脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激及自噬的影響

張 衍，陳長福，劉鼎闊，李 存，湯樹生，李道穩(wěn),

[1. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 西青 300384 ；2. 龍巖市動物疫病預(yù)防控制中心，福建 龍巖 364000 ； 3. 鼎正新興生物技術(shù)(天津)有限公司 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點實驗室，天津 西青 300383 ； 4. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193]

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)屬于B型單端孢霉烯族化合物，在各種谷物中經(jīng)常被檢出，由食品中存在的鐮刀菌、漆斑菌、頭孢霉菌和葡萄穗霉菌產(chǎn)生，對人和動物有廣泛毒性。畜禽DON中毒后的主要臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、胃腸炎癥、腹瀉和腸道菌群紊亂等。AKT/mTOR信號通路屬于自噬負(fù)調(diào)控的經(jīng)典途徑之一[1]。有研究證實，自噬抑制劑3-MA和PI3K激活劑740Y-P可以顯著提高DON所損傷細(xì)胞的活性，有效恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)，維持正常細(xì)胞形態(tài)，抑制DON誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，表明DON誘導(dǎo)的自噬是細(xì)胞凋亡所必需的，對其進(jìn)行抑制可減少DON誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞凋亡，且DON可以通過抑制AKT/mTOR信號通路觸發(fā)細(xì)胞凋亡和自噬[2]。另外，DON可通過降低抗氧化酶活性、增加細(xì)胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[3]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是DON引起肝毒性、免疫毒性、腸道毒性和遺傳毒性的可能機(jī)制。有研究表明，DON誘導(dǎo)的ROS積聚在最初階段會導(dǎo)致肝臟損傷，但Nrf2/HO-1相關(guān)通路的激活促進(jìn)了ROS的清除，降低了氧化應(yīng)激水平，并保護(hù)了肝臟免受更嚴(yán)重的損傷[4]。

本試驗選擇小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)作為體外模型，分析DON對RAW264.7細(xì)胞的毒性作用及其作用機(jī)制，測定DON對細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞自噬的影響，初步探討DON對細(xì)胞免疫毒性的作用機(jī)理，以期為進(jìn)一步研究DON的免疫毒性以及探究毒性抑制試劑并制定科學(xué)合理的谷物毒素污染防治措施提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 DON標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海阿拉丁公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶，均購自美國Gibco公司；活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒、小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、β-actin抗體、二抗，均購自上海碧云天生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，均為南京建成生物研究所產(chǎn)品；Nrf2、HO-1抗體，均購自Proteintech生物公司；AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3B抗體，均購自美國Abcam公司。酶標(biāo)儀、Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像儀，均購自美國Bio-Rad公司；CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自德國BINDER公司；RVL-100-G正倒置一體熒光顯微鏡，購自美國ECHO公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，匯合度達(dá)到80%左右時傳代，吸棄舊液，PBS輕柔洗2次，均勻滴加少量胰酶，室溫消化30 s后加適量DMEM培養(yǎng)全液終止消化，輕輕吹下貼壁細(xì)胞，按適當(dāng)比例將細(xì)胞接種于新皿，放入37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 分組及處理 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞按5×104個/孔的細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別加入終濃度為0、100、200、400、800 ng/mL和1 600 ng/mL的DON毒素作為對照組和試驗組，另設(shè)無細(xì)胞無DON的空白組。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄。

1.5 細(xì)胞活性檢測 將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)DON毒素處理后，分別在孵育6、12 h和24 h后取出96孔板，每孔加100 μL 10% CCK-8溶液，培養(yǎng)箱避光孵育1 h，酶標(biāo)儀于450 nm處測吸光度值，按照公式計算細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測 按照試劑盒說明書進(jìn)行，取6 μL DCFH-DA原液和6 mL培養(yǎng)液混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后，棄去舊液，PBS洗2次，每孔加入1 mL DCFH-DA染色液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光放置30 min，取出后PBS清洗3次，使用熒光顯微鏡于綠色熒光通道觀察活性氧水平。

1.7 氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測 將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，加入DON毒素處理24 h。用無菌細(xì)胞刮板輕輕收集細(xì)胞，低速離心后保留沉淀，加少量PBS重懸細(xì)胞，用手持式勻漿機(jī)破碎離心管中的細(xì)胞，BCA法測蛋白濃度。按照試劑盒說明書檢測破碎的細(xì)胞液中MDA和GSH的含量、SOD的活性水平。

1.8 線粒體膜電位檢測 將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后，按照試劑盒說明書加入JC-1染色工作液和新鮮培養(yǎng)液，混勻后避光孵育20 min，預(yù)冷的染色緩沖液清洗2次，加入適量培養(yǎng)液并置于熒光顯微鏡下觀察紅色或綠色熒光表達(dá)。

1.9 Western blot檢測氧化應(yīng)激和自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后，加入適量RIPA裂解液，4 ℃、1 000 g離心10 min提取蛋白。用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度，按照30 μg蛋白上樣量計算相應(yīng)的上樣體積。蛋白加樣至10%～15%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，待分離出所需條帶后停止電泳，并將條帶轉(zhuǎn)印至0.45 μm PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗5 min，重復(fù)3次，蛋白膜放入一抗(AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3B、Nrf2、HO-1、β-actin)中4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次后放入相應(yīng)種屬的二抗中室溫孵育2 h，TBST清洗后滴加適量ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀采集蛋白條帶圖像并用Image J分析蛋白灰度值。

1.10 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)的差異性比較采用SPSS軟件中的單因素方差分析，并用GraphPad Prism軟件繪圖，P<0.05表示兩組間差異顯著，P<0.01表示兩組間差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 DON毒素對RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果如圖1所示，對照組的RAW264.7細(xì)胞均勻貼壁生長，外觀呈圓顆粒形，邊緣清晰，排列密集，基本無漂浮細(xì)胞，細(xì)胞密度較高；經(jīng)梯度濃度的DON毒素處理后，隨著DON的濃度增加，細(xì)胞的間隙逐漸增大，數(shù)量變少，且細(xì)胞的貼壁能力也逐漸下降，800 ng/mL和1 600 ng/mL濃度的DON處理后無活性的懸浮細(xì)胞明顯增多。

圖1 顯微鏡觀察RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的變化(100×)Fig.1 Microscopic observation of morphological changes of RAW264.7 cells (100×)A：對照組; B：100 ng/mL DON; C：200 ng/mL DON; D：400 ng/mL DON; E：800 ng/mL DON; F：1 600 ng/mL DONA：Control group; B：100 ng/mL DON; C：200 ng/mL DON; D：400 ng/mL DON; E：800 ng/mL DON; F：1 600 ng/mL DON

2.2 DON毒素對RAW264.7細(xì)胞活性的影響 CCK-8試驗結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞活性隨DON毒素濃度遞增而逐漸降低，并隨DON處理時間的延長而降低；DON毒素濃度從100 ng/mL增加到1 600 ng/mL時，處理6 h的細(xì)胞存活率從92.63%降至59.62%，計算6 h的半抑制濃度(IC50)為2 100 ng/mL，處理12 h的細(xì)胞存活率從89.47%降至54.19%，計算12 h的IC50為1 800 ng/mL，處理24 h的細(xì)胞存活率從88.49%降至38.57%，計算24 h的IC50為860 ng/mL。由此可知，DON毒素可抑制RAW264.7細(xì)胞增殖，并呈時間和劑量依賴性，對RAW264.7細(xì)胞有明顯的毒性作用。

圖2 DON誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞毒性Fig.2 Cytotoxicity induced by DON in RAW264.7 cells與對照組相比，*:P<0.05，**:P<0.01; 下同Compared with the control group,*:P<0.05,**:P<0.01. The same as below

2.3 DON毒素對RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 DCFH-DA染色結(jié)果如圖3A所示，對照組細(xì)胞的綠色熒光點較少，而DON高劑量(800 ng/mL和1 600 ng/mL)時的綠色熒光點較為密集；且與對照組相比，DON處理后的綠色熒光強(qiáng)度會隨著DON濃度的遞增而逐漸增強(qiáng)，表明DON可誘導(dǎo)細(xì)胞的ROS產(chǎn)生水平增加，呈劑量依賴性。氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測結(jié)果如圖3B～3D所示，與對照組相比，隨著DON濃度遞增，細(xì)胞中SOD的活性和GSH的含量呈極顯著減少趨勢(P<0.01)，MDA的含量在DON 400 ng/mL濃度處開始極顯著遞增(P<0.01)。表明DON毒素處理可導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化水平降低，脂質(zhì)氧化水平升高，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷。

圖3 DON誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激Fig.3 Oxidative stress induced by DON in RAW264.7 cellsA:ROS水平(100×); B:SOD活性; C:GSH含量; D:MDA含量A:ROS level(100×); B:SOD activity; C:GSH content; D:MDA content

2.4 DON毒素對RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響 DON毒素處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，線粒體膜電位的變化結(jié)果見圖4，隨著DON毒素處理濃度的遞增，線粒體膜電位發(fā)生變化：細(xì)胞中代表低電位的綠色熒光逐漸增多，在1 600 ng/mL DON濃度時達(dá)到最高；而代表高電位的紅色熒光比例逐漸減少，在1 600 ng/mL DON濃度時近乎消失。結(jié)果表明，經(jīng)DON毒素處理后的RAW264.7細(xì)胞的線粒體膜電位呈劑量依賴性逐漸降低，線粒體功能發(fā)生異常。

2.5 DON對氧化應(yīng)激和自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 氧化應(yīng)激通路蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5A所示，與對照組相比，隨著DON毒素濃度增加，HO-1蛋白相對表達(dá)量在400 ng/mL DON處理時極顯著升高(P<0.01)，后逐漸降低(P<0.01)(圖5B)；Nrf2蛋白相對表達(dá)量在800 ng/mL DON處理時達(dá)到最高值，與對照組相比極顯著升高(P<0.01)(圖5C)。自噬通路蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5D所示，與對照組相比，隨著DON毒素濃度遞增，LC3II/LC3I的比值在400 ng/mL DON處理時極顯著升高(P<0.01)，后逐漸下降(圖5E)；Beclin-1相對表達(dá)量呈劑量依賴性上升，在1 600 ng/mL DON處理時達(dá)到最高值(圖5F)；p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的相對表達(dá)量均隨DON濃度增加而減少，p-AKT/AKT在800 ng/mL和1 600 ng/mL DON處理時極顯著低于對照組(P<0.01)，p-mTOR/mTOR在400、800 ng/mL和1 600 ng/mL DON處理時極顯著低于對照組(P<0.01)(圖5G、5H)。結(jié)果表明，DON可通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生自噬并誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

圖4 DON誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位失調(diào)(200×)Fig.4 Mitochondrial membrane potential disorder induced by DON in RAW264.7 cells (200×)A：對照組； B：100 ng/mL DON； C：200 ng/mL DON； D：400 ng/mL DON； E：800 ng/mL DON； F：1 600 ng/mL DON；紅色熒光：JC-1聚合物； 綠色熒光：JC-1單體A：Control group； B：100 ng/mL DON； C：200 ng/mL DON； D：400 ng/mL DON； E：800 ng/mL DON； F：1 600 ng/mL DON； Red fluorescence:JC-1 aggregates; Green fluorescence:JC-1 monomer

圖5 DON對氧化應(yīng)激和自噬通路相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effects of DON on proteins related to oxidative stress and autophagic pathwayA：Western blot檢測氧化應(yīng)激通路蛋白表達(dá)； B：HO-1； C：Nrf2； D：Western blot檢測自噬通路蛋白表達(dá)； E：LC3II/LC3I； F：Beclin-1； G：p-AKT/AKT; H：p-mTOR/mTOR A:Western blot was used to detect the expression of oxidative stress pathway; B:HO-1; C:Nrf2; D:Western blot was used to detect the expression of autophagy pathway; E:LC3II/LC3I; F:Beclin-1; G:p-AKT/AKT; H:p-mTOR/mTOR

3 討論

本試驗使用RAW264.7細(xì)胞為體外試驗?zāi)Ｐ?，研究DON對單核巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。不同濃度的DON處理細(xì)胞后，隨著毒素濃度的增加，細(xì)胞排列稀疏，貼壁能力下降。CCK-8法檢測細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示，DON顯著抑制細(xì)胞增殖，有明顯毒性作用。線粒體是ATP合成、信號傳遞、代謝以及細(xì)胞因子產(chǎn)生所必需的重要細(xì)胞器[5]，其狀態(tài)與細(xì)胞代謝關(guān)系緊密。線粒體可以產(chǎn)生活性氧，是活性氧的靶位點，同時線粒體的膜電位也與細(xì)胞凋亡有關(guān)聯(lián)[6]。線粒體途徑引起的細(xì)胞凋亡主要是由于凋亡信號刺激引起蛋白質(zhì)、基因和線粒體膜通透性發(fā)生改變。有研究證明，DON染毒可誘導(dǎo)豬脾淋巴細(xì)胞ROS升高，并削弱線粒體融合，表明線粒體損傷與ROS的產(chǎn)生是相互關(guān)聯(lián)的，線粒體受損可導(dǎo)致ROS增多[7]。

單端孢霉烯族毒素可以誘導(dǎo)ROS的過量積累，增加脂質(zhì)過氧化程度，改變細(xì)胞膜和抗氧化系統(tǒng)的完整性[8]。細(xì)胞抗氧化能力下降和ROS含量增加是細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要原因。細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和還原型谷胱甘肽(GSH)[9]。有研究表明，ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)可顯著降低DON暴露引起的細(xì)胞ROS積聚，并減少細(xì)胞凋亡，表明DON通過促進(jìn)ROS過量產(chǎn)生而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的損傷[10]。Habrowska-Górczyńska等[11]證明，DON(2～5 μmol/L)會導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，SOD抗氧化活性降低，與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)信號通路相關(guān)的基因表達(dá)顯著增加。同樣，DON在雞的氧化應(yīng)激過程中可調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)，并在抑制癌細(xì)胞生長的過程中結(jié)構(gòu)性地調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)[12]。本試驗結(jié)果顯示，DON可顯著降低RAW264.7細(xì)胞中SOD的活性和GSH的含量，顯著增加脂質(zhì)氧化物MDA的含量；顯著增加ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激；顯著降低線粒體膜電位，表明DON可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷和線粒體損傷?？寡趸﨨rf2/ARE可驅(qū)動抗氧化物[包括血紅素加氧酶-1(HO-1)、SOD、GSH等]的表達(dá)調(diào)控，以減輕氧化應(yīng)激造成的損害。ROS的積累會導(dǎo)致Nrf2的釋放，釋放的Nrf2移位到細(xì)胞核中并與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合[13]。而Nrf2/ARE通路下游的抗氧化基因HO-1可被Nrf2激活，將血紅素分解為膽綠素，膽綠素可被還原酶轉(zhuǎn)化為具有抗氧化活性的膽紅素。DON可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，Nrf2從KEAP-1解離，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核后，上調(diào)了HO-1的表達(dá)，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[14]。本試驗結(jié)果顯示，DON染毒RAW264.7細(xì)胞可隨梯度濃度上調(diào)HO-1和Nrf2的蛋白表達(dá)，并分別在DON濃度大于400 ng/mL和800 ng/mL后逐漸下調(diào)，推測可能原因為氧化應(yīng)激激活后機(jī)體活性氧過量積累，到達(dá)一定閾值后負(fù)向調(diào)控Nrf2/HO-1通路。有研究發(fā)現(xiàn)，HO-1激活劑氯化血紅素(Hemin)在早期階段可上調(diào)細(xì)胞的抗氧化能力，但隨著DON處理時間的延長，這種能力受到抑制[15]。這意味著盡管HO-1的表達(dá)對氧化損傷具有保護(hù)作用，但可能存在一個限值，超過這個限值，HO-1的表達(dá)就會變得有害并可能引發(fā)氧化損傷[16]。

AKT/mTOR信號通路是自噬過程中重要的調(diào)節(jié)因子[17]，它可以介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)[18]。有研究表明，刀豆球蛋白A可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬，導(dǎo)致AKT磷酸化蛋白表達(dá)降低[19]。為了進(jìn)一步研究AKT/mTOR通路在DON誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬中的作用，本試驗檢測了自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著DON濃度的增加，AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平呈下降趨勢，在800 ng/mL DON時達(dá)到最低，表明AKT/mTOR信號通路在DON誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬中處于被抑制狀態(tài)，本結(jié)果與Wang等[20]的結(jié)果相似。LC3包含LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。在自噬的誘導(dǎo)下，LC3從細(xì)胞核移位到胞漿與自噬小體結(jié)合，隨后LC3前體被剪切形成LC3-Ⅰ，后與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ[21]。由于LC3在自噬體膜中含量豐富，因此被當(dāng)作自噬的標(biāo)志物[22]。Han等[23]在DON誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞自噬和凋亡的研究中觀察到自噬空泡和自噬小體增多時，LC3的mRNA表達(dá)也隨之增強(qiáng)。Beclin-1是細(xì)胞自噬過程中至關(guān)重要的蛋白分子，可誘導(dǎo)自噬體膜形成，促進(jìn)自噬體的成熟，從而調(diào)控自噬[24]。本試驗結(jié)果顯示，隨著DON濃度的增加，LC3II/I的比值和Beclin-1表達(dá)水平逐漸升高，表明DON可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

綜上所述，DON可抑制RAW264.7細(xì)胞活性，刺激細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS，激活Nrf2/HO-1通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)上升，并抑制抗氧化物活性，脂質(zhì)氧化物增多。ROS的積聚可破壞線粒體功能，使線粒體膜電位降低。另外，自噬蛋白LC3II/I、Beclin-1表達(dá)增多，AKT、mTOR磷酸化減少，表明DON可通過抑制AKT/mTOR通路誘導(dǎo)自噬。本試驗可為后續(xù)研究DON誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激與自噬之間串聯(lián)互擾作用及DON免疫毒性的相關(guān)研究提供一定參考。