SPARC 敲除通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝影響代謝相關(guān)性脂肪肝相關(guān)肝癌發(fā)展的研究

常業(yè)飛 鄭盛 胡滔 洪穎 鐘勇 張曉珺

作者單位：650011 云南省第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

肝細(xì)胞癌 (HCC) 是全球第六大常見(jiàn)癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。預(yù)計(jì)世界上最常見(jiàn)的 HCC 潛在病因?qū)⑹谴x相關(guān)性脂肪肝，超過(guò)酒精和病毒性肝硬化[2]。脂質(zhì)代謝的改變已被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志之一，因?yàn)椴皇芟拗频闹旧蔀榘┘?xì)胞提供了足夠養(yǎng)分，使其不受控制地增殖[3]。最近的證據(jù)表明，癌細(xì)胞的代謝變化會(huì)增加小鼠肥胖模型的致癌作用[4]。最近的一項(xiàng)研究表明，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1c (SREBP1c)是脂肪生成基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，有助于HCC進(jìn)展[5]。與此一致，HCC 細(xì)胞中 SREBP1c 的抑制引起肝細(xì)胞癌停滯和細(xì)胞凋亡，而SREBP1c的過(guò)表達(dá)會(huì)增加細(xì)胞增殖[6]。盡管脂質(zhì)代謝改變?cè)诟伟┌l(fā)生背后的分子機(jī)制仍不清楚，但這些發(fā)現(xiàn)表明，脂肪生成增加是HCC進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)力。富含半胱氨酸型酸性蛋白(SPARC)是一種參與不同生物過(guò)程的蛋白質(zhì)，包括組織更新、對(duì)損傷的傷口愈合反應(yīng)、組織重塑和纖維化[7]。此外，在病態(tài)肥胖NAFLD患者和飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠的樣本中，SPARC肝臟表達(dá)增加與更明顯的肝損傷和纖維化相關(guān)[8]。然而, SPARC 在代謝相關(guān)性脂肪肝相關(guān)肝癌發(fā)展中的作用仍未闡明。本研究進(jìn)一步探討SPARC表達(dá)對(duì)代謝相關(guān)性脂肪肝相關(guān)肝癌的影響及其作用機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究提供一定依據(jù)。

材料與方法

一、樣本來(lái)源

SPF級(jí)、雄性大鼠34只，8月齡，體質(zhì)量400～450 g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2020-0004。

二、主要試劑

鏈脲佐菌素，購(gòu)自中國(guó)上海如吉生物科技公司；TRIzol 試劑，購(gòu)自賽默飛世爾科技；天狼星紅/天狼猩紅染色液試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；油紅O染色試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；DyNAmo HS SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技；鼠抗 SREBP1等單克隆抗體，購(gòu)自艾美捷科技有限公司；等。

三、主要儀器

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(上海上碧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Couvter型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；DM 750型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Spectra Max M5型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；定量PCR儀器(賽默飛世爾科技)；分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)等。

四、方法

(一) 大鼠實(shí)驗(yàn) 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用雄性SPF級(jí)大鼠和SPARC基因敲除大鼠生成 STAMTM 小鼠模型，以研究NASH背景下的HCC發(fā)展。注射皮下劑量 (200 μg) 鏈脲佐菌素。并連續(xù)4周進(jìn)行高脂肪飲食喂養(yǎng)，16周后安樂(lè)死，并評(píng)估腫瘤大小。高脂肪飲食成分：酪蛋白酸鈣 (200 g/kg)、維生素混合物 (10 g/kg)、纖維素 (50 g/kg)、動(dòng)物脂肪 (250 g/kg)、維生素 A (1 mL/kg)、酒石酸氫膽堿 (2.5 g/kg)、麥芽糖糊精 (451.5 g/kg)。本研究經(jīng)我院動(dòng)物研究委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。

(二)體外實(shí)驗(yàn)方案 通過(guò)膠原酶灌注從對(duì)照組和研究組大鼠中分離肝細(xì)胞。肝細(xì)胞在不含酚紅的10% 胎牛血清中培養(yǎng)(每組17份)。培養(yǎng)2 d后將細(xì)胞與不同濃度1 mM的游離脂肪酸 (FFA)、2:1油酸和棕櫚酸的混合物孵育過(guò)夜，16 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

(三)病理分析 肝腫瘤和非腫瘤組織固定在10%甲醛溶液中并包埋在石蠟中。確定肝實(shí)質(zhì)內(nèi)的腫瘤區(qū)域。對(duì)于肝纖維化評(píng)估，肝臟切片用天狼星紅染色，并按照 Camino 等的描述對(duì)膠原纖維進(jìn)行定量。新鮮肝組織在最佳切割溫度化合物中冷凍，并用油紅O及蘇木精伊紅染色進(jìn)行脂質(zhì)分析。

(四)細(xì)胞染色 原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物使用油紅O染色用于脂質(zhì)分析。使用100%異丙醇提取染料，并使用分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)量吸光度以量化細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

(五)蛋白質(zhì)印跡分析 大鼠肝臟組織用1 mL組織裂解緩沖液裂解，在冰浴中在玻璃研磨機(jī)中研磨成勻漿，然后4 ℃裂解30 min，離心20 min。將十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%牛血清白蛋白封閉1 h，用PBS洗滌5 min。隨后，將膜與以下一抗一起孵育：鼠抗SREBP1在4 ℃下過(guò)夜。然后用PBS沖洗膜5次(每次5 min)，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG在室溫下孵育1 h。接下來(lái)，將膜浸入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光溶液。在無(wú)光條件下顯影后，觀察條帶并拍照。

(六)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng) 將細(xì)胞培養(yǎng)物或鼠肝臟腫瘤和非腫瘤組織均質(zhì)化，并使用TRIzol試劑提取總RNA。使用500 ng Oligo (dT) 引物，用200 U SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄 RNA(2 μg)。對(duì)cDNA進(jìn)行qPCR。PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LXRα、CPT1、LIPIN、ACADSB 和 ACOX1 mRNA 水平通過(guò)SYBR Green qPCR進(jìn)行量化。使用相對(duì)定量方法(2-ΔΔCt)計(jì)算SPARC、PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LxRα、CPT1、Lipin、ACADSB和ACOX1相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)。

(七)代謝標(biāo)記和脂質(zhì)分析 細(xì)胞培養(yǎng)完成后收獲前將細(xì)胞與2 μCi/mL [U-14C]-甘油孵育1、2 和 3 h。計(jì)數(shù)后，細(xì)胞在無(wú)菌PBS中洗滌并進(jìn)行脂質(zhì)提取。通過(guò)薄層色譜法(TLC)分離脂質(zhì)種類。通過(guò)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和保留因子進(jìn)行比較來(lái)鑒定不同的脂質(zhì)種類。摻入甘油磷脂 (GPL) 和脂肪酸和中性甘油脂 (GL-TAG) 的放射性通過(guò)放射自顯影進(jìn)行可視化，并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行量化。

(八)甘油三酯定量測(cè)定 將大約0.1 g的肝組織樣品與1 mL氯仿/甲醇 (2:1) 溶液均質(zhì)化。低速離心后轉(zhuǎn)移到另一管中并在氮?dú)饬飨赂稍铮瑯悠啡芙庠?00 μL異丙醇中，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量異丙醇中的膽固醇和甘油三酯水平。

(九)細(xì)胞細(xì)胞凋亡評(píng)估 將分離的原代肝細(xì)胞 (3×103) 接種到96孔板上，并使用1 mM的游離脂肪酸處理，通過(guò)吖啶橙-溴化乙錠混合物染色評(píng)估與細(xì)胞凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。從四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，并確定活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的百分比。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、SPARC的缺失會(huì)增加脂肪變性并引起大鼠代謝相關(guān)性脂肪肝相關(guān)肝癌發(fā)生

在第16周時(shí)，兩組所有大鼠均發(fā)展為肝癌，且研究組肝癌平均直徑(1.39±0.14)mm顯著高于對(duì)照組(1.01±0.09)mm；NAS評(píng)分顯示，研究組大鼠脂肪變性評(píng)分(2.71±0.25)分顯著高于對(duì)照組(1.55±0.19)分，研究組小葉炎癥評(píng)分(0.74±0.09)分顯著低于對(duì)照組(1.27±0.11)分。HE染色結(jié)果顯示，研究組大鼠門(mén)靜脈炎癥減弱(見(jiàn)圖1)；天狼星紅染色結(jié)果顯示，研究組大鼠肝臟纖維化病變高于對(duì)照組(見(jiàn)圖2)。

注：左至右分別為對(duì)照組、研究組

注：左至右分別為對(duì)照組、研究組

二、SPARC敲除引起肝細(xì)胞脂質(zhì)含量增加

體外研究中，油紅O染色結(jié)果顯示，研究組細(xì)胞脂質(zhì)沉積增加，且GL-TAG、GPL表達(dá)顯著高于對(duì)照組(見(jiàn)表1、圖3)。

表1 兩組油紅O染色及GL-TAG、GPL表達(dá)比較

注：左至右分別為對(duì)照組、研究組

三、SPARC敲除引起肝細(xì)胞甘油三酯合成增加

體外實(shí)驗(yàn)顯示，研究組肝細(xì)胞中[U-14C]-甘油表達(dá)顯著高于對(duì)照組(見(jiàn)表2)。

表2 兩組細(xì)胞不同時(shí)間[U-14C]-甘油表達(dá)比較(pomL/106)

四、SPARC敲除通過(guò)上調(diào)脂肪生成酶刺激肝臟脂質(zhì)代謝

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，研究組PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LXRα、CPT1、LIPIN、ACOX1 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組ACADSB mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

五、SPARC敲除增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖活性

吖啶橙-溴化乙錠染色結(jié)果顯示，研究組細(xì)胞活力高于對(duì)照組，細(xì)胞存活率(97.89±1.44)%顯著高于對(duì)照組(48.47±1.21)%。見(jiàn)圖4。

注：左至右分別為對(duì)照組、研究組

表3 兩組PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LxRα、CPT1、Lipin、ACOX1 mRNA表達(dá)比較(2-ΔΔCt)

六、SPARC敲除誘導(dǎo)SREBP1c核易位

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，研究組細(xì)胞增加肝細(xì)胞中SREBP核定位，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研究組AMPK、α-Tubulin蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(見(jiàn)圖5、圖6)。

注：左至右分別為對(duì)照組、研究組

注：左至右分別為對(duì)照組、研究組

討 論

在這項(xiàng)工作中，我們證實(shí)了SPARC的缺失會(huì)增加肝細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積，并且SPARC在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝方面具有關(guān)鍵作用[9]。研究組肝細(xì)胞顯示出脂滴含量增加和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(CD36、FABP4、FABP5)、脂肪生成基因(FASN、ACC1、SREBP1)和參與β-氧化和TG合成的基因 (LIPIN1)的更高表達(dá)。此外，在研究組肝細(xì)胞中觀察到TG合成增加。我們進(jìn)一步研究了脂質(zhì)超載對(duì)肝細(xì)胞的影響，并觀察到與對(duì)照組小鼠相比，研究組肝細(xì)胞在游離脂肪酸中顯示出更高的細(xì)胞活力、增殖和抗凋亡能力。最后，我們證實(shí)了在 NAFLD-HCC模型中敲除SPARC會(huì)加速 HCC的發(fā)展。RNA-seq研究表明，在研究組大鼠中，與脂質(zhì)代謝、細(xì)胞解毒和增殖相關(guān)的通路上調(diào)。SPARC在多種組織中表達(dá)，發(fā)揮多種重塑和代謝功能[10]。在脂肪組織中，SPARC 抑制脂肪生成可能是因?yàn)榇碳nt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子，包括CAAT/增強(qiáng)子-結(jié)合蛋白α (C/EBPα)、CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β (C/EBPβ) 和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)。在骨骼肌中，SPARC 充當(dāng)代謝增強(qiáng)劑和運(yùn)動(dòng)介質(zhì)，另一方面，研究組小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)和高脂肪飲食條件出現(xiàn)嚴(yán)重的葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變[11-12]。因此，觀察到的脂質(zhì)沉積增加可能與脂肪生成增加及葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變相關(guān)。

有研究指出，SREBP1介導(dǎo)的脂肪生成途徑和SREBP1c的高表達(dá)與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)[13]。此外，抑制SREBP1c核易位可抑制DEN誘導(dǎo)的HCC生長(zhǎng)。本研究中觀察到 SPARC 的缺失或抑制會(huì)增加 SREBP 定位在肝細(xì)胞核中， SPARC 可能與 AMPK 相互作用，SPARC 對(duì) SREBP 細(xì)胞定位的影響可能是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK活性來(lái)介導(dǎo)的。本研究中，研究組大鼠SPARC敲除后，AMPK激活明顯減少。周源[14]證實(shí)SPARC是一種AMPK相互作用蛋白，可能通過(guò)AMPK激活參與調(diào)節(jié)代謝。因此，筆者推測(cè)SPARC可能直接或間接與AMPK相互作用，阻止其活化從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

脂肪生成是增強(qiáng)癌癥最重要的代謝標(biāo)志之一[15]。脂肪酸促進(jìn)了與癌細(xì)胞發(fā)育、進(jìn)展和存活相關(guān)的重要過(guò)程[16]。脂肪生成的變化在致癌過(guò)程的早期開(kāi)始，并隨著腫瘤細(xì)胞變得更具侵略性而進(jìn)一步擴(kuò)大。脂質(zhì)代謝失調(diào)和肝臟中TG 的積累是代謝相關(guān)性脂肪肝的關(guān)鍵基礎(chǔ)，代謝相關(guān)性脂肪肝是一種會(huì)增加肝癌發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的疾病。脂質(zhì)代謝重編程被認(rèn)為是非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝癌中的一個(gè)重要基礎(chǔ)[17]。因此，需要確定代謝相關(guān)性脂肪肝背景下參與肝癌發(fā)生的新途徑。為了進(jìn)一步研究非酒精性脂肪肝環(huán)境中SPARC介導(dǎo)的代謝改變，我們?cè)谘芯拷M小鼠中使用了非酒精性脂肪肝-肝癌模型。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SPARC敲除導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積加速，脂肪變性增加及纖維化。然后，我們?cè)?16 周后評(píng)估了大鼠肝癌的發(fā)展，并觀察到研究組大鼠顯示出肝癌加速生長(zhǎng)。Atorrasagasti等[18]報(bào)道在裸鼠皮下接種時(shí)，SPARC在HCC 細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其致瘤性降低，部分是通過(guò)誘導(dǎo)間充質(zhì)到上皮的轉(zhuǎn)化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，研究組大鼠肝癌進(jìn)程加快，并且與肝臟炎癥和纖維化程度降低有關(guān)?？紤]到患有脂肪變性的肥胖患者HCC發(fā)病率正在穩(wěn)步增加，我們的研究結(jié)果可能具有重要意義。但本研究仍有不足，如本研究中大鼠雖在短時(shí)間內(nèi)發(fā)展為HCC，但與人非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展為肝癌的緩慢病程具有差異，且多數(shù)肥胖患者伴有胰島素抵抗和2型糖尿病，本研究并未對(duì)此進(jìn)行造模對(duì)比。此外，鏈脲佐菌素可能對(duì)肝細(xì)胞具有獨(dú)立的致癌作用，因?yàn)閾?jù)報(bào)道它是一種破壞DNA的烷化劑。但本研究所獲取結(jié)果仍具有較高參考價(jià)值，對(duì)進(jìn)一步闡明SPARC與關(guān)鍵脂質(zhì)代謝蛋白相互作用機(jī)制的研究具有參考意義。

綜上所述，SPARC敲除可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠脂質(zhì)代謝、細(xì)胞活力及肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累增加等途徑影響代謝相關(guān)性脂肪肝相關(guān)肝癌發(fā)展。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。