提供種質(zhì)資源材料。本研究中，M2代獲得了較多有價值的突變，如早熟、分蘗、矮稈、緊穗等性狀，可結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，研究粒用高梁突變位點、相關(guān)性狀功能基因定位，也可從生理生化等方向深入研究突變產(chǎn)生的機理，分析后代各變異類型的發(fā)生頻率及遺傳規(guī)律，提高突變體選擇的準(zhǔn)確性和利用效率［30-31］。

4 結(jié)論

本研究采用不同EMS濃度和時間處理粒用高梁親本系種子發(fā)現(xiàn)，EMS 對高粱種子的影響隨著EMS 濃度和誘變時間的增加而升高，同一處理水平下，兩親本對EMS的敏感性不同，2055B對EMS處理更為敏感。綜合出苗率、結(jié)實率以及突變率，2055B 最佳誘變時間和EMS濃度為14 h+0.25%，10125為14 h+0.3%，同時初步構(gòu)建了包含矮稈、緊穗、早熟等表型變異的高粱突變體庫。