外周血GPR30表達(dá)水平與腦小血管病致認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度的關(guān)系及對預(yù)后的影響

岳 麗，孫佳瑤，劉龍芳

腦小血管病(cerebral small vessel disease， CSVD)是臨床常見腦血管疾病類型，不僅是導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生的主要原因之一，還會(huì)引起認(rèn)知功能障礙，尤其是老年患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CSVD所致的認(rèn)知功能障礙占所有血管性癡呆的36%～67%[1-2]。CSVD繼發(fā)認(rèn)知損傷的致病機(jī)制不明確，可能與基礎(chǔ)疾病、年齡、相關(guān)外周血標(biāo)志物水平等因素有關(guān)[3]。G蛋白耦聯(lián)雌激素受體30(GPR30)是雌激素非典型的膜性受體，近年來有研究證實(shí)其具有神經(jīng)保護(hù)、抗神經(jīng)炎癥、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)等作用[4-5]。因此推測其可能參與CSVD所致認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展過程。本研究探討外周血GPR30表達(dá)水平在CSVD致認(rèn)知功能障礙中的變化情況，為臨床評估其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度、預(yù)測預(yù)后提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇我院2018年7月—2020年12月收治的CSVD致認(rèn)知功能障礙92例作為觀察組，CSVD后無認(rèn)知功能障礙92例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)頭顱CT、MRI檢查可見CSVD病灶，符合CSVD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；CSVD發(fā)生前認(rèn)知功能正常；觀察組CSVD發(fā)生后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)智力減退、反應(yīng)遲鈍、記憶或其他認(rèn)知功能進(jìn)行性損害癥狀，簡易智能精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)評分<27分，符合血管性認(rèn)知功能障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；對照組CSVD發(fā)生后6個(gè)月內(nèi)無認(rèn)知功能障礙，MMSE評分≥27分；2組臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并多發(fā)性硬化、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、精神疾病、血液系統(tǒng)疾病等其他重大疾病者；伴有顱內(nèi)大血管病變者；無法配合檢查者；合并惡性腫瘤者；存在顱腦外傷、腦血管畸形者；由于其他原因所致認(rèn)知功能障礙者。觀察組男50例，女42例；年齡48～79(58.43±3.46)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)17～28(22.30±1.81)kg/m2；美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損量表(NIHSS)評分8～14(10.38±1.34)分；CSVD發(fā)病部位：基底節(jié)區(qū)33例，丘腦21例，皮層或皮層下25例，額葉13例。對照組男53例，女39例；年齡45～72(54.06±3.03)歲；BMI 17～29(22.62±1.72)kg/m2；NIHSS評分6～12(9.20±1.06)分；CSVD發(fā)病部位：基底節(jié)區(qū)30例，丘腦23例，皮層或皮層下24例，額葉15例。2組性別、BMI、CSVD發(fā)病部位比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組年齡、NIHSS評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2方法 2組均于CSVD發(fā)生后6個(gè)月復(fù)查認(rèn)知功能時(shí)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況。采集清晨空腹靜脈血4 ml，抗凝，提取PBMC，置入-80 ℃恒溫冰箱內(nèi)，備用。①PBMC中GPR30 mRNA相對表達(dá)量檢測方法：采用購自全式金生物公司的Tranzol up試劑盒提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄(美國Invitrogen公司的試劑盒)合成cDNA。由上?？党缮镉邢薰驹O(shè)計(jì)合成引物序列，GPR30：F：5'-AACCCAACCCAAACCACCACA-3'，R：5'-AAGATTTGCCGAAAGGCTCCC-3'；β-actin：F：5'-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3'，R：5'-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3'。行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 600 s，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 60 s，延伸60 ℃ 60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。抽取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(10 μl)，在瓊脂糖凝膠(1.5%)條件下電泳，采用圖像分析系統(tǒng)掃描電泳圖像，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算GPR30 mRNA相對表達(dá)量。②PBMC中GPR30蛋白相對灰度值檢測方法：將提取的PBMC取出置于冰上，制備蛋白樣品，采用美國貝克曼庫爾特公司BCATM試劑盒測定蛋白濃度，依次采取電泳準(zhǔn)備、轉(zhuǎn)膜、封閉及孵抗、顯影等步驟。圖片掃描保存，采用Image J軟件將圖片上特異條帶灰度值數(shù)字化。

1.3認(rèn)知功能障礙程度和預(yù)后判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1認(rèn)知功能障礙程度判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：以MMSE評分為依據(jù)，21～26分為輕度，10～20分為中度，0～9分為重度。

1.3.2預(yù)后判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：觀察組證實(shí)為CSVD致認(rèn)知功能障礙后給予常規(guī)認(rèn)知功能訓(xùn)練、保護(hù)腦細(xì)胞、營養(yǎng)腦神經(jīng)等對癥治療。治療3個(gè)月后評估療效，療效指數(shù)=(治療后MMSE評分-治療前MMSE評分)/治療前MMSE評分×100%。療效指數(shù)>50%為顯效，20%～50%為進(jìn)步，≤20%為無效，將顯效、進(jìn)步納入預(yù)后良好組，無效納入預(yù)后不良組。

2 結(jié)果

2.1PBMC中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況 觀察組PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量低于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組CSVD PBMC中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況比較

2.2觀察組不同病情程度患者PBMC中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況 觀察組不同病情程度患者PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；重度患者PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量低于中度、輕度患者，中度患者低于輕度患者(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組不同病情程度患者PBMC中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況比較

2.3觀察組PBMC中GPR30蛋白、mRNA表達(dá)情況與認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度的關(guān)系 Spearman相關(guān)性分析顯示，PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量與認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見表3。

2.4觀察組不同預(yù)后患者臨床資料、PBMC中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況 觀察組不同預(yù)后患者性別、BMI、發(fā)病部位比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；預(yù)后不良組年齡、NIHSS評分、認(rèn)知功能障礙程度高于預(yù)后良好組，PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量低于預(yù)后良好組(P<0.01)。見表4。

2.5PBMC中GPR30蛋白、mRNA對CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的影響 多因素Logistic回歸分析顯示，在校正其他因素前后，PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量均與預(yù)后獨(dú)立相關(guān)(P<0.01)。見表5。

2.6PBMC中GPR30蛋白、mRNA對CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線分析，PBMC中GPR30蛋白相對灰度值及GPR30 mRNA相對表達(dá)量預(yù)測CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的曲線下面積(AUC)均>0.7,且GPR30蛋白相對灰度值預(yù)測CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的AUC大于GPR30 mRNA相對表達(dá)量，見表6和圖1。

圖1 PBMC中GPR30蛋白、mRNA對CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的預(yù)測價(jià)值ROC曲線CSVD為腦小血管病，PBMC為外周血單個(gè)核細(xì)胞，GPR30為G蛋白耦聯(lián)雌激素受體30，ROC為受試者工作特征

表3 觀察組PBMC中GPR30蛋白、mRNA表達(dá)情況與認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度的關(guān)系

表4 觀察組不同預(yù)后患者臨床資料、PBMC中GPR30蛋白與mRNA表達(dá)情況

表5 PBMC中GPR30蛋白、mRNA對CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的影響

表6 PBMC中GPR30蛋白、mRNA對CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

3 討論

近年來，隨著老齡化加劇，CSVD發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，導(dǎo)致繼發(fā)認(rèn)知功能障礙可能性顯著增加，對患者日常生活活動(dòng)能力、生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[10]。目前，臨床雖然未完全明確CSVD致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制，但發(fā)現(xiàn)此過程是由認(rèn)知正常到癡呆的連續(xù)性過程，若在早期確診、及時(shí)干預(yù)，則會(huì)明顯緩解臨床癥狀，防止病情進(jìn)展至癡呆，反之一旦病情進(jìn)展至中后期，不僅臨床癥狀難以緩解，同時(shí)也無法避免癡呆的發(fā)生[11-12]。因此，尋找可靠的標(biāo)志物進(jìn)行早期診斷對防治CSVD致認(rèn)知功能障礙至關(guān)重要。

GPR30是一種廣泛分布在全身各個(gè)器官組織中的新型7次跨膜雌激素膜受體，與雌激素受體ERα、ERβ無同源性，在雌激素非基因組效應(yīng)中發(fā)揮主要作用，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、肥胖、婦科惡性腫瘤等多種雌激素依賴性疾病發(fā)生發(fā)展過程[13-14]。隨著臨床研究的不斷深入，有學(xué)者證實(shí)GPR30除了在雌激素依賴性疾病中扮演重要角色之外，還在腦血管疾病中具有保護(hù)神經(jīng)功能作用[15]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指出，GPR30活化后可能經(jīng)由抑制TLR4/NF-κB通路減少蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)早期腦損傷修復(fù)，保護(hù)神經(jīng)功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn),PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量在CSVD致認(rèn)知功能障礙患者中顯著下調(diào)，且隨病情加重呈逐漸下調(diào)趨勢。與李建立等[17]報(bào)道一致。結(jié)合國內(nèi)外研究分析原因：GPR30作為雌激素膜受體能通過介導(dǎo)17β雌二醇激活下游信號通路，于短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]；GPR30激活能快速上調(diào)AKT、ERK促生存信號通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)炎癥損傷，保護(hù)海馬體與神經(jīng)元，從而促進(jìn)認(rèn)知功能改善[19]；星形膠質(zhì)細(xì)胞GPR30可經(jīng)由p38MAPK信號通路參與動(dòng)脈粥樣硬化調(diào)控，起到神經(jīng)保護(hù)作用[20]。另外，有研究表明，中樞膽堿能系統(tǒng)在維持人正常學(xué)習(xí)記憶功能方面具有至關(guān)重要的作用，乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)是該作用機(jī)制中的關(guān)鍵遞質(zhì)，而抑制GPR30表達(dá)會(huì)促使海馬組織ACh含量減少，AChE含量增加，促進(jìn)認(rèn)知功能損害發(fā)生發(fā)展；相反GPR30活化后能介導(dǎo)17β雌二醇刺激ACh釋放，抑制AChE活性，改善認(rèn)知功能[21]。由此可知，GPR30表達(dá)下調(diào)會(huì)促進(jìn)CSVD后認(rèn)知功能障礙發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)，PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量與認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度呈負(fù)相關(guān)，提示臨床可通過給予GPR30激動(dòng)劑防治或延緩CSVD后認(rèn)知功能障礙發(fā)生，控制病情進(jìn)展。

同時(shí)，在CSVD致認(rèn)知功能障礙患者中，預(yù)后不良患者PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量低于預(yù)后良好患者，且在校正其他因素前后，二者均與預(yù)后獨(dú)立相關(guān)，表明臨床可將外周血GPR30作為預(yù)測CSVD致認(rèn)知功能障礙患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。進(jìn)一步采用ROC曲線分析，PBMC中GPR30蛋白相對灰度值、mRNA相對表達(dá)量預(yù)測CSVD致認(rèn)知功能障礙預(yù)后的AUC均>0.7，可見二者在預(yù)后預(yù)測中均有良好的應(yīng)用價(jià)值，有助于臨床采取針對性干預(yù)措施改善預(yù)后，降低預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，外周血GPR30水平在CSVD致認(rèn)知功能障礙患者中呈顯著下調(diào)趨勢，與認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、病情程度顯著相關(guān)，還可作為預(yù)測預(yù)后的重要輔助指標(biāo)。不足之處：未對GPR30激動(dòng)劑在CSVD致認(rèn)知功能障礙中的應(yīng)用效果進(jìn)行詳細(xì)探討，今后需實(shí)施深入研究與分析。