高產(chǎn)蜜香功能菌株在馥郁香型白酒中的應用研究

馮 亮，鄭曉衛(wèi)，，葉 力，夏 冰，梁宏運，陳曉園，吳新亮，楊 儒，孫玉婷

（1.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416000；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209）

馥郁香型白酒以五谷為原料，小曲和大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵、清蒸混入、陳釀、勾調(diào)而成，具有窖香、曲香、蜜香等復合香氣[1]，小曲的主要功效為糖化作用，與傳統(tǒng)小曲酒中小曲的功效一致。馥郁香型白酒工藝中使用的小曲，起主要糖化功能的菌株為米根霉，因此小曲也稱為根霉曲。據(jù)文獻報道，酒鬼酒使用的多糧糖化工藝，糖化效果最好，原料的出酒率最高[2]，根霉曲對基酒品質(zhì)有著十分重要的影響。然而，目前白酒行業(yè)使用的根霉曲存在菌株組成復雜、香氣不好、糖化力有待提高等問題[3]，阻礙了根霉曲在白酒釀造業(yè)的大規(guī)模應用和規(guī)?；a(chǎn)。因此，篩選高糖化力、發(fā)酵性能良好、典型風味突出的功能菌株，是穩(wěn)定白酒釀造工藝，提高產(chǎn)品品質(zhì)主要措施之一。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

原料、麩曲和糖化料，2020 年取自酒鬼酒股份有限公司；商業(yè)根霉曲，酒鬼酒股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及耗材

孟加拉紅瓊脂、馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均購自于北京奧博星生物技術有限責任公司；真菌DNA 基因組試劑盒購自于美國Omega Bio-Tek 公司；免疫親和柱購自于美國Romerlabs 公司；四甲基戊醇（純度為99 %）購自于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

孟加拉紅培養(yǎng)基：稱取36.6 g 孟加拉紅瓊脂，煮沸溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

PDB 培養(yǎng)基：稱取35 g馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，煮沸溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：稱取37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，煮沸溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

基礎培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min。

1.1.4 儀器設備

蔡司AxioLab.A1 生物顯微鏡，卡爾蔡司(上海)管理有限公司；S-4300N 掃描電鏡，日本日立公司；NanoDrop One 微量核酸蛋白分析儀，美國Thermo Fisher公司；Agilent 7890B氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器）、Agilent 1260 液相色譜（配熒光檢測器）、Agilent 8890-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；ME204 分析天平（感量為0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q 純水儀，美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 功能菌株篩選及鑒定

1.2.1.1 篩選

分別取原料、麩曲、糖化料（糖化時間0 h、5 h、18 h、24 h）粉碎后按照1∶9 溶于45 mL 無菌生理鹽水，室溫振蕩10 min，取上清液逐級稀釋制備梯度菌懸液，將各梯度菌懸液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3 d，隨機選取具有典型霉菌菌落特征的單菌落，劃線分離純化2～3次，直至平板上的菌落為同一形態(tài)，獲得單個純種菌落。

無菌條件下，挑1 環(huán)菌絲，接種于PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 后過濾，參考崔香香等[7]的分析方法，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（solid-phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法檢測揮發(fā)性風味物質(zhì)并進行感官評價。將菌株制備成麩曲后對其糖化力進行檢測，初步篩選糖化力較好且具有產(chǎn)蜜香能力的功能菌株。

1.2.1.2 鑒定

菌株形態(tài)學觀察：將經(jīng)活化的菌株用接種環(huán)劃線接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)特征，并用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察菌絲及其孢子形態(tài)特征。

分子生物學鑒定：使用真菌DNA 基因組試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，利用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 擴增基因組DNA。PCR 反應體系為50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs) (2.5 mmol/L) 4 μL，模板5 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，引物各1 μL，補充去離子水至50 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR 擴增產(chǎn)物使用1.0 %的瓊脂糖進行驗證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果在美國國家生物技術信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行相似性比對，采用Blast程序進行同源性序列分析。

1.2.1.3 性能及安全性評價

表型安全性評價：將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d 后，將培養(yǎng)基與培養(yǎng)物切碎，轉(zhuǎn)移至50 mL 無菌離心管中，加入30 mL 的80 %甲醇，超聲30 min，8000 r/min 離心20 min，取上清液，參考GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B 族和G 族的測定》[4]、GB 5009.240—2016《食品安全國家標準食品中伏馬毒素的測定》[5]及GB 5009.96—2016《食品安全國家標準 食品中赭曲霉毒素A的測定》[6]，使用免疫親和柱凈化高效液相色譜法對常見真菌毒素黃曲霉毒素B1、B2，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉素A進行檢測。

基因型安全性評價：對菌株進行全基因組測序，并通過KEGG、NR、GO 等多個數(shù)據(jù)庫進行比對，完成基因組預測及功能注釋，選取已發(fā)表的常見真菌毒素進行比對注釋，對相關生物信息進行分析。

1.2.2 功能菌株的生長條件優(yōu)化

1.2.2.1 生長條件單因素試驗

功能菌株于PDA 斜面活化后，用無菌水洗滌孢子，制成濃度為107～108個/mL 的孢子懸液，將其接種至基礎培養(yǎng)基中，考察不同培養(yǎng)條件對菌株生長的影響。首先采用單因素試驗考察培養(yǎng)基成分（碳源、氮源和無機鹽）對菌絲干重的影響，具體因素與水平見表1。

表1 單因素及其試驗水平

1.2.2.2 Plackett-Burman試驗

在確定碳源、氮源以及無機鹽種類的基礎上，選取影響菌絲干重的培養(yǎng)基成分（碳源、氮源和無機鹽）和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時間、pH 值、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速和溫度）共9 因子進行Plackett-Burman 試驗設計，篩選出對生長影響最大的幾個因素，本實驗選用N=12的Plackett-Burman實驗設計。以菌絲干重為試驗指標，評價各個參數(shù)對干重的影響，并篩選出主要因素。用Design-Expert 軟件進行數(shù)據(jù)處理，比較各因素的t值和可信度。

1.2.2.3 最陡爬坡試驗

依據(jù)Plackett-Burman 試驗獲得的回歸模型和試驗經(jīng)驗設定裝液量、酵母浸粉、纖維二糖3 個因素的步移方向和步長，其余條件按照單因素最優(yōu)值進行，以菌絲干重為評價指標，最終確定后續(xù)響應面試驗中的顯著因素范圍，確定試驗設計的中心點。

1.2.2.4 響應面試驗

在最陡爬坡試驗結(jié)果的基礎上，采用Box-Behnken 試驗設計對纖維二糖、酵母浸粉以及裝液量進行優(yōu)化，以菌絲干重為響應值，每個因素的3個水平以（-1，0，+1）編碼，每個試驗點進行3 組平行試驗。Box-Behnken 試驗設計的因子與水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計表

1.2.3 功能根霉曲的制備

稱取500 g 麩皮，加入300 g 蒸餾水，充分混勻，121 ℃，30 min，趁熱輕搖，打散結(jié)塊，冷卻至30～35 ℃，制成麩曲培養(yǎng)基備用。將按照1.2.2 優(yōu)化生長條件培養(yǎng)的種子液按照8 %的接種量添加至麩曲培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，待菌絲長滿黑色孢子，密集且麩皮成餅后，進行扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h。將培養(yǎng)好的麩皮發(fā)酵物于40～45 ℃烘干48 h，使用研磨儀對接種有米根霉的干燥麩皮發(fā)酵物進行研磨，制成功能根霉種曲，并完成手工擴培，獲得功能根霉曲。以功能根霉曲作為實驗組，商業(yè)根霉曲作為對照組，每組三個平行，從理化指標、微生物和試飯實驗三個方面對根霉曲質(zhì)量進行分析。

1.2.4 功能根霉曲微生物群落結(jié)構(gòu)解析

選取功能根霉曲與商業(yè)根霉曲樣品，每份樣品隨機取樣3 次，每次2 g，組織研磨儀充分研磨后用真菌DNA 提取試劑盒對樣品微生物群落總DNA進行抽提，利用微量核酸蛋白分析儀檢測DNA 濃度及純度。對ITS1F-ITS2R 基因1、2 可變區(qū)進行PCR 擴增。利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序，測序與建庫由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用UPARSE 軟件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1）對優(yōu)化序列提取非重復序列，便于降低分析中間過程冗余計算量（http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html），去除沒有重復的單序列（http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋，比對Unite（Release 8.0,http://unite.ut.ee/index.php）的真菌數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 根霉曲理化分析與試飯實驗分析

理化指標分析：水分、酸度和糖化力測定，參照李洪媛等的方法[8]。

試飯實驗：參考嚴啟梅等[9]的文獻進行實驗，同時觀察發(fā)酵產(chǎn)物的外觀，測定試飯?zhí)嵌炔⑦M行感官分析。

1.2.6 功能根霉曲釀酒中試實驗

1.2.6.1 功能根霉曲擴培與質(zhì)量分析

將篩選得到的功能米根霉參照1.2.2 和1.2.3 進行菌株培養(yǎng)及根霉曲制備。擴培時按照0.3 %～0.5 %的接種量（以麩皮計）添加，30～35 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)12～72 h 期間，每6～8 h 翻曲1 次。培養(yǎng)結(jié)束時曲料中菌絲粗壯密布，連接成塊。將曲料打碎，烘干，備用。

理化實驗與試飯實驗方法參考1.2.5方法。

1.2.6.2 糖化料分析方法

取5 g 樣品加入20 mL 超純水，振蕩混勻后，超聲浸提30 min，8000 r/min 離心10 min。取上清液，20 mL 樣品瓶中加入8 mL 上清液、內(nèi)標物（四甲基戊醇，濃度為125 mg/L）和3 g NaCl，迅速擰緊并封好瓶蓋，配制成待測液，供上機分析備用。萃取、氣相及質(zhì)譜條件與1.2.1.1相同。

1.2.7 統(tǒng)計分析

利用SPSS 18.0 軟件和Design Expert 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株篩選及鑒定

2.1.1 功能菌株的篩選

利用梯度稀釋和平板涂布法先后從原料、麩曲、糖化料樣品中分離純化出41 株米根霉菌株，其中原料中獲得6 株，麩曲中獲得16 株，糖化料中獲得19 株。對41 株菌株進行糖化性能及產(chǎn)蜜香能力評估，分離菌株中14 株糖化力＞250，其中3 株糖化力＞350，表現(xiàn)優(yōu)異。專業(yè)術人員對糖化力顯著的3株菌株發(fā)酵液香氣進行感官評價，發(fā)現(xiàn)3 株菌株發(fā)酵液均具有水果香、花香等香氣，其中1 株發(fā)酵液蜜香風味濃郁突出。利用SPME-GC-MS 測定該菌株發(fā)酵液揮發(fā)性香氣成分，將得到的揮發(fā)性風味物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST14 標準庫進行對照匹配，取匹配度大于80 的化合物保留，用于定性分析；定量分析采用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量,參考劉登勇等[13]的方法，采用相對氣味活度值法（relative odor activity value，ROAV）評價各揮發(fā)性成分對樣品總體香氣的貢獻，鑒定結(jié)果見表3。

表3 蜜香風味突出菌株揮發(fā)性香氣成分SPME-GC-MS鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示，該高產(chǎn)蜜香風味物質(zhì)的菌株，發(fā)酵液中共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)27 種，包括醇類13 種，酯類4 種，酮類2 種，酚類1 種，烴類3 種，其他4 種。其中，3-甲基-1-丁醇（異戊醇）、β-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇（異丁醇）、苯乙酮以及四甲基吡嗪的ROAV 值均大于1，是發(fā)酵液中的關鍵風味化合物。值得注意的是，ROAV 值較大的β-苯乙醇具有蜜香、玫瑰花香、月季花香、花粉香等香氣，這與發(fā)酵液蜜香，感官評價結(jié)果相吻合。綜合糖化性能、揮發(fā)性物質(zhì)和感官指標，將篩選出的糖化力較高且發(fā)酵液有顯著蜜香香氣的菌株，編號為BC 70107菌株，確定該菌株應用于后續(xù)馥郁香型白酒用根霉曲的生產(chǎn)。

2.1.2 功能菌株的篩選

將功能菌株BC 70107 接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)特征，并用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察菌絲及其孢子形態(tài)特征。結(jié)果如圖1 所示。菌落疏松或稠密，最初呈白色，后變?yōu)榛液稚蚝诤稚痪z匍匐爬行，無色；假根發(fā)達，分枝呈指狀或根狀；孢囊梗直立或稍彎曲，2～4 株成束，與假根對生，有時膨大或分枝，呈褐色，長210～2500 μm，直徑5～18 μm，囊軸呈球形或近球形或卵圓形，呈淡褐色，直徑30～200 μm；囊托呈楔型；孢子囊呈球形或近球形，后期呈黑色，直徑60～250 μm。

圖1 菌株BC 70107菌落及顯微形態(tài)照片

應用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）法提取菌株基因組DNA，通過真菌通用引物擴增18S rDNA 部分序列、ITS1-5.8S-ITS2 全部序列和28S rDNA 部分序列（rDNA-ITS 序列）并測序，結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析，進一步確定為米根霉。

2.1.3 功能菌株安全性評價

對米根霉BC 70107 培養(yǎng)物進行真菌毒素檢測，在培養(yǎng)物中未檢出黃曲霉毒素B1、B2，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉素。對菌株進行全基因組測序，并通過數(shù)據(jù)庫進行比對，完成基因組預測及功能注釋等相關生物信息分析，結(jié)果見表4。

由表4 可知，米根霉BC 70107 基因組未有相關匹配基因和基因注釋信息，可以認為米根霉BC 70107 不存在PKS 或者NRPS 代謝合成的相關基因及代謝途徑。綜合表型和基因型分析結(jié)果驗證了米根霉BC 70107的安全性[14]。

表4 典型真菌毒素主要合成途徑與基因及其與BC 70107基因組比對結(jié)果

2.2 功能菌株米根霉BC 70107的生長條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

基于探究產(chǎn)蜜香米根霉在馥郁香型白酒釀造中的應用，分析其最佳生長條件，為后期菌劑的制備提供參考。以基礎培養(yǎng)基為對照，優(yōu)化碳源、氮源和無機鹽，得到較高米根霉菌絲干重。采用獨立樣本t 檢驗判斷實驗組與對照組間的顯著性差異，單因素實驗結(jié)果見圖2。

圖2 單因素實驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，米根霉BC 70107 對碳源利用廣泛，以纖維二糖為碳源時，菌絲干重最高，能達到1.00 g/100 mL，因此選取20 g/L 添加量的纖維二糖用于后續(xù)試驗。不同的氮源對菌絲產(chǎn)生量的影響較大，酵母浸粉為氮源時菌絲干重最高，能達到0.70 g/100 mL，因此選擇10 g/L 添加量的酵母浸粉用于后續(xù)試驗。在額外添加FeSO4時菌株生長良好，菌絲干重能達到1.42 g/100 mL，因此選用額外添加量為1 g/L FeSO4的無機鹽用于后續(xù)試驗。

2.2.2 Plackett-Burman試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設計了11 因素N=12 的Plackett-Burman 實驗，試驗設計及試驗結(jié)果如表5所示，方差分析見表6，每組試驗的響應值取3 次重復試驗的平均值。

表5 Plackett-Burman試驗結(jié)果

利用Design-Expert 軟件進行回歸分析，各因素對菌絲干重影響的一次回歸方程為：

Y=1.15+0.207A+0.288B-0.054C+0.115D+0.338E+0.040F-0.043G-0.110H-0.102J

由表6 可知，該試驗模型的P=0.0347＜0.05，表明該模型是顯著的；相關系數(shù)R2=0.9922，表明預測值與試驗值高度相關，方程能較好的解釋變量響應值；調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.9571，表明該方程的擬合度較好。9個因素對響應值影響的顯著順序為裝液量＞酵母浸粉＞纖維二糖＞pH 值＞轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵時間＞FeSO4＞溫度＞接種量，其中裝液量的影響最為顯著，酵母浸粉、纖維二糖有顯著影響，且三者對菌絲量的影響均呈正效應，因此選取這3 個因子進行下一步試驗。

表6 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析

2.2.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果，確定各因素最陡爬坡試驗的方向和步長，試驗設計及結(jié)果見表7。

由表7 可知，隨著裝液量、酵母浸粉、纖維二糖的變化，菌絲干重呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。當纖維二糖為45 g/L、酵母浸粉為35 g/L、裝液量為125 mL 時，菌絲干重最大，達2.13 g/100 mL，因此選擇第6 組中的因素水平為中心點，進行Box-Behnken響應面設計。

表7 最陡爬坡試驗設計及結(jié)果

2.2.4 響應面試驗

設計3 因素3 水平的Box-Benhnken Design 響應面試驗，共17組試驗。Box-Behnken試驗設計與結(jié)果見表8，對試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，分析結(jié)果見表9。

表8 響應面試驗設計與結(jié)果

擬合得到的二次回歸方程為：

R=2.10-0.053A+0.029B-0.204C-0.06AB +0.05AC-0.008BC-0.191A2-0.159B2-0.049C2

由表9可知，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9324，F(xiàn)值=10.72，P 值=0.0025＜0.01，達到極顯著水平，失擬項的P 值=0.0537（＞0.05），失擬項不顯著，說明方程的擬合程度較好，可以用該方程確定菌株生產(chǎn)的最佳條件。另外，一次項C 的P 值=0.0002（＜0.01），說明裝液量對菌株生長影響極顯著。根據(jù)二次回歸方程得到的響應面圖如圖3所示。

表9 響應面試驗結(jié)果方差分析

圖3 因素兩兩交互作用對菌絲干重影響的等高線圖（左）和響應面圖（右）

由該模型得到的最佳發(fā)酵條件為：纖維二糖42.1 g/L、酵母浸粉為36.7 g/L、硫酸亞鐵1.0 g/L、溫度28 ℃、培養(yǎng)時間3 d、轉(zhuǎn)速120 r/min、接種量2%、裝液量110 mL，根據(jù)最佳培養(yǎng)條件對模型進行驗證，3 次平行試驗獲得的菌絲干重平均值為2.32 g/100 mL，與理論預測值接近，說明該模型能較好地反應篩選因素對菌絲干重的影響，在優(yōu)化條件下，菌絲干重較優(yōu)化之前提高了2.36倍。

2.3 功能根霉曲質(zhì)量分析

2.3.1 功能根霉曲理化及微生物指標分析

以市售商業(yè)根霉曲為對照，對米根霉BC 70107 制備的功能根霉曲（實驗組）的水分、糖化力和酸度理化指標及米根霉活菌數(shù)微生物指標進行檢測，測定結(jié)果見表10。

表10 功能根霉曲理化及微生物指標檢測結(jié)果

結(jié)果表明，與商業(yè)根霉曲（對照組）相比，米根霉BC 70107 制備的功能根霉曲糖化力有所提高，酸度明顯下降，米根霉活菌數(shù)是對照組的7.75 倍，相差近一個數(shù)量級。

2.3.2 試飯實驗

以市售商業(yè)根霉曲為對照，根霉曲試飯實驗兩組樣品觀察均出現(xiàn)變軟、體積變小、出汁，具體結(jié)果見表11。

表11 試飯試驗結(jié)果

由表11 可知，功能根霉曲糖化力與對照組無顯著差異，感官具有更為突出的蜜香特征。綜合各項指標和試飯實驗結(jié)果，功能根霉曲質(zhì)量優(yōu)于市售馥郁香型白酒用商業(yè)根霉曲并且可能會在糖化過程中產(chǎn)生更加豐富的風味物質(zhì)和前體物質(zhì)[15]。

2.4 功能根霉曲微生物群落結(jié)構(gòu)解析

為進一步分析功能性米根霉曲品質(zhì)，基于ITS序列的高通量測序技術分析實驗組與對照組根霉曲真菌微生物群落結(jié)構(gòu)。共得到140 個有效OTU，序列比對后，得到已知的5 個門，12 個綱，25 個目，43 個科，57 個屬分類單元，其中豐度大于10%的優(yōu)勢分類單元共有4 種，根霉屬占絕對優(yōu)勢（＞80%）。TOP10菌屬信息見圖4。

圖4 功能根霉曲微生物多樣性差異

圖4 結(jié)果顯示，在成熟的功能根霉曲樣品中，米根霉持續(xù)保持優(yōu)勢狀態(tài)，其豐度遠遠大于其他菌株，此外，其他優(yōu)勢菌株包括念珠菌屬（Diutinasp.）、絲孢酵母屬（Trichosporon sp.）、Dipodascaceae sp.、伊薩酵母屬（Issatchenkia sp.）等；對照組米根霉相對豐度顯著降低，念珠菌屬（Diutina sp.）、絲孢酵母屬（Trichosporon sp.）、Dipodascaceae sp.、伊薩酵母屬（Issatchenkia sp.）等相對豐度占據(jù)近50%。一方面可以推測實驗組與對照組共有菌株來自于外部自然環(huán)境、糧食、操作工具等途徑，一方面也說明商業(yè)根霉曲活力相對較弱，無法始終保持優(yōu)勢狀態(tài)，致使發(fā)酵后期體系中污染大量雜菌，與商業(yè)根霉曲酸度較大的結(jié)果相互印證。

2.5 功能根霉曲釀酒中試實驗

2.5.1 擴培小曲質(zhì)量分析

對菌種擴培工序中實驗小曲質(zhì)量進行5 批次持續(xù)追蹤，結(jié)果見表12。

表12 中試實驗成曲質(zhì)量分析

功能根霉曲擴培小曲糖化力達到419 mg/g·h，酸度為0.7 mmol/10 g，與對照組相比具有糖化力高、酸度低的特點，達到一級曲標準。

2.5.2 糖化料風味物質(zhì)分析

經(jīng)預處理，采用SPME-GC-MS 對使用功能根霉曲與商業(yè)根霉曲發(fā)酵制備的糖化料中的揮發(fā)性物質(zhì)進行分析，結(jié)果如表13所示。

由表13 可知，對照組糖化料丁酸、丙酸、乙酸乙酯、庚酸乙酯、己酸丁酯等含量顯著高于功能根霉曲，丁酸的含量是功能根霉曲糖化料的5.5 倍，易產(chǎn)生不良風味。推測可能是市售商業(yè)根霉曲存在一定量的雜菌，糖化過程導致酸類、酯類物質(zhì)明顯增多。功能根霉曲糖化料中苯乙酸乙酯、β-苯乙醇、苯乙醛等物質(zhì)的含量顯著高于商業(yè)根霉曲，使得糖化料具有蜜香、花香的風味特點。

表13 糖化料中主要揮發(fā)性物質(zhì) (mg/L)

3 結(jié)論

從酒鬼酒股份有限公司釀酒環(huán)節(jié)中的原料、麩曲、糖化料中定向分離篩選出1 株糖化力較高且高產(chǎn)蜜香功能菌株，編號為BC 70107，經(jīng)鑒定為米根霉，同時通過表型和基因型分析驗證了其安全性。

通過單因素試驗、Plackett-Burman 試驗、最陡爬坡試驗及響應面試驗，對米根霉BC 70107 的生長條件進行優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵條件為：纖維二糖42.1 g/L、酵母浸粉為36.7 g/L、硫酸亞鐵1.0 g/L、溫度28 ℃、培養(yǎng)時間3 d、轉(zhuǎn)速120 r/min、接種量2%、裝液量110 mL。該條件下獲得的菌絲干重平均值為2.32 g/100 mL。

將米根霉BC 70107 制備成種曲，并完成手工擴培，與市售商用根霉曲相比，其糖化力、酸度、米根霉活菌數(shù)及試飯實驗結(jié)果均表現(xiàn)優(yōu)異。微生物多樣性差異結(jié)果顯示功能根霉曲米根霉豐度遠遠大于其他菌株，菌株優(yōu)勢明顯。

經(jīng)擴培后的功能根霉曲糖化力達到419 mg/g·h，酸度為0.7 mmol/10 g，評級指標達到一級曲標準。將其應用于馥郁香型白酒生產(chǎn)過程中，糖化料中苯乙酸乙酯和β-苯乙醇等蜜香風味物質(zhì)含量顯著高于對照組，證明米根霉BC 70107 具有高糖化力和高產(chǎn)蜜香風味的特點，是一株性能優(yōu)良的釀酒用糖化菌株，可通過工藝進一步詮釋馥郁香型白酒獨特的蜜甜風格。