藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

李應(yīng)懿 陳揮昂 謝青 賴榮陶

作者單位：200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科

藥物性肝損傷(DILI)的臨床和組織學(xué)表現(xiàn)可模擬多種其他肝病，缺乏客觀、敏感性和特異性高的生物標(biāo)志物，使得DILI的診斷始終基于排他性原則。而理想的DILI生物標(biāo)志物應(yīng)具備四個條件：有助于判斷亞臨床DILI，提高臨床DILI診斷率；區(qū)分DILI的嚴(yán)重程度；鑒別適應(yīng)性和進(jìn)展性DILI；幫助判斷DILI的預(yù)后。現(xiàn)就常用的肝臟生化學(xué)指標(biāo)及近幾年發(fā)現(xiàn)的DILI生物標(biāo)志物做一介紹。

一、傳統(tǒng)的肝臟生化指標(biāo)及DILI評估模型

(一)評價 DILI 傳統(tǒng)的肝臟生化指標(biāo) 這些指標(biāo)主要包括血清總膽紅素 (TBil)、直接膽紅素(DBil)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)等。

在這些生物標(biāo)志物中，ALT主要存在于肝細(xì)胞的胞漿中，是肝功能損害最敏感的檢測指標(biāo)之一，但缺乏特異性。在人體中的ALT常以兩種等量的亞型存在，即ALT1和ALT2。ALT2僅局限于肝外組織，特別是心臟和骨骼肌。最近的研究表明，評估ALT1和ALT2活性及各自對血漿中總ALT活性的百分比貢獻(xiàn)夠為區(qū)分肝損傷和肝外損傷提供有價值的證據(jù)[1]。然而目前臨床實踐中使用的標(biāo)準(zhǔn)ALT活性測定無法區(qū)分來自不同器官或亞型的血清ALT。AST主要存在于心肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞的線粒體中，臨床AST血清水平升高提示心肌梗死、肝臟疾患，其中AST/ALT比值>1時，提示有肝實質(zhì)細(xì)胞壞死；GGT在腎臟中分泌最多，胰和肝其次，在肝臟中主要分布于肝細(xì)胞漿和肝內(nèi)膽管上皮，ALP通常作為檢測肝臟或骨骼疾病的指標(biāo)之一，分布在肝細(xì)胞的血竇側(cè)和毛細(xì)膽管側(cè)的微絨毛上，骨組織中存在的ALP與成骨細(xì)胞活性相關(guān)，而絕經(jīng)后婦女的血清ALP水平也會升高。臨床上GGT和AKP兩者的血漿水平升高可能提示肝內(nèi)外膽道梗阻或急性肝炎、肝硬化、慢性肝炎、酒精性肝病等其他病變；TBil是直接膽紅素和間接膽紅素的總和，正常范圍3.4～17.1μmol/L，主要反映肝臟膽紅素代謝水平及臨床上衡量患者黃疸程度。

(二)傳統(tǒng)生物標(biāo)志物可用于評估DILI的嚴(yán)重程度 我國對于DILI的診治主要參考2015年的《藥物性肝損傷診治指南》[2]，其中DILI的嚴(yán)重程度部分參考了國際上的DILI分級及我國肝衰竭指南，使用血清ALT、血清ALP、TBil以及INR、PTA等傳統(tǒng)生物標(biāo)志物將急性DILI的嚴(yán)重程度分為0～5級。

(三)eDISH 美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)利用血漿ALT和TBil這兩項傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物，開發(fā)了一項基于海氏法則(Hy’s Law)，用于藥物引起嚴(yán)重肝毒性的四象限評價圖表，簡稱eDISH，用于FDA臨床藥物肝毒性評價[3]。海氏法則是基于Hyman Zimmerman博士臨床實踐修訂后的產(chǎn)物，即ALT>3 ULN，血清ALP沒有或微弱升高，TBil>2?ULN。eDISH根據(jù)Hy’s Law劃分為四個象限，其坐標(biāo)軸以ULN為刻度,以10為底的對數(shù)坐標(biāo)，橫縱軸分別為血漿ALT和TBil，象限劃分直線分別對應(yīng)3倍ULN的血清ALT以及兩倍ULN的TBil。該圖表右上象限、左上象限以及右下象限分別被命名為海氏定律象限(Hy’s Law Quadrant)、膽汁淤積象限(Cholestasis Quadrant)以及坦普爾推論象限(Temple’s Corollary Quadrant)，分別與可能導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷的風(fēng)險、不符合海氏定律但存在潛在的藥物性肝損傷的風(fēng)險和造成膽汁淤積性肝損傷風(fēng)險相關(guān)。鑒于這種方法的高效性，且在大規(guī)模篩查時具有優(yōu)勢，因此有望將其標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化，但該方法存在生物標(biāo)志物種類少的局限性，且未來可能有更可靠的生物標(biāo)志物的判斷方法。

(四)DILIsym DILIsym模型是用于DILI研究的定量系統(tǒng)藥理學(xué)(QSP)模型平臺[4]，從藥代動力學(xué)、發(fā)生機(jī)制(包括膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白抑制、線粒體損傷、過氧化物應(yīng)激)及在不同患者中發(fā)現(xiàn)差異性等多方面模擬和預(yù)測藥物的肝細(xì)胞毒性，截至目前，該模型在23個測試藥物中準(zhǔn)確預(yù)測了21個藥物的安全性(90%)。其系統(tǒng)局限性在于處理數(shù)據(jù)量時耗時長、所需數(shù)據(jù)較多，因此需要更多的子模型與藥物以及更高效的計算能力進(jìn)行持續(xù)優(yōu)化。

(五)RO2 RO2(Rule of Two) 是2013年提出的一種通過每日藥物口服攝入劑量和藥物親脂性判斷患者藥物攝入是否會引起肝毒性的一種判斷方法[5]。項目通過對164種FDA批準(zhǔn)口服藥物的每日藥物口服攝入劑量和藥物親脂性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)口服用藥同時符合親脂性(辛醇-水分配系數(shù)，logP≥3)和每日藥物口服劑量≥100 mg與DILI風(fēng)險高度相關(guān)(OR=14.05；P<0.001)。但該模型對于DILI的嚴(yán)重程度缺乏預(yù)測性。在RO2的基礎(chǔ)上，2016年該團(tuán)隊通過對FDA批準(zhǔn)的354種口服藥物進(jìn)行分析，將藥物活性代謝物(RM)加入RO2模型進(jìn)一步提高DILI預(yù)測能力，其具體公式為基于每日劑量的0.608×log(每日劑量/mg) + 0.227×logP + 2.833×(有無RM形成，0或1)以及基于Cmax的0.511 × log (Cmax/10 nM) + 0.296×logP +2.809× (有無RM形成，0或1)。基于改良后的DILI評分模型，該團(tuán)隊通過對LiverTox數(shù)據(jù)庫中的DILI案例分析認(rèn)為≥7會造成嚴(yán)重臨床后果(肝衰竭、死亡等)，<3不太可能造成嚴(yán)重臨床后果。

然而，這些生物標(biāo)志物中有許多并不具備肝毒性的特異性，或不能提供相關(guān)的損傷機(jī)制信息。特別是特異質(zhì)性肝細(xì)胞損傷型 DILI 往往進(jìn)展迅速，導(dǎo)致肝功能衰竭，因而對其相關(guān)生物標(biāo)志物的探索也更為迫切，目前有潛在前景的DILI生物標(biāo)志物包括蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、藥物基因組學(xué)和代謝組學(xué)等。

二、蛋白組學(xué)

目前研究的潛在DILI生物標(biāo)志物多屬于蛋白質(zhì)，主要包括以下幾種：

(一)谷氨酸脫氫酶(GLDH) GLDH是一種線粒體酶，主要存在于肝臟、腎臟和骨骼肌中。這種酶比ALT和AST更具組織特異性。健康個體的血清GLDH水平穩(wěn)定，且不受年齡性別的影響。機(jī)體血清GLDH會在肝細(xì)胞壞死期間的線粒體膜損傷時升高，表明線粒體功能障礙。GLDH與各種形式的臨床證明的肝損傷[包括對乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)過量]患者的ALT升高密切相關(guān)，但其敏感性不足以預(yù)測ALT發(fā)生變化之前的APAP肝損傷[6]。

皮下肝素注射是一種常用于輕微肝損傷造模的手段。據(jù)報道接受皮下肝素注射的健康無癥狀志愿者會出現(xiàn)血清GLDH升高和ALT升高[7]，這表明GLDH和ALT有一定相關(guān)性。蘋果酸脫氫酶(MDH)也有類似結(jié)果，MDH是檸檬酸循環(huán)中的一種組成酶，在組織損傷后釋放到血清中。然而，MDH的組織特異性較低，血清水平會受到肝外組織損傷的影響。

(二)琥珀酸脫氫酶(SDH) SDH是一種細(xì)胞質(zhì)酶，主要存在于肝臟和睪丸中，多年來一直被用作肝臟和睪丸疾病的診斷標(biāo)志物。它是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)。與傳統(tǒng)血清標(biāo)志物相比，它在肝臟中的濃度變化更加明顯。在接受皮下注射肝素的健康受試者中，觀察到無癥狀時血清SDH水平升高，表明SDH能檢測到輕微的肝損傷[7]。

據(jù)報道某些藥物會抑制ALT的升高從而影響肝損傷的診斷。例如，使用低劑量D-青霉胺(10或15 mg/d)構(gòu)建小鼠肉芽腫性肝炎，在誘導(dǎo)肝臟出現(xiàn)組織病理學(xué)改變之前可導(dǎo)致SDH和GLDH活性輕微增加，但無法觀察到ALT濃度增加[8]。因此SDH相比ALT具有更強(qiáng)的抗干擾能力，可能是DILI中更具有特異性和敏感性的生物標(biāo)志物。

(三)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST) GST是肝臟中豐富的細(xì)胞溶質(zhì)酶，是肝臟特異性的肝毒性生物標(biāo)志物。肝功能受損后，它會從肝細(xì)胞質(zhì)釋放到血漿中。因此，監(jiān)測GST活性水平可能是診斷DILI的潛在物質(zhì)。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶α(GSTa)是GST的同功酶，被證明是一種可行的生物標(biāo)志物，因為其相比AST或ALT水平，在肝毒性期間的濃度增加更為顯著。此外，GSTa在檢測肝損傷和肝細(xì)胞空泡化方面也顯示出更強(qiáng)的特異性，減少了基于肝外組織中ALT水平的假陽性結(jié)果。

(四)高遷移率組框蛋白1 (HMGB1) HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，主要在 DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。它是調(diào)節(jié)DILI炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。HMGB1 可從壞死的肝細(xì)胞和激活的免疫細(xì)胞中釋放。

在APAP毒性的小鼠模型中，總血清HMGB1與肝壞死水平的增加密切相關(guān)(R2= 0.75)，而血清乙?；?HMGB1 與肝炎癥細(xì)胞浸潤相關(guān)[9]。同一研究指出，HMGB1不僅可以比ALT更早出現(xiàn)并量化DILI程度，由于血清半衰期較短，還比 ALT 更早恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，首次就診時總血清 HMGB1可作為檢測人類急性肝損傷的更敏感的生物標(biāo)志物[6]。與ALT相比，APAP 過量患者(129例)首次入院時，總血清 HMGB1早期升高更快，HMGB1 (ROC0.97) 比ALT (ROC0.54)更能預(yù)測發(fā)生急性肝損傷的可能性。一項對APAP過量患者的ROC分析顯示，血清中乙?；疕MGB1濃度越高，預(yù)后越差，乙酰化HMGB1比ALT更能預(yù)測患者的預(yù)后[10]。DILI發(fā)生期間，大多數(shù)高度乙?；?HMGB1 被認(rèn)為由先天免疫細(xì)胞釋放，雖然肝細(xì)胞也被證明在某些條件下分泌乙?；?HMGB1，但DILI期間的水平上升仍應(yīng)當(dāng)歸因于DAMP對于先天免疫系統(tǒng)的激活。

然而，目前用于確定 HMGB1 濃度 (ELISA) 和 PTM (MS/MS) 的測定方法非常耗時，前者無法區(qū)分 HMGB1 的不同氧化還原和乙酰亞型，后者無法用于臨床。此外，HMGB1 并非肝臟特異，因此雖然它作為預(yù)測 DILI 發(fā)展的生物標(biāo)志物優(yōu)于 ALT，但它應(yīng)該與其他肝臟特異性標(biāo)志物一起用于生物標(biāo)志物組分析。

(五)中間絲角蛋白18(CK-18) CK-18是一種細(xì)胞骨架蛋白，是在肝臟中表達(dá)的主要中間絲家族成員。全長形式從壞死細(xì)胞中釋放出來，而半胱天冬酶切割的片段(cc-CK18)是細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化的產(chǎn)物。可溶性 CK-18 片段可通過免疫測定在人血清中檢測到。但在壞死期間，全長 CK-18 被動釋放到循環(huán)中，只釋放少量cc-CK18。血清中的CK-18 和 cc-CK18顯示出作為預(yù)測肝衰竭和死亡的預(yù)后生物標(biāo)志物的前景。一項動物實驗證明，小鼠cc-CK18水平升高與肝細(xì)胞凋亡存在強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)[9]。一項針對APAP誘導(dǎo)的肝損傷(AILI)的研究報道，CK-18和 cc-CK18水平比ALT 水平更快出現(xiàn)顯著升高[9]?！暗蛲鲋笖?shù)”(AI)是半胱天冬酶切割的角蛋白18 (cc-CK18) 與總角蛋白18 (包括全長CK-18 和半胱天冬酶切割的片段cc-CK18)的比率。臨床研究顯示，符合國王學(xué)院標(biāo)準(zhǔn) (KCC)肝衰竭模型的患者 K18 和 ccK18 水平比其他患者顯著升高，并且AI準(zhǔn)確提示了滿足 KCC模型的患者肝臟有更多的壞死改變[11-12]。然而，在使用 ELISA 時，需要CK18 和 cc-CK18 水平高于一定的基線水平；如果K18 和 ccK18 水平較低，或接近背景水平時，該比率可能無臨床意義。

(六)脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP1) FABP是一類小分子蛋白，主要通過與疏水性配體，如各類脂肪酸、花生酸等脂質(zhì)結(jié)合，在脂質(zhì)的代謝等過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少9種FABP成員，F(xiàn)ABP1命名為肝臟型，F(xiàn)ABP參與脂質(zhì)代謝，其表達(dá)在人體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞組織內(nèi)會隨著脂質(zhì)沉積而表達(dá)增高。2019年的一項多隊列DILI潛在生物標(biāo)志物篩選研究就提出，包括FABP1在內(nèi)的一些生物標(biāo)志物的AUC>0.9，且靈敏度較高，具有良好的生物標(biāo)志物潛力，可以考慮用于DILI篩查[13]。

三、轉(zhuǎn)錄組學(xué)

(一)微小RNA 微小RNA(miRNA)是小片段(20～24核苷酸)非編碼RNA，常參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。

迄今為止，已有研究證實了肝損傷期間血清miRNA的濃度變化[14]。MiR-122和MiR-192經(jīng)研究證明在小鼠APAP肝損傷后會顯著升高，并在研究中發(fā)現(xiàn)，人類受試者中也表現(xiàn)出類似增加。而在臨床上APAP過量攝入后入院的患者中也發(fā)現(xiàn)了在肝細(xì)胞損傷的早期階段可以檢測到血清miR122，而傳統(tǒng)標(biāo)志物ALT仍處于正常水平[9]。

此外，miR-122比ALT更具肝臟特異性。研究人員在大量運動誘導(dǎo)受試者肌肉損傷的實驗中發(fā)現(xiàn)，受試者的血清miR-122保持相對的穩(wěn)定，而ALT卻能明顯檢測到增加[15]。然而，miR-122對特異性DILI的預(yù)測價值仍有待確定。盡管miR-122作為早期血源性DILI生物標(biāo)志物能夠提供有效的信息，但無論是在大鼠還是在人類中，過量服用APAP后，尿液的miRNA水平都不會顯著增加。因此其是否在臨床上有普遍應(yīng)用價值仍需進(jìn)一步確認(rèn)。

(二)外泌體 外泌體(exosomes)是一種由各類細(xì)胞以膜結(jié)構(gòu)分泌的細(xì)胞外囊泡(EV)，近年來作為細(xì)胞間通訊的重要組成部分而備受關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明， APAP 誘導(dǎo)的DILI使得miR-122 和 miR-192的水平升高，而沒有增加腎臟特異性 miR-146a 或肌肉特異性 miR-206，表明 EV-miR-122/192可能同樣具有肝臟特異性[16]。同時，也有研究顯示，EV-miR-122 比循環(huán)中的游離miR-122 更穩(wěn)定，并對 RNA 酶具有一定抗性[17]。但EV-miR-122 作為生物標(biāo)志物仍然存在一定局限性。例如現(xiàn)有研究無法證明其作為DILI的生物標(biāo)志物方面相較于血清中游離的miR-122是否有更多優(yōu)勢，且EV-miR-122和游離miR-122同樣具有高度可變性。

盡管外泌體作為DILI信號標(biāo)志物已有一定研究進(jìn)展，但現(xiàn)有研究仍然強(qiáng)調(diào)對外泌體的基本功能與調(diào)節(jié)機(jī)制缺乏了解。并且正如上文中所提到的那樣，這些包裹在外泌體中的蛋白或RNA分子是否比游離態(tài)的對應(yīng)分子在DILI的生物標(biāo)志物方面有更多優(yōu)勢還有待研究。

四、藥物基因組學(xué)

藥物或其活性代謝物介導(dǎo)DILI發(fā)生的機(jī)制多種多樣，例如傳統(tǒng)的藥物介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致的固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子風(fēng)暴、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)導(dǎo)致的持續(xù)性肝損傷。同時還有半抗原假說和HLA相關(guān)的遺傳變異。由肝臟代謝產(chǎn)生的藥物或藥物代謝物可作為“半抗原”被抗原呈遞細(xì)胞識別作為抗原加工。隨后在MHC II類分子的肽溝中呈遞衍生片段激活CD4 + T細(xì)胞，由受損肝細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及其他因子共同刺激危險信號通路，從而促發(fā)DILI相關(guān)的免疫反應(yīng)。

(一)半抗原假說 藥物或其活性代謝物由于其本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)可以與肝臟蛋白質(zhì)共價結(jié)合，形成的藥物-蛋白質(zhì)復(fù)合物可以通過巨噬細(xì)胞的抗原遞呈作用引發(fā)免疫反應(yīng)，例如氟烷和泰尼酸介導(dǎo)的抗LKM抗體(肝臟和腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體抗體)形成。然而有觀點認(rèn)為，半抗原可能還需要一些伴隨的危險因子才能介導(dǎo)免疫損傷，例如感染或炎癥等。因此，大多數(shù)引起DILI的藥物其損傷機(jī)制與藥物肝代謝產(chǎn)生的半抗原復(fù)合物無關(guān)。

(二)人類白細(xì)胞抗原(HLA) HLA的基因型已被許多研究證明與DILI相關(guān)(見表2[18-20])。

表1 DILI相關(guān)的HLA基因型

盡管已證實藥物是否引發(fā)DILI與HLA基因型相關(guān)，但仍有研究指出HLA基因型對DILI的陽性預(yù)測價值仍然非常有限，例如HLA-B*5701與氟氯西林誘導(dǎo)的 DILI 已經(jīng)被證明具有相當(dāng)強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，其陽性預(yù)測值也僅為 0.12%。同時，HLA 基因型檢測同時有低陽性預(yù)測值和成本高昂的缺陷。我國2019年的一項前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)， HLA-B*35:01是 PM-DILI 的高風(fēng)險等位基因(PM-DILI 與其他 DILI，OR86.5；PM-DILI 與人群對照，OR 143.9)。在前瞻性隊列研究中，6 例患者被診斷為轉(zhuǎn)氨酶水平無癥狀升高，代表 HLA-B*35:01 中發(fā)生率顯著升高(相對風(fēng)險8.0)攜帶者 (37.5%) 高于非攜帶者 (4.7%)。HLA-B*35:01 等位基因是 PM-DILI 的遺傳危險因素，也是預(yù)測人類 PM-DILI 的潛在生物標(biāo)志物[21]。

(三)非HLA位點突變 有研究通過PBMC 與 HepG2 肝癌細(xì)胞的共培養(yǎng)對77 種隨機(jī)選擇的具有不同 DILI 風(fēng)險的已上市或已撤回藥物進(jìn)行測試得出有預(yù)測DILI潛力的單基因或基因組合[22]。ROC分析顯示，單基因中MET的AUC值最高(0.81)，其次是BMP6(0.76)、IL-24(0.73)、CXCL8(0.72)和EREG(0.67)，并且都具有顯著性。該項研究還指出，MET 表達(dá)水平可以區(qū)分相同藥物類別中的一些 DILI 陽性藥物和 DILI 陰性藥物。同時該研究使用9個已鑒定的生物標(biāo)志物基因，對 BMP6、EREG、IL-1A、MET、PID1、PTGS2、SLC7A11、SLPI 和 TNFAIP6 表達(dá)水平進(jìn)行建模。該模型在區(qū)分 DILI 陽性藥物和 DILI 陰性藥物方面提供了最佳預(yù)測(AUC=0.94，靈敏度為 93%，特異性為 86%)。該研究提供了可以預(yù)測或評估DILI的免疫細(xì)胞系列單基因及基因組合。然而這些基因與 DILI 之間存在統(tǒng)計學(xué)上的關(guān)聯(lián)，但缺乏機(jī)制上的研究佐證。另一項通過全基因組 DNA 甲基化分析，MassARRAY在 296個病例中驗證了 34 個已識別的候選探針[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個探針上的12個CpG位點與ATLI風(fēng)險呈正相關(guān)。有研究者應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)介導(dǎo)的甲基化可修飾細(xì)胞模型，證明AK2基因區(qū)域內(nèi)或附近的四個CpG?，SLC8A2和PSTPIP2影響細(xì)胞對利福平治療的反應(yīng)程度，提供了與 ATLI 發(fā)生相關(guān)的新生物標(biāo)志物。

五、代謝組學(xué)

一些可疑藥物，如曲格列酮、非阿尿苷可引起線粒體損傷。這一過程可導(dǎo)致血清或尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)可先于線粒體功能的惡化，是識別和預(yù)測不良結(jié)局的潛在生物標(biāo)志物。在代謝組學(xué)研究中有兩個較為經(jīng)典的案例，一項對乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)肝毒性的研究發(fā)現(xiàn)在整合了尿液代謝產(chǎn)物的數(shù)學(xué)模型中，NAPQI是DILI易感性的一種重要預(yù)測因子，NAPQI產(chǎn)生越多，發(fā)生DILI的風(fēng)險也越高[24]。該研究顯示了無偏倚代謝組學(xué)在評估內(nèi)源性和藥物誘導(dǎo)性生物標(biāo)志物中的重要價值。另一個研究是服用土三七導(dǎo)致肝小靜脈阻塞綜合征的患者中，通過超高液相色譜-質(zhì)譜顯像法在DILI患者血清中發(fā)現(xiàn)吡咯烷生物堿[25]。

六、抗藥抗體

根據(jù)之前的報道，一些DILI造成的肝損傷可能是由抗藥抗體介導(dǎo)的免疫殺傷。藥物如替尼酸和氟烷引起的異質(zhì)肝損傷就與多種抗體有關(guān)。聯(lián)系前文的半抗原學(xué)說，藥物可以與MHC分子結(jié)合誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或本身作為抗原以可逆方式與免疫受體相互作用，即“藥物與免疫受體的藥理學(xué)相互作用(p-i)”。一些研究通過檢測免疫藥物反應(yīng)患者的 T 細(xì)胞克隆表型，一些藥物(包括磺胺甲惡唑、卡馬西平、阿巴卡韋、和青霉素)已被證明可以與MHC直接產(chǎn)生相互作用并刺激活化T細(xì)胞?？顾幙贵w的相關(guān)研究或許有助于DILI的檢測，未來可能為DILI生物標(biāo)志物的研究帶來新的見解。

七、藥物淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(LTT)在DILI診斷中的意義

日本早在1978年根據(jù)過敏特異質(zhì)性DILI的發(fā)病機(jī)制，提出了藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗(DLST)，與后來在DILI診斷中使用的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗(LTT)實質(zhì)上并無區(qū)別。LTT 是一種體外淋巴細(xì)胞增殖試驗。試驗人員用氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)對來自可能因藥物引起的DILI患者的外周血單個核細(xì)胞 (PBMC) 進(jìn)行DNA標(biāo)記，并與可能導(dǎo)致DILI的藥物共同孵育，最后測量淋巴細(xì)胞增殖水平以判斷是否藥物引起特異性免疫反應(yīng)。

近年來，多項臨床試驗或分析正在不斷證明DLST或LTT在DILI中的診斷價值。一項前瞻性分析研究收集了日本27家醫(yī)院2010年至2018年間的307例(男125例，女182例)DILI患者數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示59%的病例接受了DLST，48%的病例呈陽性[26]。2021年，在一項通過主動藥物警戒計劃檢測 COVID-19 患者DILI的研究中，10例患者接受了 LTT，其中 8 例(80%)對可疑藥物獲得了陽性結(jié)果，且所有獲得陽性結(jié)果的藥物的 RUCAM 評分均≥4；同時羥氯喹和阿奇霉素作為COVID-19治療常用藥，是該研究中出現(xiàn)LTT結(jié)果陽性最多的藥物[27]。對于其他藥物超敏反應(yīng)，例如抗結(jié)核藥物(ATD)的患者出現(xiàn)皮膚超敏反應(yīng)，也可在LTT中觀察到陽性增殖，可分離出異煙肼/利福平特異性T細(xì)胞以證明藥物相關(guān)超敏反應(yīng)的潛在機(jī)制。臨床上也有單病例采用了LTT和Roussel Uclaf 因果關(guān)系評估方法 (RUCAM) 同時進(jìn)行因果關(guān)系建立進(jìn)行嘗試[28]。該患者服用糖尿病藥物伊格列凈(Ipragliflozin)后出現(xiàn)ALT和ALP的升高，LTT結(jié)果顯示為陽性。

日本肝病學(xué)會在2004年的日本消化疾病周(DDW-Japan)將LTT納入RUCAM因果關(guān)系的判定項目。一項2022年的研究評估了LTT在DILI中協(xié)助更新RUCAM評估方法的效用，研究結(jié)果證明了LTT對于RUCAM的評估方法確實能加強(qiáng)其因果關(guān)系評估效用(尤其是針對本身容易導(dǎo)致DILI的藥物和肝細(xì)胞表型的DILI)，其中149種藥物中有46種出現(xiàn)LTT陽性，45例DILI患者中出現(xiàn)34例(75.5%)LTT實驗結(jié)果陽性，且沒有實驗對照組LTT陽性，結(jié)果表明LTT的敏感度為77%，特異性為100% (SI的最佳截斷值為1.95，AUC0.91; 95%CI0.84～0.97;P<0.001)[29]。

盡管LTT作為一個很有潛力的臨床指標(biāo)，但FDA因缺乏多地區(qū)、可重復(fù)數(shù)據(jù)的原因尚未批準(zhǔn)。也有學(xué)者對其存在一定質(zhì)疑，例如2002年一項包含了從1979年至1999年2 496例漢方相關(guān)肝損傷的回顧性研究中，研究者在不參考LTT結(jié)果的情況下，評估了漢方藥物的使用與肝損傷發(fā)生之間是否存在因果關(guān)系[30]。而研究者分析得出的“絕對無關(guān)”組中的大多數(shù)患者對可疑漢方藥的 LTT 呈陽性，表明根據(jù) LTT 對漢方藥物性肝損傷進(jìn)行診斷尚不可行。

八、總結(jié)與展望

較為傳統(tǒng)的DILI生物標(biāo)志物當(dāng)前在臨床上主要用于評估DILI的嚴(yán)重程度，而eDISH、DILIsym、RO2等數(shù)學(xué)模型嘗試基于傳統(tǒng)DILI生物標(biāo)志物去判斷藥物肝毒性潛力。但這些傳統(tǒng)生物標(biāo)志物具有其本身的局限性，例如肝臟特異性低、無法在疾病造成實質(zhì)性肝損傷之前準(zhǔn)確提示疾病的發(fā)生。GLDH、SDH、GST等新的蛋白標(biāo)志物相較于ALT都在不同程度上提高了敏感性和特異性，其中HMGB1、CK-18由于其反應(yīng)更快、特異性更高并且與DILI預(yù)后更相關(guān)而更加受到關(guān)注。轉(zhuǎn)錄相關(guān)的miRNA以及包裹miRNA的外泌體都具備DILI候選生物標(biāo)志物的潛力，尤其是miRNA-122已經(jīng)被證明比ALT更高的特異性，但其對特異性DILI的臨床意義以及外泌體形式的miRNA的診斷價值需要后續(xù)更多研究進(jìn)行確認(rèn)。從基因組學(xué)的角度，目前已有至少10種HLA基因型被證明與DILI相關(guān)，同時一些非HLA位點的突變尤其是一些生物標(biāo)志基因組合同樣被證明具有DILI的預(yù)測潛力。LTT或許是一個有潛力的臨床指標(biāo)，并且確實能加強(qiáng)RUCAM因果關(guān)系評估效用，其局限性在于目前尚缺乏多地區(qū)、可重復(fù)數(shù)據(jù)提供有力支撐。

綜上所述，目前新的DILI生物標(biāo)志物已經(jīng)有相較于傳統(tǒng)標(biāo)志物更加高的敏感性與特異性，在后續(xù)更多的基礎(chǔ)與臨床研究的支持下或許能夠逐步完善DILI的實驗室診斷，增強(qiáng)臨床DILI預(yù)測能力，進(jìn)一步降低用藥后肝臟不良事件的發(fā)生率。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。