lncRNA LINC00173通過調(diào)節(jié)miR-130a-5p抑制骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的機制研究

林 浩，徐德利，張 凱

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)主要發(fā)生在青少年和兒童中，病情發(fā)展迅速，病死率高[1]。目前，OS的主要治療方法包括手術(shù)、化療、免疫療法和基因療法等，盡管這些醫(yī)療技術(shù)對病人生存時間有所改善，但存活率仍然很低，病人預(yù)后較差[2]。因此，闡明OS的分子機制，有助于為OS病人的治療提供新的方法。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。近年來，越來越多的研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用；許多l(xiāng)ncRNA在OS中差異表達，并且其表達的失調(diào)與OS的發(fā)展有關(guān)，因為lncRNA可充當致癌因子或腫瘤抑制因子[5-6]。LINC00173是位于12q24.22染色體上的一種lncRNA，在人類多種腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7-10]。潘海霞等[11]研究顯示，與非腫瘤組織比較，OS組織中LINC00173的表達降低，且與腫瘤分期、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化密切相關(guān)，提示LINC00173參與調(diào)節(jié)OS的發(fā)生發(fā)展，因此本實驗探討LINC00173對OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其調(diào)控OS發(fā)生和發(fā)展的作用機制?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人OS細胞株MG-63(中國科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素和鏈霉素(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；Trizol試劑和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR檢測試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(LINC00173 F 5′-GGA ATG TTG CGA TCC TCT GG-3′；R 5′-CAG CCA TGT CTC AGA GGT GA-3′；GAPDH F 5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3′；R 5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3′；miR-130a-5p F 5′-CCA GGG CTT TTC AAA AAT GA-3′；R 5′-CCG ATC CAA TCT GTT CTG GT-3′；U6 F 5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；R 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠(美國Corning公司)；LINC00173過表達載體質(zhì)粒及空載質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；miR-130a-5p mimics及mimics control(廣州市銳博生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；LINC00173-Wt和LINC00173-Mut報告基因載體(美國Promega公司)。

1.2 實驗分組 人OS細胞株MG-63培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液基中，放置在常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中，條件設(shè)為37 ℃、5%CO2、飽和濕度；每隔1 d換液1次，待MG-63細胞生長融合度至80%以上時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)期的MG-63細胞，將MG-63細胞以2×105個/孔接種到6孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞融合度達50%時，使用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，具體操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將轉(zhuǎn)染LINC00173過表達載體質(zhì)粒的MG-63細胞記為pc-LINC00173組，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的MG-63細胞記為pcDNA組，將未行轉(zhuǎn)染的MG-63細胞記為Mock組；將共轉(zhuǎn)染LINC00173過表達載體質(zhì)粒和mimics control的MG-63細胞記為pc-LINC00173+miR-NC組，共轉(zhuǎn)染LINC00173過表達載體質(zhì)粒和miR-130a-5p mimics的MG-63細胞記為pc-LINC00173+miR-130a-5p組。

1.3 qPCR實驗 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組MG-63細胞，采用Trizol法提取細胞中總RNA，使用NanoDrop測定RNA的含量，以RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成第一鏈cDNA，根據(jù)SYBR Green qPCR檢測試劑盒說明書配置反應(yīng)體系和擴增，以GAPDH為內(nèi)參，分析LINC00173的相對表達量，以U6為內(nèi)參，分析miR-130a-5p的相對表達量。采用相對定量2-ΔΔCt法進行計算，實驗重復(fù)3次取均值。

1.4 CCK-8實驗 取對數(shù)生長期MG-63細胞以1×103個/孔鋪板于96孔板中，以1.2分組和轉(zhuǎn)染，分別檢測24、48和72 h時細胞增殖能力。在各個時間點向96孔板每孔細胞中加入CCK-8試劑20 μL，放置在37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，使用酶標儀于450 nm波長測定吸光度值，實驗重復(fù)3次取均值。

1.5 Transwell實驗 收集轉(zhuǎn)染后的各組MG-63細胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備濃度為2.5×105/mL單細胞懸液，取200 μL細胞懸液加入Transwell小室的上室(Matrigel包被為細胞侵襲實驗，Matrigel未包被為細胞遷移實驗)中，在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將細胞放置在常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出小室，用濕潤的棉簽擦去上室細胞，以4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，以PBS洗去染液，晾干后在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)各組穿膜細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次取均值。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?對數(shù)生長期的MG-63細胞種植到6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合至60%，采用Lipofectamine 2000將miR-130a-5p mimics/mimics control與構(gòu)建的LINC00173-Wt/Mut共轉(zhuǎn)染至MG-63細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組MG-63細胞的相對熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次取均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、單因素方差分析及秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組MG-63細胞中LINC00173表達量比較 qPCR檢測結(jié)果顯示，與Mock組比較，pc-LINC00173組LINC00173在MG-63細胞中的表達量明顯升高(P<0.01)，而pcDNA組與Mock組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 LINC00173在各組MG-63細胞中表達量比較

2.2 各組MG-63細胞增殖能力比較 MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后3組MG-63細胞增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，pc-LINC00173組細胞增殖活力均低于Mock組和pcDNA組(P<0.01)，pcDNA組與Mock組MG-63細胞增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 轉(zhuǎn)染24、48和72 h后各組MG-63細胞增殖活力比較

2.3 各組MG-63細胞侵襲和遷移能力比較 Transwell檢測結(jié)果顯示，pc-LINC00173組與Mock組比較侵襲和遷移細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，pcDNA組與Mock組比較侵襲和遷移細胞數(shù)無明顯變化(P>0.05)(見表3)。

表3 各組侵襲和遷移細胞數(shù)比較

2.4 LINC00173和miR-130a-5p靶向關(guān)系驗證 生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫LncBase Predicted v.2預(yù)測結(jié)果顯示(見圖1)，LINC00173與miR-130a-5p之間存在特異性結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-130a-5p mimics能夠抑制LINC00173-Wt細胞的相對熒光素酶活性(P<0.01)，而2組LINC00173-Mut細胞的相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。qPCR檢測結(jié)果顯示，與Mock組和pcDNA組比較，pc-LINC00173組MG-63細胞中miR-130a-5p的表達量均降低(P<0.01)，Mock組和pcDNA組MG-63細胞中miR-130a-5p的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表5)。

表4 各組細胞的相對熒光素酶活性比較

表5 各組MG-63細胞中miR-130a-5p表達量比較

2.5 過表達miR-130a-5p逆轉(zhuǎn)過表達LINC00173對MG-63細胞增殖、侵襲和遷移的抑制 與pc-LINC00173組和pc-LINC00173+miR-NC組比較，pc-LINC00173+miR-130a-5p組MG-63細胞中miR-130a-5p的表達明顯升高，吸光度值明顯升高，侵襲和遷移細胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，pc-LINC00173組和pc-LINC00173+miR-NC以上指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表6)。

表6 各組MG-63細胞中miR-130a-5p的表達、吸光度值、侵襲和遷移細胞數(shù)比較

3 討論

近年來，lncRNA被鑒定為腫瘤發(fā)生和進展的新型調(diào)節(jié)劑。多種lncRNA表達失調(diào)與OS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在體外和體內(nèi)，這些lncRNA扮演致癌或抑癌因子的角色，在OS的惡性生物學(xué)行為中起重要作用[12-14]，因此，研究lncRNA在OS中的特定作用及機制可能為OS的治療提供思路。LINC00173在不同類型的癌癥中起著不同的作用。如LINC00173的過表達抑制非小細胞肺癌細胞中癌細胞的增殖和遷移[15]。而LINC00173被證實是小細胞肺癌中的致癌lncRNA，在體外能促進癌細胞的化學(xué)抗性、增殖和轉(zhuǎn)移以及體內(nèi)腫瘤的化學(xué)抗性和生長[16]。此外，LINC00173的高表達與黑素瘤病人的不良臨床特征和總體生存時間短有關(guān)[17]。在宮頸癌中，LINC00173表達的下調(diào)與存活率低有關(guān)[18]。FAN等[19]的研究顯示，LINC00173通過抑制miR-490-3p表達來增強三陰性乳腺癌的進展。但是，對LINC00173在OS中的作用及分子機制知之甚少。本實驗發(fā)現(xiàn)過表達LINC00173能夠在體外抑制OSMG-63細胞增殖、遷移和侵襲，表明LINC00173在OS中發(fā)揮抑癌作用。機制分析發(fā)現(xiàn)，LINC00173對OS細胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用可能與下調(diào)miR-130a-5p表達有關(guān)?；谝陨涎芯客茰y，LINC00173在癌癥中是發(fā)揮抑癌還是促癌作用可能與癌癥的不同類型以及其下游靶基因的不同有關(guān)。

lncRNA可作為miRNA海綿調(diào)控細胞生長和轉(zhuǎn)移[20]。在宮頸癌中LINC00173充當miR-182-5p的分子海綿，并反向調(diào)節(jié)宮頸癌細胞中的miR-182-5p水平，抑制HeLa細胞增殖和侵襲[18]。在本實驗中，生物信息學(xué)分析表明LINC00173序列含有miR-130a-5p的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了這一預(yù)測。qPCR發(fā)現(xiàn)過表達LINC00173可降低OS細胞中miR-130a-5p的表達，提示LINC00173能夠通過使miR-130a-5p海綿化參與OS的發(fā)生和發(fā)展。miR-130a-5p已被報道在OS中表達上調(diào)，并與OS病人的不良臨床特征和預(yù)后密切相關(guān)，體外實驗表明，miR-130a-5p可以增強OS細胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[21]。在本研究中，過表達LINC00173能夠下調(diào)miR-130a-5p的表達；挽救實驗證實，在MG-63細胞中，過表達miR-130a-5p能夠減弱LINC00173過表達對MG-63細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。提示，LINC00173過表達可能通過下調(diào)miR-130a-5p來抑制OS細胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，LINC00173能夠抑制OSMG-63細胞增殖、遷移和侵襲，促進OS的進程，其作用機制可能與抑制miR-130a-5p的表達有關(guān)。本實驗結(jié)果表明LINC00173/miR-130a-5p信號軸有望成為OS早期診斷、治療及預(yù)后評估的標志物，可能為OS的治療提供新的思路。