乙型肝炎病毒與線粒體的相互作用及其對肝細胞癌進化的影響

朱小瓊 劉文斌 趙沛 林劍生 王瑞華 余紅平 趙存喜 曹廣文

作者單位：230032 合肥 1安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系；200433 上海 2海軍軍醫(yī)大學海醫(yī)系流行病學教研室；530021 南寧 3廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院；510632 廣州 4暨南大學流行病學教研室

原發(fā)性肝癌是全球第六大新發(fā)惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第三大原因[1]。原發(fā)性肝癌包括肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內膽管癌以及其他少見類型[1]。在我國87.5%的HCC患者可能是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染導致[2]。HBV主要通過誘導宿主基因突變、改變信號通路和病毒蛋白與宿主蛋白相互作用等途徑引發(fā)HCC[3-6]。能量代謝模式的重塑是癌變的重要環(huán)節(jié)，而線粒體是有氧氧化呼吸的核心細胞器，在代謝模式由有氧氧化呼吸為主轉化為有氧糖酵解為主的過程中，線粒體功能如何重塑尚未知。目前大量研究提示，HBV與線粒體的相互作用及HBV引發(fā)的能量代謝改變對HCC發(fā)生發(fā)展的影響不容忽視[7-8]。本文就HBV與線粒體的相互作用及其對HCC進化影響的研究進展作一綜述。

1 HBV和線粒體的基本結構

HBV是一種部分雙鏈DNA反轉錄病毒，包含1個3.2 kb的基因組，被二十面體核衣殼和包膜包裹。進入宿主細胞后，HBV通過pgRNA（pre-genomic RNA）反轉錄出病毒基因組DNA。HBV基因組編碼4個重疊的開放閱讀框，分別為preS-S、preC-C、P和X，這4個基因組編碼7種不同的蛋白質，這些蛋白包括HBsAg（分為大、中、小3種形式）、HBcAg、HBeAg、HBV聚合酶和HBV X蛋白（HBV X protein，HBx）[9]。

線粒體由外膜、膜間隙、內膜和基質等4個部分組成。線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）控制外 膜 的滲透性[10]。線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）定位在線粒體外膜上，在先天免疫信號調控中發(fā)揮重要作用[11]。線粒體內膜折疊成嵴以增大內膜表面積，內附細胞色素氧化酶參與氧化磷酸化反應并控制線粒體的分裂和融合。線粒體基質含有參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化等生化反應的酶、線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）、RNA、核糖體等。mtDNA是16.6 kb的雙鏈圓形DNA，編碼22個轉移RNA、2個核糖體RNA和13個組成呼吸酶復合物的基因[12]。mtDNA還包含1個非編碼區(qū)域稱為D-loop區(qū)，可控制mtDNA的復制和轉錄[13]。線粒體相關蛋白主要由核DNA編碼并從細胞質轉移到線粒體中發(fā)揮功能。

2 HBV引起的能量代謝改變?yōu)镠CC生長提供適宜的能量環(huán)境

腫瘤細胞的能量供應遵循Warburg效應，即在氧含量正常的情況下，腫瘤細胞仍主要通過糖酵解供能[14]。線粒體是能量代謝的主要場所，關鍵代謝酶的表達調控可決定代謝反應的速度和方向?，F(xiàn)有證據(jù)顯示，HBV可上調己糖激酶（hexokinase，HK）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）和煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）的表達，還可下調丙酮酸激酶（pyruvate kinase isoform，PK）M2亞型活性，從而影響代謝模式，使細胞的能量供應逐漸向Warburg效應方向轉變，為HCC的生長提供適宜的能量環(huán)境[15-19]。HK負責將進入細胞的葡萄糖不可逆地轉化為葡萄糖-6-磷酸，這也是葡萄糖進入糖酵解途徑的第一步。HK有HK1、HK2、HK3、HK4四種亞型。HK4在正常肝臟中高表達，而HK2在HCC中高表達[20]。感染HBV的細胞，HK2表達上調，其葡萄糖攝取能力增強[15]。糖酵解的最后一步由PK介導，而PK有PKL、PKR、PKM1和PKM2四種亞型。PK催化一個磷酸基從磷酸烯醇式丙酮酸轉移到腺嘌呤核苷二磷酸，并產(chǎn)生丙酮酸和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。親和純化實驗發(fā)現(xiàn)，HBsAg可與PKM2結合從而降低其活性[18]。但HBsAg能否在生理條件下通過與PKM2結合從而改變代謝途徑仍未知。PKM2在HCC代謝改變和腫瘤發(fā)生中的作用也尚存爭議。多項研究顯示，HCC和肝硬化患者中PKM2的表達水平上調，PKM2激酶活性也增強，且與不良預后相關[21-22]。但是，動物實驗表明，PKM2敲除小鼠存在代謝失衡，包括高血糖、高胰島素血癥和肝脂肪變性，且最終會導致HCC的發(fā)生[23]。G6PD是磷酸戊糖途徑中的第一個限速酶，可將葡萄糖-6-磷酸轉化為6-磷酸葡萄糖內酯。有研究報道，G6PD在HCC組織中表達升高且與總生存率降低有關[24]。YIN等[25]研究顯示，G6PD表達升高增強了HCC細胞對奧沙利鉑的耐藥性，這與分化抑制蛋白1（inhibitor of differentiation 1，Id1）激活磷酸戊糖途徑有關。此外，缺氧條件下，G6PD的翻譯后修飾（糖基化作用）可誘導G6PD表達，促進腫瘤生長，并將磷酸戊糖途徑與己糖胺生物合成途徑連接起來[26]。HBx通過與轉錄因子NF-E2相關因子2（Nf-E2 related factor-2，Nrf2）的抑制劑Keap1結合，導致Nrf2活化，從而增強G6PD的轉錄，上調G6PD表達[16]。NAMPT是一種參與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide+，NAD+）生物合成的關鍵限速酶。NAMPT在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中表達上調[27-28]。由于腫瘤細胞對NAD+的高需求，抑制NAMPT表達可以顯著抑制腫瘤細胞增殖。目前研究顯示，特異性NAMPT抑制劑FK866、STF-118804分別在胃癌、HCC以及胰腺癌中表現(xiàn)出抗癌活性[29-31]。在HCC細胞中，F(xiàn)K866通過抑制NAMPT表達顯著降低細胞中NAD+和ATP含量，從而抑制HCC細胞侵襲與轉移[31]。HBV也可增強NAMPT的表達，而NAMPT的激活又反向促進HBV復制[17]。因此，HBV可能通過增強NAMPT的表達從而促進HCC細胞的侵襲與轉移。

轉錄組學和代謝組學研究顯示，HBV感染會引起廣泛的代謝圖譜改變，顯著促進糖酵解、磷酸戊糖和核苷酸生物合成等代謝途徑中代謝物的合成[32]。HCC中下調的代謝基因主要為參與脂肪酸和氨基酸代謝的相關基因，上調的代謝基因包括參與糖酵解、磷酸戊糖和核苷酸生物合成等代謝途徑相關基因[33]。此外，不同的代謝亞型還與HCC患者的預后有關，其中參與碳水化合物和核苷酸代謝基因表達上調以及參與脂質代謝基因表達下調與HCC患者的預后不良有關[34]。單細胞轉錄組測序分析顯示，HCC組織樣本中惡性細胞群顯示出線粒體功能障礙，且這些缺陷可導致線粒體應激，乳酸過度產(chǎn)生和較差的生存結局[35]。綜上，結合HBV調控的關鍵代謝酶所在的代謝途徑中的轉變，可以發(fā)現(xiàn)HBV誘導的代謝轉變與HCC的優(yōu)勢代謝方式高度一致。腫瘤細胞和病毒生長及復制過程中需要大量的ATP和核苷酸，HBV通過上調糖酵解、磷酸戊糖和核苷酸等代謝途徑滿足腫瘤快速增殖所需的能量微環(huán)境，為HCC的生長提供適宜環(huán)境，且會增加HCC惡性增殖和不良預后風險。

3 HBV通過調控線粒體自噬減少HCC細胞凋亡

線粒體自噬是一種選擇性降解過程，能清除受損線粒體以維持其穩(wěn)態(tài)。線粒體動力學是線粒體通過不斷的分裂和融合，維持線粒體形態(tài)、分布和數(shù)量的一種動態(tài)變化。線粒體自噬與線粒體動力學相互調控，共同維持線粒體質量平衡[36]。介導線粒體自噬的經(jīng)典信號通路主要有兩條，分別為PINK1/Parkin信號通路和線粒體受體依賴信號通路，其中BNIP3、BNIP3L以及FUNDC1作為定位于線粒體外膜上的受體信號，通過與LC3結合啟動線粒體自噬[37]。HBx在這兩條線粒體自噬信號通路中均發(fā)揮重要作用。有研究顯示，HBx通過上調動力相關蛋白1（dynaminrelated protein 1，Drp1）誘導線粒體動力學的融合-分裂平衡傾向于分裂轉變，促進PINK1/Parkin信號介導的線粒體自噬過程，選擇性清除受損線粒體，以維持HBV感染細胞中的線粒體穩(wěn)態(tài)[38]。CHI等[39]報道，甲狀腺激素保護肝細胞免受HBx的癌變誘導也是通過激活PINK1/Parkin信號通路實現(xiàn)，但是與上述文獻不同的是，甲狀腺激素是靶向清除肝細胞中存在HBx蛋白的線粒體，從而保護肝細胞免受HBx在癌變誘導中的關鍵作用。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，在剝奪了葡萄糖、丙酮酸、氨基酸和谷氨酰胺等營養(yǎng)物質的培養(yǎng)環(huán)境中，HBx通過下調LONP1提高PINK1/Parkin信號通路介導的線粒體自噬而減弱HCC細胞凋亡[40]。此外，HBx還可通過缺氧誘導因子-1α誘導BNIP3L介導的線粒體自噬[41]。

總之，以上研究表明，兩條介導線粒體自噬的經(jīng)典通路均受HBx調節(jié)，在病毒入侵、營養(yǎng)缺乏、缺氧等危害環(huán)境中，機體通過誘導線粒體自噬維持線粒體質量平衡。HBV通過調控線粒體自噬，保持細胞穩(wěn)態(tài)，減少HBV感染細胞和HCC細胞凋亡。HBV對線粒體自噬的調控路徑見圖1。

圖1 HBx對線粒體自噬的調節(jié)途徑Fig.1 The regulatory pathway of HBx on mitophagy

4 HBV通過調控線粒體膜電位反向激活HBV DNA復制

線粒體呼吸鏈位于線粒體內膜上，由5個復合物組成，電子通過這些呼吸酶傳遞[42]。電子轉移釋放的能量被用來泵送質子穿過線粒體內膜，從而建立一個電化學梯度并產(chǎn)生ATP，即線粒體膜電位。目前線粒體膜電位的降低已被證明對多種病理生理條件有影響，特別是細胞凋亡[43]。機體應對外來病原微生物和自身損傷時會引發(fā)炎癥反應，這些炎癥相關因子也會對線粒體膜電位產(chǎn)生影響。研究顯示，炎癥因子在HBV誘導的線粒體膜電位改變中發(fā)揮雙重作用，一方面，HBx與VDAC結合共定位于線粒體中，破壞氧化磷酸化進程，抑制ATP的產(chǎn)生從而使活性氧簇水平升高，進而激活STAT-3而造成線粒體跨膜電位降低[44-46]；另一方面，HBx通過激活NF-κB抑制HBx誘導的線粒體膜電位降低[47]。但是，目前有關HBV對線粒體膜電位影響的機制研究仍有限，炎癥因子在此過程中發(fā)揮的最終作用或不同情形下的調控機制仍需深入研究。

HBx還可以通過增強Bax蛋白向線粒體的易位，進而誘導線粒體膜電位的喪失而誘導細胞凋亡[48]。但是，HBx定位于細胞色素C氧化酶Ⅲ時不會造成線粒體膜電位的改變[49]。此外，HBx還會通過誘導線粒體膜通透性的轉變，使鈣離子從線粒體釋放到細胞質，激活細胞質鈣依賴的酪氨酸激酶，并最終激活HBV DNA的復制[50]。以上研究表明，HBx不僅可以通過線粒體相關蛋白誘導線粒體膜電位的轉變，還可以反向激活HBV自身復制（HBx對線粒體膜電位的調節(jié)途徑見圖2）。既往研究已證實，HBV慢性感染是HCC發(fā)生的重要危險因素，而抑制線粒體膜上的鈣信號傳導可阻斷HBV DNA復制[50]。因此，線粒體膜或可成為HBV治療的靶點，這為預防HCC的發(fā)生提供了新的方向。

圖2 HBx對線粒體膜電位的調節(jié)途徑Fig.2 The regulatory pathway of HBx on mitochondrial membrane potential

5 HBV抑制線粒體天然免疫為HCC發(fā)生發(fā)展提供適宜的免疫微環(huán)境

MAVS在天然免疫中的調節(jié)機制取決于其細胞內的不同定位。MAVS定位于線粒體外膜時，可以誘導干擾素（interferon，IFN）刺激基因穩(wěn)定表達[51-52]。有研究報道，天然免疫系統(tǒng)模式識別受體中Toll樣受體和RIG-I樣受體可識別入侵的病原體并將信號傳遞給MAVS，MAVS通過NF-κB和IRF3等信號傳遞分子，激活Ⅰ型和Ⅲ型IFN的表達，誘發(fā)細胞內抗感染天然免疫反應[53]。HBV也可以調節(jié)MAVS的表達而抑制抗病毒免疫反應。WEI等[54]報道，HBx通過泛素化降解MAVS，使HBV-HCC組織中的MAVS蛋白表達下調。HBV的pgRNA可被RIG-I感知并激活MAVS介導的多種IFN合成，但未顯著誘導IFN-β[55]。pgRNA激活線粒體天然免疫的路徑見圖3。深入研究發(fā)現(xiàn)，HBV誘導的Parkin能招募線性泛素組裝復合體（linear ubiquitin assembly complex，LUBAC）進入線粒體，通過LUBAC在MAVS上聚集無錨定的線性多泛素鏈，破壞MAVS信號體，減弱IRF3激活，從而阻斷IFN-β的合成[56]。WANG 等[57]報道，HBV聚合酶通過抑制TBK1和DDX3之間的相互作用來抑制RIG-I信號傳導并抑制IFN-β合成。值得注意的是，在以上研究中，Ⅰ型IFN的合成被顯著抑制，但Ⅲ型IFN表達是否受抑制仍未知。綜上可知，HBx不僅可以降低MAVS蛋白的表達，還能進一步抑制天然免疫信號通路傳導。人體天然免疫在病原體和異常癌細胞識別和清除中發(fā)揮著重要作用，抑制免疫作用也是HCC發(fā)生中不可或缺的一環(huán)，因此HBV通過抑制線粒體天然免疫能為HCC的發(fā)生發(fā)展提供適宜的免疫微環(huán)境。

圖3 pgRNA在線粒體天然免疫中的激活路徑Fig.3 Activation pathway of pgRNA in mitochondrial innate immunity

6 線粒體基因組損傷對HCC進化的影響

HCC及其配對正常組織的差異表達基因功能富集分析顯示，線粒體功能障礙與HCC發(fā)育顯著相關[58]。采用線粒體相關基因建立的預后預測模型不僅表現(xiàn)出良好的預后預測能力，而且還可用于預測HCC患者是否出現(xiàn)血管侵襲[59]。mtDNA突變在炎癥組織和癌癥組織中普遍存在，且主要集中在D-loop區(qū)。HBV-HCC組織中D-loop區(qū)突變的異質性水平相比配對癌旁組織顯著升高，且D-loop區(qū)突變多的患者mtDNA拷貝數(shù)顯著降低，同時復發(fā)風險增加[60]。多項研究也顯示，慢性HBV感染者中外周血白細胞和血清mtDNA拷貝數(shù)低者罹患HCC的風險顯著增加[61-63]。這些研究顯示，HBV促進D-loop區(qū)突變可能會減少mtDNA的復制并損害線粒體的正常功能，從而誘導HCC的發(fā)生，且增加HCC復發(fā)風險。此外，HBV誘導的線粒體自噬還會使大量mtDNA從線粒體基質釋放到細胞質中，刺激巨噬細胞誘導腫瘤壞死因子和白介素6等細胞因子，激活下游信號通路如JAK/STAT和NF-κB等，從而促進肝細胞過度增殖，最終導致HCC發(fā)生[64]。線粒體功能障礙還能通過誘導細胞核骨架聚集促進肝癌轉移[65]。此外，線粒體代謝功能障礙可能還與HCC患者耐藥有關，由代謝引起的抗腫瘤藥物耐藥性通常由幾個糖酵解通路的關鍵蛋白介導，如HK2、葡萄糖轉運蛋白1和PKM2[66]。同時還有研究指出，線粒體氧化還原代謝可重塑HCC對索拉非尼的藥物反應，線粒體生物發(fā)生減少是耐藥形成的重要環(huán)節(jié)之一[67]。因此認為，線粒體功能障礙可能在HCC的發(fā)生、復發(fā)、轉移和耐藥等方面均發(fā)揮重要的調控作用。

7 小結

目前研究顯示，HBV與線粒體相互作用并影響HCC進化，其中HBV可能通過對關鍵代謝酶和代謝基因的表達調控，使細胞的能量代謝向Warburg效應模式轉變；為了減少細胞凋亡，HBV通過調節(jié)線粒體動力學和線粒體自噬，維持線粒體質量平衡；HBV還能通過降低線粒體抗病毒信號蛋白的表達從而抑制天然免疫，為HCC發(fā)生發(fā)展提供適宜的免疫微環(huán)境；HBV還會誘導廣泛的線粒體基因組損傷從而促進HCC發(fā)展。然而關于HBV與線粒體相互作用及其對HCC進化的影響，目前的研究結果也尚存在矛盾之處，未來值得進一步深入研究闡明三者的關系。此外，鑒于代謝組學也廣泛應用于抗腫瘤研究中，未來通過分析不同HCC進展階段的差異代謝物，有望開發(fā)HCC精確分型的代謝標志物，同時由于HCC細胞中線粒體和代謝情況與正常細胞存在更顯著差異，因此靶向線粒體和代謝的藥物可能具有更好的特異性，未來可能成為HCC治療的新方向。