不同傳染性法氏囊病病毒株感染對(duì)CCL19-CCR7軸系表達(dá)量的影響

王秋霞，張 新，楚富茗，王明明，王 芳，盧 浪，魏小兵，余 燕，張艷紅，馬金友，姜金慶，歐長(zhǎng)波，劉興友,2

(1. 河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003 ； 2. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是禽類(lèi)傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)的病原體，主要攻擊禽類(lèi)的中樞免疫器官——法氏囊，從而引起育成雞的病理?yè)p傷和免疫抑制，若同時(shí)混合其他病原感染，往往會(huì)引起雞只的大批死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

有研究顯示，在IBDV感染過(guò)程中，法氏囊組織受到攻擊，導(dǎo)致前B淋巴細(xì)胞凋亡[1-2]，大量的外源T細(xì)胞遷移至法氏囊[3]，浸潤(rùn)法氏囊的T細(xì)胞活化后，釋放Th1細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)，可刺激巨噬細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素IL-6、IL-1β和趨化因子CXCLi2等[4]，在IBDV感染后的炎癥過(guò)程、病毒清除和法氏囊損傷發(fā)展以及恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，也造成了周?chē)M織的病理?yè)p傷[5-7]。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，IBDV CJ801株感染早期，部分趨化因子及其受體的表達(dá)量明顯上調(diào)，其中以趨化因子CCL19的表達(dá)量變化最為明顯[8]。

T細(xì)胞趨化至法氏囊發(fā)揮T細(xì)胞免疫應(yīng)答受宿主基因型和毒株毒力的影響，有研究顯示，宿主基因型和毒株毒力能夠影響IBDV感染后產(chǎn)生的病變程度、細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)、細(xì)胞因子表達(dá)水平及信號(hào)通路的激活[4,9]。但是，不同毒株感染對(duì)趨化因子表達(dá)量的影響是否存在差異尚不清楚，為了進(jìn)一步了解不同毒力毒株感染后對(duì)CCL19及其受體基因表達(dá)水平的影響，本試驗(yàn)選取IBDV經(jīng)典毒株CJ801株和新鄉(xiāng)本地分離毒株HN-1株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，比較分析CCL19及其受體CCR7基因表達(dá)情況，以期為后續(xù)的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 IBDV CJ801株，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所劉爵研究員饋贈(zèng)；IBDV HN-1株，由本實(shí)驗(yàn)室自新鄉(xiāng)本地病禽體內(nèi)分離獲得。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF種蛋，購(gòu)自北京梅里亞維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，孵化后于隔離器中飼養(yǎng)，21日齡進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

1.1.3 試劑 總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自O(shè)mega公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自Promega公司；Real Master Mix (SYBR Green I)，購(gòu)自Invitrogen公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 將53只SPF雞隨機(jī)分成3個(gè)組，分別為HN-1感染組、CJ801感染組和對(duì)照組，感染組每組20只，對(duì)照組13只。分別通過(guò)點(diǎn)眼、滴鼻的方式感染，按103EID50/0.1 mL的劑量，給予感染組每只雞0.2 mL IBDV病毒液，對(duì)照組每只雞以同樣方式給予0.2 mL PBS。不同組雞只分別飼養(yǎng)在不同的隔離器中，自由飲水、進(jìn)食，光照、黑夜各12 h。在病毒感染后第1、3、5天和第7天，每組隨機(jī)挑選3只雞，麻醉致死，收集法氏囊備用。

1.2.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 分別取感染組和對(duì)照組雞的法氏囊組織，經(jīng)液氮研磨后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已登錄IBDVVP2、禽源CCL19和CCR7基因序列，分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物，同時(shí)針對(duì)β-actin基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)。所設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4VP2基因PCR擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用VP2基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外照射下觀察條帶并拍照。

1.2.5 序列比對(duì)分析 PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的HN-1株IBDVVP2片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用DNASTAR 5.0軟件，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的不同毒力IBDV毒株(表2)的VP2基因序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA軟件做進(jìn)化分析。

1.2.6 qPCR檢測(cè) qPCR使用SYBR Green Master Mix試劑盒，在7500 Real-time PCR儀中進(jìn)行。qPCR程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。qPCR以β-actin為內(nèi)參基因。所有樣品重復(fù)3次確保擴(kuò)增重復(fù)性。使用2-ΔΔCt方法對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)含量計(jì)算。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 執(zhí)行t檢驗(yàn)分析，利用 Graphpad Prism 7.0 軟件對(duì)處理數(shù)據(jù)生成圖片和分析，將對(duì)照組基因表達(dá)水平設(shè)置為1，評(píng)價(jià)感染組目的基因表達(dá)水平。結(jié)果記為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，P<0. 05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0. 05 表示差異不顯著。

表2 比對(duì)和進(jìn)化分析所用參考序列Table 2 Reference strains used in the sequence alignment and phylogenetic analysis

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 感染組SPF雞攻毒后自第1天開(kāi)始便出現(xiàn)精神沉郁癥狀，隨著時(shí)間的推移，CJ801感染組和HN-1感染組雞只均出現(xiàn)羽毛蓬亂、腹瀉等癥狀。2個(gè)感染組剖檢癥狀無(wú)明顯差異，均可見(jiàn)胸肌、腿肌的明顯出血，法氏囊呈明顯的“紫葡萄”狀(圖1)；但與CJ801感染組相比，HN-1感染組雞只死亡時(shí)間稍延后，感染后期可見(jiàn)胸腺?lài)?yán)重萎縮。對(duì)照組無(wú)明顯臨床癥狀，剖檢未見(jiàn)明顯病理變化。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，感染組SPF雞成功感染IBDV。

圖1 IBDV攻毒SPF雞引起的病理變化Fig.1 Macroscopic lesions in SPF chicken after inoculation with IBDVA: 感染組雞法氏囊； B: 對(duì)照組雞法氏囊； C:感染組腿肌和胸??； D:對(duì)照組腿肌和胸肌A: Bursal tissues from infection group SPF chicken; B: Bursal tissues from control group SPF chicken; C: Leg muscles and chest muscles from infection group SPF chicken; D: Leg muscles and chest muscles from control group SPF chicken

2.2VP2基因PCR擴(kuò)增 為了進(jìn)一步證實(shí)攻毒試驗(yàn)成功，分別取感染組和對(duì)照組雞只法氏囊樣品，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，對(duì)IBDV的VP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，無(wú)論是CJ801感染組還是HN-1感染組，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小均與預(yù)期大小一致，對(duì)照組未見(jiàn)明顯條帶。

圖2 VP2片段的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of VP2 geneM:DL2 000 Marker； 1:對(duì)照組； 2:CJ801感染組； 3:HN-1感染組M:DL2 000 Marker; 1:Control group; 2:CJ801 infection group; 3:HN-1 infection group

2.3 序列比對(duì)分析 擴(kuò)增的VP2片段測(cè)序后經(jīng)BLAST分析，與GenBank上登錄的IBDVVP2基因序列一致，進(jìn)一步證實(shí)本次感染成功。為進(jìn)一步了解本地分離株HN-1的進(jìn)化關(guān)系及其與CJ801株之間的遺傳距離，使用測(cè)得的HN-1VP2基因序列與GenBank上登錄的不同毒力IBDV毒株VP2基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，HN-1株VP2基因序列與UK661、Harbin-1、OKYM、D6948等超強(qiáng)毒株VP2基因序列高度同源，而與CJ801株的VP2基因序列不在同一個(gè)小分支上(圖3)。

圖3 CJ801株和HN-1株IBDV VP2序列進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of VP2 nucleotide sequences from IBDV CJ801 strain and HN-1 strain●：本試驗(yàn)毒株●：Strains in this study

2.4 感染早期法氏囊組織中CCL19基因表達(dá) 分別取感染組和對(duì)照組雞法氏囊組織，液氮研磨后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)IBDV不同毒株對(duì)雞T細(xì)胞趨化因子CCL19基因表達(dá)量的影響。結(jié)果如圖4和圖5所示，盡管CJ801株感染雞CCL19基因的表達(dá)要早于HN-1株，達(dá)到最高峰的時(shí)間也早于HN-1株，但感染后，無(wú)論是CJ801組，還是HN-1組，CCL19基因的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。

圖4 CJ801株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCL19 mRNA的表達(dá)Fig.4 Chicken bursal CCL19 mRNA expression levels after infection with IBDV CJ801 strain與對(duì)照組相比，*：P<0.05,**：P<0.01； 下圖同Compared with the control group,*：P<0.05,**：P<0.01. The same as below

圖5 HN-1株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCL19 mRNA的表達(dá)Fig.5 Chicken bursal CCL19 mRNA expression levels after infection with IBDV HN-1 strain

2.5 感染早期法氏囊組織中CCR7基因表達(dá)CCR7基因的qPCR檢測(cè)結(jié)果與CCL19基因呈一致的趨勢(shì)(圖6、圖7)。感染早期，CCR7基因的表達(dá)量明顯升高，HN-1株感染雞CCR7基因的表達(dá)和達(dá)到高峰的時(shí)間均晚于CJ801株。但感染后，2個(gè)感染組CCR7的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。

圖6 CJ801株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCR 7 mRNA的表達(dá)Fig.6 Chicken bursal CCR 7 mRNA expression levels after infection with IBDV CJ801 strain

圖7 HN-1株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCR 7 mRNA的表達(dá)Fig.7 Chicken bursal CCR 7 mRNA expression levels after infection with IBDV HN-1 strain

3 討論

IBDV主要侵襲雞法氏囊組織，破壞其中樞免疫器官法氏囊，導(dǎo)致雞的免疫反應(yīng)性降低，長(zhǎng)期處于免疫抑制狀態(tài)，因此，IBD也被稱(chēng)為雞的“艾滋病”，當(dāng)合并其他細(xì)菌或病毒感染時(shí)，極易造成雞只的死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。有研究顯示，當(dāng)IBDV侵染法氏囊組織后，IBDV在法氏囊內(nèi)大量增殖，造成B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞損傷[4,10]，T細(xì)胞滲入，最終導(dǎo)致法氏囊組織中T細(xì)胞達(dá)到65%，而B(niǎo)細(xì)胞僅占7%[3]。浸潤(rùn)法氏囊的T細(xì)胞活化后，釋放Th1細(xì)胞因子IFN-γ，發(fā)揮抗病毒作用；同時(shí)上調(diào)促炎因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，損傷法氏囊，延緩組織修復(fù)。升高的CD4+CD25+T細(xì)胞還可能參與IBDV誘導(dǎo)的免疫抑制[6]，而IBDV誘導(dǎo)的免疫損傷也與法氏囊的炎癥、凋亡和炎性細(xì)胞因子失衡有關(guān)[11]。通常認(rèn)為，趨化因子與受體結(jié)合參與了T細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)作用[12-14]。

在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典毒株CJ801感染SPF雞后，感染組法氏囊樣品與對(duì)照組樣品差異表達(dá)基因很多。在感染早期，許多與免疫相關(guān)的基因，如炎性反應(yīng)基因、抗病毒相關(guān)基因等，表達(dá)水平明顯升高。在炎性反應(yīng)相關(guān)基因中，趨化因子往往通過(guò)趨化免疫細(xì)胞，參與人和動(dòng)物許多疾病進(jìn)程。在對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果分析過(guò)程中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL19及其受體CCR7的表達(dá)量變化比較明顯，推測(cè)CCL19及其受體的相互作用可能在T細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。進(jìn)一步的研究結(jié)果也證實(shí)，CCL19是T細(xì)胞遷移至法氏囊的主要驅(qū)動(dòng)力[15]。但是這個(gè)結(jié)果是否具有代表性？不同毒株感染后，趨化因子CCL19及其受體的變化趨勢(shì)是否相同？從本試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，無(wú)論是經(jīng)典毒株CJ801還是本地分離毒株HN-1，感染后，盡管引起趨化因子CCL19及其受體CCR7基因表達(dá)量達(dá)到最高的時(shí)間有所差異，但二者都能夠引起趨化因子CCL19及其受體CCR7基因表達(dá)量的明顯上升。但是本試驗(yàn)也觀察到一個(gè)奇怪現(xiàn)象：進(jìn)化分析的結(jié)果顯示，本地分離毒株HN-1株VP2基因序列與UK661、Harbin-1、OKYM、D6948等超強(qiáng)毒株VP2基因序列高度同源，而與CJ801株VP2基因序列進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)化分析結(jié)果表明HN-1株與CJ801株毒力上存在一定的差異，但感染試驗(yàn)的結(jié)果表明二者毒力相近；HN-1感染后趨化因子CCL19及其受體CCR7表達(dá)量的升高要晚于CJ801株，持續(xù)時(shí)間也偏長(zhǎng)。VP2是IBDV的主要保護(hù)性抗原基因，其高變區(qū)通常能夠影響毒株的毒力，因此，許多學(xué)者將其作為分子流行病學(xué)和進(jìn)化研究的指標(biāo)[16-17]。本試驗(yàn)也選取了VP2基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析，但從分析結(jié)果和感染試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)來(lái)看，僅使用VP2基因來(lái)做進(jìn)化分析是不夠的。前期研究中，對(duì)本地分離株HN-1的B片段進(jìn)行了比對(duì)分析，顯示其B片段與超強(qiáng)毒株存在較大差異，與一些重組毒株具有近的親緣關(guān)系[18]。這些結(jié)果提示B片段的來(lái)源在一定程度上影響了HN-1株的毒力，Lu等[19]、Gao等[20]和Abou El-Fetouh等[21]學(xué)者的研究結(jié)果，均證實(shí)了IBDV B片段對(duì)其毒力具有一定的貢獻(xiàn)。因此，推測(cè)是由于重組造成毒株的毒力下降，出現(xiàn)了上述情況。

本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，不同毒力IBDV毒株感染均能引起趨化因子CCL19及其受體CCR7基因表達(dá)呈一定程度的升高，而IBDV毒株毒力強(qiáng)弱也能夠影響CCL19和CCR7基因表達(dá)變化趨勢(shì)。這為進(jìn)一步探究是否可以通過(guò)調(diào)控CCL19或CCR7基因表達(dá)水平，減輕IBDV感染后細(xì)胞因子風(fēng)暴對(duì)法氏囊組織的影響提供了數(shù)據(jù)支撐。