不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素及脂肪酸含量的影響

林港華，李 歡，韓玉瑩，薛 婷，李龍玉，代容春，林榮華，陳建楠，陳由強(qiáng)，余雪兵

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350117;2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院， 福建 福州 350117)

海洋微藻能夠生物合成多種高價(jià)值代謝產(chǎn)物，如生理活性物質(zhì)巖藻黃素、多不飽和脂肪酸等，在生物能源、藥品、化妝品或營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域中備受歡迎。球等鞭金藻Isochrysisgalbana是一種單細(xì)胞微藻[1]，它在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠生產(chǎn)巖藻黃素及二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸，因此被應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)保健領(lǐng)域、燃料及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，成為生物能源。巖藻黃素是最豐富但幾乎未開(kāi)發(fā)的類胡蘿卜素資源，能夠參與植物細(xì)胞葉綠體光合作用并具有廣泛的生物活性和健康益處(如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖和抗糖尿病等多種生理活性)[2]。DHA是一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，對(duì)于新生嬰兒大腦和視網(wǎng)膜發(fā)育中有著不可或缺的作用，另外DHA還具有抗血栓形成、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗纖維化作用[3]。

近年來(lái)較多學(xué)者使用基因工程和分子生物學(xué)的方法提高微藻產(chǎn)量以富集其高價(jià)值產(chǎn)物的含量[5]，同時(shí)還研究了控制其培養(yǎng)條件(例如光的可用性)來(lái)提高其生理活性物質(zhì)[6]。光質(zhì)作為影響微藻生長(zhǎng)代謝的最重要光環(huán)境因素之一，藻種的差異對(duì)不同光質(zhì)的響應(yīng)有較大的差異[7]。BOROWAIK等[8]通過(guò)調(diào)節(jié)紅光、藍(lán)光及白光的比例控制雨生紅球藻的生長(zhǎng)及實(shí)現(xiàn)蝦青素的高效生產(chǎn)；DUARTE等[9]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可以促進(jìn)小球藻的細(xì)胞生長(zhǎng)及類胡蘿卜素的積累；KIM等[10]也證明了藍(lán)光是促進(jìn)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)的有效刺激因子，油脂積累也可通過(guò)藍(lán)光刺激來(lái)提高；DHA含量的提高可通過(guò)藍(lán)光與白光同時(shí)照射實(shí)現(xiàn)[11-13]。然而，LATSOS等[14]研究發(fā)現(xiàn)與藍(lán)光相比，隱藻在綠光培養(yǎng)下更有利于生長(zhǎng)；MOHSENPOUR等[15]表明紅光不利于藍(lán)藻生長(zhǎng)，綠光促進(jìn)其生長(zhǎng)。大多數(shù)學(xué)者的研究集中于紅光及藍(lán)光，綠光及單色光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及代謝調(diào)控卻鮮有報(bào)道。

因此，本研究以球等鞭金藻為研究對(duì)象，探究不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)、巖藻黃素及脂肪酸含量的影響，以期為球等鞭金藻的最適生長(zhǎng)條件、巖藻黃素及DHA積累提供最佳試驗(yàn)條件依據(jù)，同時(shí)研究結(jié)果為光質(zhì)影響球等鞭金藻的巖藻黃素及脂肪酸代謝途徑提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藻種來(lái)源：球等鞭金藻來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室保種。本研究中所使用的巖藻黃素、C8-C22及DHA脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于SIGMA-ALDRICH公司，甲醇、正己烷等均為色譜純(購(gòu)自麥克林公司)，甲苯、氯仿等均為分析純(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 藻種培養(yǎng)

球等鞭金藻于白光下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以1∶10的接種比例接種至新配制的液體f/2培養(yǎng)基。試驗(yàn)組為紅光、綠光、藍(lán)光培養(yǎng)組，培養(yǎng)期間分別置于紅光、綠光、藍(lán)光光質(zhì)培養(yǎng)箱內(nèi)，光暗比12 h∶12 h，光照強(qiáng)度63 μmol·m-2·s-1，溫度(20±1)℃。每天搖瓶2次。白光培養(yǎng)組作為對(duì)照組,放置于白光培養(yǎng)箱內(nèi)。其他培養(yǎng)條件同上，每3 d進(jìn)行1次取樣。

1.3 細(xì)胞數(shù)測(cè)定

取1 mL對(duì)照組和試驗(yàn)組的藻液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行藻細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。

1.4 干細(xì)胞重量測(cè)定

微藻生物量的提取方法根據(jù)BESSON等[35]提出的方法改進(jìn)。稱取10 mL離心管備用。取180 mL藻液離心，用蒸餾水洗滌2次將藻泥轉(zhuǎn)移至備用的10 mL離心管中，放入-80℃冰箱中冷凍，放入真空冷凍干燥機(jī)中48 h，使藻泥充分干燥，測(cè)定其干細(xì)胞重量。

1.5 巖藻黃素含量測(cè)定

本試驗(yàn)以甲醇作為提取巖藻黃素的溶劑。將1 mL甲醇、1顆鋼珠(直徑為3 mm)加入已冷凍干燥的藻細(xì)胞中，放入研磨儀，設(shè)定研磨頻率55 Hz，研磨時(shí)間180 s。研磨完成后，于黑暗條件下靜置，15～20 min上下顛倒1次，共顛倒3次，保證巖藻黃素充分浸出。靜置結(jié)束后8 000 r·min-1，離心10 min，取上清液過(guò)膜后注入液相進(jìn)樣瓶，用于高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)[16]。

1.6 脂肪酸含量測(cè)定

配置氯仿∶甲醇(V∶V=2∶1)溶液，向已冷凍干燥的藻細(xì)胞加入2 mL氯仿：甲醇溶液，置于研磨儀中，55 Hz研磨180 s。研磨完成后，8 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，立即用氮吹儀吹干。將樣品進(jìn)行甲酯化處理：加入1 mL甲苯進(jìn)行溶解，隨即加入200 μL的1 mg·mL-1BHT防止油脂氧化，加入2 mL乙酰氯：甲醇溶液(V∶V=1∶10)，50℃水浴過(guò)夜，加入1 mL正己烷溶液(含有1 mg·mL-1十九酸甲酯)，震動(dòng)混勻后靜置分層，取上層溶液過(guò)膜，注入進(jìn)樣瓶，進(jìn)行氣相色譜儀(GC)檢測(cè)[17]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 26進(jìn)行單因素方差分析，Excel繪圖。所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞數(shù)的影響

由圖1可知，第3 d時(shí)藍(lán)光培養(yǎng)組球等鞭金藻的細(xì)胞數(shù)與白光培養(yǎng)組(CK)相差不顯著，第6 d后藍(lán)光培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)均顯著性高于白光培養(yǎng)組(CK)，最大值為4.07×106個(gè)·mL-1，而紅光培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)與白光培養(yǎng)組(CK)相差不顯著。綠光培養(yǎng)組的球等鞭金藻細(xì)胞數(shù)于第15 d 達(dá)到最大值2.54×106個(gè)·mL-1，顯著低于白光培養(yǎng)組(CK)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下圖同圖1 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的細(xì)胞數(shù)Fig.1 Cell number of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.2 不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻干細(xì)胞重量的影響

由圖2可知，白光、藍(lán)光、綠光和紅光培養(yǎng)組的球等鞭金藻最大干細(xì)胞重量分別為0.15、0.13、0.10和0.14 g·L-1。其中，在綠光、紅光培養(yǎng)組第9 d的干細(xì)胞重量顯著低于白光培養(yǎng)組(CK)。

圖2 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的干細(xì)胞重量Fig.2 Stem cell weight of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.3 不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素含量的影響

由圖3可知，球等鞭金藻中巖藻黃素的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在4種光質(zhì)培養(yǎng)下，最高巖藻黃素的含量表現(xiàn)為：藍(lán)光>白光>綠光>紅光。藍(lán)光培養(yǎng)組中最高巖藻黃素的含量為白光培養(yǎng)組(CK)的1.23倍(4.51 mg·L-1)，綠光、紅光培養(yǎng)組低于白光培養(yǎng)組(CK)，最高巖藻黃素含量分別為：3.17、2.68 mg·L-1。

圖3 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的巖藻黃素含量Fig.3 Fucoxanthin content of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.4 不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻脂肪酸含量的影響

由圖4可知，白光培養(yǎng)組的球等鞭金藻脂肪酸含量隨著時(shí)間而增加，藍(lán)光培養(yǎng)組的脂肪酸含量在第12 d達(dá)到最高，綠光、紅光培養(yǎng)組的脂肪酸含量在第3、6、9和12 d顯著高于白光培養(yǎng)組(CK)，并于第12 d達(dá)到頂峰，最大值分別為16.31、17.05 mg·L-1。

圖4 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的脂肪酸含量Fig.4 Fatty acid content of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.5 不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻脂肪酸組分及含量的影響

由圖5可知，球等鞭金藻在白光培養(yǎng)組(CK)下檢測(cè)到8種脂肪酸組分，分別為肉豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)和DHA，其中C18∶0含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低。而C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3和DHA的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在綠光、紅光培養(yǎng)組中，同樣也鑒定出了8種脂肪酸，其脂肪酸的成分含量變化規(guī)律與白光培養(yǎng)組(CK)相似。

圖5 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的各脂肪酸百分含量Fig.5 Percentage content of each fatty acid in Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

與其他3種光質(zhì)處理不同的是：藍(lán)光培養(yǎng)組中的球等鞭金藻鑒定出了9種脂肪酸成分，分別為C14∶0、C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C22：1和DHA，其中C18∶2、C18∶3、C22∶1和DHA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，C16∶0與C18∶0含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低。藍(lán)光培養(yǎng)組中獲得最高含量的DHA和C18∶3，這表明在藍(lán)光培養(yǎng)下，球等鞭金藻中的油脂向不飽和脂肪酸及長(zhǎng)鏈脂肪酸方向合成。

2.6 不同光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻DHA含量的影響

由圖6可知，白光、藍(lán)光和紅光培養(yǎng)組的DHA含量變化都呈現(xiàn)出一種趨勢(shì)，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，均在第15 d含量達(dá)到最大。白光、藍(lán)光、綠光和紅光培養(yǎng)組的最高DHA含量分別為0.53、0.58、0.42和0.50 mg·L-1。綠光培養(yǎng)組中第3、6 d的DHA含量顯著高于白光培養(yǎng)組(CK)；紅光培養(yǎng)組第3、6和9d的DHA含量顯著高于白光培養(yǎng)組(CK)；藍(lán)光培養(yǎng)組的DHA含量始終高于白光培養(yǎng)組(CK)。

圖6 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的DHA含量Fig.6 DHA content of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

3 結(jié)論與討論

微藻中擁有不同的光感受器，它們對(duì)特定的光質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致不同的光合作用和光誘導(dǎo)行為[18]。本試驗(yàn)探究了4種不同的光質(zhì)(白光、藍(lán)光、綠光和紅光)對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素和脂肪酸含量的影響。球等鞭金藻在藍(lán)光培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)始終高于白光培養(yǎng)組(CK)，紅光培養(yǎng)組次之。球等鞭金藻最大干細(xì)胞重量表現(xiàn)為白光>紅光>藍(lán)光>綠光。SIRISUK等[19]表明藍(lán)光培養(yǎng)下微藻細(xì)胞數(shù)上升；MIKI等[20]同樣證明了藍(lán)光對(duì)Sargassumpatens等大型藻類有顯著促進(jìn)生長(zhǎng)的作用；KUWANO等[22]以單色光培養(yǎng)Ulvacompressa，發(fā)現(xiàn)僅在紅光或綠光照射下的藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著下降。王祎哲等[23]報(bào)道藍(lán)光培養(yǎng)下的纖細(xì)裸藻的細(xì)胞數(shù)最高，綠光最低。孫建瑞等[24]觀察到Chlamydomonassp.在藍(lán)光下的生物量積累達(dá)到最大，而紅光下最低；尹繼龍等[21]發(fā)現(xiàn)小球藻在藍(lán)光培養(yǎng)下利于其生物量的積累。這可能是由于藍(lán)光具有更高的光合電子傳輸率，從而提高藻細(xì)胞的光合性能，進(jìn)而提高藻細(xì)胞內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量，為球等鞭金藻的生長(zhǎng)提供更多的碳源。

不同光質(zhì)對(duì)高價(jià)值化合物的生產(chǎn)率有著重大影響。在本試驗(yàn)中，4種光質(zhì)培養(yǎng)下球等鞭金藻的巖藻黃素最大含量均在第15 d達(dá)到最大值，其中藍(lán)光>白光>綠光>紅光。藍(lán)光培養(yǎng)組的巖藻黃素最高含量可達(dá)白光培養(yǎng)組(CK)的1.23倍。紅光培養(yǎng)組的脂肪酸含量最高，綠光培養(yǎng)組次之。DHA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，其中藍(lán)光培養(yǎng)組的DHA含量最高。研究人員[25-27]表明，在海洋環(huán)境中，短波光是底棲生物可獲得的主要光質(zhì)，并且目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微藻具有能夠接受藍(lán)光的光感受器。藍(lán)光感受器不僅可以增強(qiáng)微藻細(xì)胞對(duì)藍(lán)光的吸收能力，而且還能夠參與生物生命節(jié)律調(diào)節(jié)及捕光色素合成等重要生物過(guò)程，對(duì)微藻生長(zhǎng)及相關(guān)代謝活動(dòng)產(chǎn)生重要影響[28-30]。LOREDO等[31]研究表明藍(lán)光利于三角褐指藻中巖藻黃素的積累，并且在其他微藻中也觀察到了這樣的現(xiàn)象[32]；PARKES等[33]發(fā)現(xiàn)Stauroneissp在藍(lán)光培養(yǎng)組中的巖藻黃素含量最高，紅光培養(yǎng)組最低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；SUN等[34]探究光質(zhì)對(duì)Crypthecodiniumsp脂肪酸和DHA含量的影響，結(jié)果表明白光和綠光可提高其脂肪酸含量，紅光能夠誘導(dǎo)脂肪酸積累，而藍(lán)光對(duì)脂肪酸的積累無(wú)明顯影響；SAAVEDRA等[36]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光培養(yǎng)組中Tisochrysislutea的DHA含量上升。本試驗(yàn)中藍(lán)光培養(yǎng)組的DHA含量始終高于白光培養(yǎng)組(CK)。目前，球等鞭金藻如何接受特定光質(zhì)的信號(hào)，并且通過(guò)何種途徑影響藻細(xì)胞內(nèi)巖藻黃素及脂肪酸的合成有待進(jìn)一步揭示。

綜上所述，藍(lán)光培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)、巖藻黃素和DHA含量始終高于其他3種光質(zhì)，紅光促進(jìn)藻細(xì)胞脂肪酸的積累，白光培養(yǎng)組獲得藻細(xì)胞的干細(xì)胞重量最大。這些結(jié)果可為我們深入探究光質(zhì)對(duì)球等鞭金藻光合作用，巖藻黃素和脂肪酸積累等差異性的機(jī)理提供科學(xué)參考。