正交試驗法優(yōu)化靈芝菌絲體γ-氨基丁酸提取工藝

王玲芝，白 雪，蔣詠梅

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350007)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)別名4-氨基丁酸，由F.C.Stewar等[1]和Roberts等[2]在馬鈴薯和哺乳動物腦萃取液中首次發(fā)現(xiàn)。GABA是一種天然的非蛋白氨基酸，具有降血壓、抗癲癇和改善脂質(zhì)代謝等生理功能[3]。2009年我國衛(wèi)生部將其列為6種新型食品資源之一，GABA又增添了制備富含GABA的奶制品和調(diào)味料新型醬[4]等保健食品的新用途，需求日益增長。

GABA廣泛分布于動物、植物以及微生物中，其合成方式主要包括化學(xué)合成法、植物富集法以及生物合成法[5]3種。利用微生物發(fā)酵獲取GABA成本低、產(chǎn)量高，且不受環(huán)境資源限制[6]。目前多通過篩選高產(chǎn)菌株[7]或者生物改造菌株提高GABA的產(chǎn)量，如肖秋穎等[8]從牦牛酸乳中篩選得到GABA高產(chǎn)菌株；鄭鴻雁等[9]對假絲酵母進行紫外誘變，使其GABA產(chǎn)量提高了40.25%；烏云達來等[10]通過分子生物學(xué)手段提高谷氨酸脫羧酶活力達到酵母高產(chǎn)GABA的目的。高產(chǎn)GABA后，如何從生物體中高效率地提取GABA至關(guān)重要，近年來學(xué)者們主要對桑葉[11]、茶[12]、米糠胚芽[13]等體內(nèi)GABA的提取工藝進行優(yōu)化，很少有從微生物中提取GABA的相關(guān)研究。

靈芝作為一種傳統(tǒng)的藥用真菌，在保健和醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的前景[14]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝除含有靈芝酸、靈芝多糖之外，也含有γ-氨基丁酸[15-16]等多種活性物質(zhì)。學(xué)者們探討過靈芝提取物對人體攝取GABA的變化[17]，也研究過將GABA和靈芝有效活性成分進行藥片的制作來改善睡眠[18]，但是目前鮮有學(xué)者研究如何提取靈芝中的GABA。靈芝的培養(yǎng)方式不同，得到的有效物質(zhì)和藥用價值也有所不同[19]，如靈芝振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)比深層發(fā)酵獲得的總?cè)聘?.5倍[20]。因此，本試驗以兩階段培養(yǎng)的靈芝菌絲體為研究對象，探討浸提時間、浸提溫度、料液比和超聲功率4個單因素對靈芝GABA提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上進行正交試驗，確定靈芝中GABA的最優(yōu)提取工藝，為靈芝和GABA的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1試驗材料 靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst(福建師范大學(xué)國家教育部工業(yè)微生物研究工程中心保藏)。

1.1.2試劑與儀器 試劑：γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁)，苯酚，無水乙醇，硼酸，硼砂，氫氧化鈉，次氯酸鈉(≥8%)。

儀器：PHS-3CpH計(賽多儀器有限公司)，TG16-WSD臺式高速離心機(湖南湘儀儀器有限公司)，QL-910漩渦混合器(江蘇其林貝爾儀器有限公司)，SHP-150生化培養(yǎng)箱(精宏設(shè)備有限公司)，BHS-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(福州泰關(guān)實驗儀器有限公司)，UV-1100紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1靈芝菌絲體的制備 靈芝菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)參照丁延青[21]方法，將液態(tài)靜置培養(yǎng)得到的靈芝菌絲體白膜放置在平板中，50℃烘干至恒重，用研缽將其充分研磨成粉末，用10 mL EP管于4℃保存。

1.2.2單因素試驗 (1)溫度對靈芝菌絲體GABA提取的影響。稱取靈芝發(fā)酵菌絲體0.05 g倒入5 mL離心管中，按照料液比1∶30加入1.5 mL蒸餾水，分別在常溫、35℃、55℃、75℃以及沸水中浸提30 min，離心得到待測樣品。(2)料液比對靈芝菌絲體GABA提取的影響。稱取靈芝菌絲體0.05 g倒入5 mL的離心管中，加入料液比1∶20、1∶30、1∶40和1∶50的蒸餾水，即1、1.5、2和2.5 mL，于55℃的水浴浸提30 min，離心得到待測樣品。(3)浸提時間對靈芝菌絲體GABA提取的影響。稱取靈芝菌絲體0.05 g倒入5 mL的離心管中，按照料液比為1∶30加入1.5 mL蒸餾水，放入55℃的水溫中，分別浸提50、60、70、80、和90 min，離心得到待測樣品。(4)超聲功率對靈芝菌絲體GABA提取的影響。稱取靈芝菌絲體0.05 g倒入5 mL的離心管中，按照料液比1∶30加入1.5 mL蒸餾水，放入55℃的水浴中，浸提時間為70 min，分別在0、200、250、300、350以及400 W功率超聲，離心得到待測樣品。

1.2.3正交試驗設(shè)計 依據(jù)單因素試驗的結(jié)果，對料液比，浸泡溫度，浸泡時間和超聲功率，選取合適的區(qū)間，采用相關(guān)軟件spass設(shè)計方法對單因素進行L9(43)設(shè)計與分析。每組因素做3個平行，取平均值。

表1 正交試驗因素水平編碼表Table 1 Horizontal coding table of the orthogonal experimental factors

1.2.4GABA含量的測定 采用Berthelot顯色反應(yīng)[22]測定GABA，加入蒸餾水溶解0.01 g的GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品定容于10 mL容量瓶，配制成1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液。再稀釋為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.5 mL，加入試管中。再向試管依次加入0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 mol·L-1、pH 9.0的硼酸鹽溶液，0.4 mL次氯酸鈉和1 mL 6%的苯酚溶液，震蕩搖勻，沸水水浴10 min后，立即放入冰水浴20 min，取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液2 mL，震蕩混勻，靜置10 min。然后在640 nm測OD值。以GABA濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=1.6645X+0.1411，R2=0.973。當(dāng)GABA濃度超過1 g·L-1時，需要對樣品進行稀釋。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard Curve of GABA

1.2.5數(shù)據(jù)處理 每組3個平行試驗，取平均值，利用Excel 2016作圖和Spass PASW Statistics對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1浸提溫度對靈芝粉GABA提取的影響 由圖2可知，在一定溫度范圍內(nèi)，GABA含量隨溫度的上升而增高，55℃效果最好。當(dāng)溫度超過55℃，GABA提取含量變化趨于平緩，這與浸提溫度對靈芝多糖提取率相同[23]，高溫時，GABA提取含量變化不明顯，說明GABA對溫度不敏感，這可能是因為GABA的熔點高，不易分解[24]。考慮到節(jié)能，選擇55℃為最適提取溫度。

圖2 浸提溫度對GABA提取的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on the extraction of GABA

2.1.2料液比對靈芝粉中GABA提取的影響 由圖3可知，料液比最低比例為1∶20，因為前期發(fā)現(xiàn)料液比低于1∶20時，離心之后無法提取足夠的樣品體積，所以本試驗設(shè)定最低料液比體積為1∶20。料液比為1∶30時，GABA提取含量最高，為1.133 mg·g-1，比料液比1∶20提高了77.58%。這與楊晶晶[25]提取三七莖葉中GABA規(guī)律一樣。干燥的靈芝菌絲體吸收提取液，料液比1∶30、1∶40、1∶50靈芝菌絲體內(nèi)GABA的提取含量差異不大，而且新增添溶劑體積會影響熱學(xué)[26]，導(dǎo)致浸提時間的延長和材料的浪費。從節(jié)省材料角度考慮，1∶30的料液比最好。

圖3 料液比對GABA提取的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction of GABA

2.1.3浸提時間對靈芝粉GABA提取的影響 由圖4可知，在浸提溫度55℃、料液比1∶30時，浸提靈芝菌絲體中的GABA提取含量隨浸提時間的延長先增加后降低。50～60 min，GABA增長緩慢，60～70 min，靈芝GABA提取含量上升較快，達到最大值。當(dāng)浸提時間超過70 min，GABA含量會隨著時間的增加而顯著降低。這是一個固液非均相的浸提過程[27]，GABA從固體轉(zhuǎn)移到液體，并溶解于水中，需要一定的時間，時間過短，GABA與水溶解不充分，因此GABA提取含量會隨著時間的延長而提高，當(dāng)固液GABA達到平衡，繼續(xù)加大時間，可能導(dǎo)致GABA的分解和靈芝細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)的溶解，干擾GABA的測定，從而使GABA提取含量下降。

圖4 浸提時間對GABA提取的影響Fig.4 Effect of the extraction time on the extraction of GABA

2.1.4超聲功率對靈芝粉GABA提取的影響 由圖5可知，超聲功率的變化雖然對靈芝體內(nèi)GABA提取率有一定的影響，但差異并不顯著。本試驗選擇超聲功率作為其中一個單因素試驗，是因為靈芝細(xì)胞不被破環(huán)的情況下，體內(nèi)的有效活性成分需要破壁透過細(xì)胞壁才能釋放[28]，付麗麗等[29]超聲協(xié)同提取靈芝多糖比傳統(tǒng)水提法高出1.7倍。超聲波可以破壞靈芝的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜。不同功率時，效果不同。功率的起始以靈芝孢子粉藥渣多糖提取為參照[30]，上下浮動100 W。

圖5 超聲功率對GABA提取的影響Fig.5 Effect of the ultrasonic power on the extraction of GABA

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，4個因素中浸提時間是提取靈芝菌絲體中GABA的最關(guān)鍵的因素，其次是超聲功率、料液比，影響最小的是浸提溫度。通過對比各因素之間的關(guān)系，得到最理想的優(yōu)化條件為A3D1C3B3，即浸提時間為80 min，超聲功率300 W，料液比1∶30，浸提溫度80℃。通過驗證試驗，3次平行試驗所提取的靈芝GABA含量均值為1.700 mg·g-1。

3 討論與結(jié)論

γ-氨基丁酸(GABA)作為哺乳動物的重要神經(jīng)遞質(zhì)，一種新型的功能因子，具有抗癲癇、治療焦慮和降血壓等功能，在保健和食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，因此提高生物體內(nèi)GABA獲取率尤為重要。采用浸提法提取GABA時，浸提時間、浸提溫度、料液比以及超聲功率是工藝優(yōu)化的關(guān)鍵因素。浸提時間的長短會影響物質(zhì)是否與溶劑充分溶解，浸提溫度的高低會影響物質(zhì)的析出[31]，料液比的多少影響溶質(zhì)的接觸面積，超聲功率的大小會影響物質(zhì)的穿透力[32]。

本試驗根據(jù)GABA易溶于水微溶于醇的特性[33]，采用水提法對以上因素展開單因素試驗，并且在單因素試驗基礎(chǔ)上，以GABA含量為指標(biāo)，選擇有代表性和差異性，設(shè)置水平和因素，展開四因素三水平的正交試驗，結(jié)合數(shù)據(jù)分析得到4個因素對提取GABA含量都有不同程度的影響，即浸提時間>超聲功率>料液比>浸提溫度，最終確定浸提時間80 min，浸提溫度80℃，料液比1∶30以及超聲功率300 W為靈芝粉中γ-氨基丁酸最適提取條件，該研究可為GABA的提取以及進一步的應(yīng)用提供參考。