高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定水產(chǎn)品中的游離甘氨酸

黃柳霞，鄭陸紅，張慧瓊，林潔娜，羅雪燕

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511446；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511446；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511446）

甘氨酸（Gly），又名氨基乙酸，是一種非必需氨基酸，化學(xué)式為C2H5NO2[1]。固態(tài)的甘氨酸為白色至灰白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭，無(wú)毒，在水中易溶，微溶于乙醇、醚等[2]。甘氨酸在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3]。甘氨酸具有呈味、抑菌、螯合、防氧化作用，在食品中起改善味質(zhì)、防止油脂氧化、調(diào)和咸味、增加甜味的功能。近年來(lái)甘氨酸又用作氨基酸農(nóng)藥，1973年德國(guó)化學(xué)家斯密司制成的N-磷酸甲酯甘氨酸是一種有效的除草劑，每10 000 m2使用1.5 kg即可消滅雜草[4]。在醫(yī)藥方面，甘氨酸與阿斯匹林、撲熱息痛等反應(yīng)制得的藥物不僅可提高藥物的溶解度增加藥效，還有效抑制了藥物產(chǎn)生的副作用[5]。目前，現(xiàn)代社會(huì)對(duì)甘氨酸的用量需求不斷增大，尋找甘氨酸的合適來(lái)源意義重大。甘氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要為氯乙酸氨解法和施特雷克法2種，中國(guó)主要采用氯乙酸氨解法進(jìn)行生產(chǎn)甘氨酸[6]，但工業(yè)生產(chǎn)方法往往成本消耗較高，提取率不理想，易產(chǎn)生污染物等，故尋找天然游離甘氨酸資源是一個(gè)有效的解決途徑。新鮮水產(chǎn)品中氨基酸類(lèi)物質(zhì)含量豐富，游離甘氨酸在各種新鮮水產(chǎn)品中含量不同。目前關(guān)于水產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)定鮮見(jiàn)報(bào)道，常見(jiàn)的檢測(cè)方法有離子交換色譜法、氨基酸法、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[7]，較少見(jiàn)使用高效液相色譜-二極陣列管檢測(cè)法。同時(shí)常見(jiàn)的柱前衍生法使用鄰苯二甲醛作為衍生劑，此方法雖衍生時(shí)間短，但衍生后物質(zhì)極其不穩(wěn)定[8]，無(wú)法很好地準(zhǔn)確測(cè)定目標(biāo)物。本文試圖通過(guò)采用丹磺酰氯作為衍生劑[9]，采用柱前衍生的方法對(duì)水產(chǎn)品中的游離甘氨酸進(jìn)行衍生，運(yùn)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，同步結(jié)合查看光譜進(jìn)行定性定量。本文采用該法擬直接檢測(cè)各類(lèi)新鮮水產(chǎn)品游離甘氨酸的含量，為尋找含量豐富的甘氨酸資源及甘氨酸的利用提供了方向。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.8%），上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙腈（色譜純），廣州市泛宏貿(mào)易有限公司；丹磺酰氯（色譜純），上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、濃鹽酸、碳酸鈉、乙酸鈉、乙酸銨、鹽酸甲胺均為分析純，廣州市廣聯(lián)津化工有限公司；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

本實(shí)驗(yàn)所用的新鮮水產(chǎn)品（魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、蝦類(lèi)）均從廣州水產(chǎn)市場(chǎng)采購(gòu)。

1260 LC高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測(cè)器），安捷倫科技有限公司；LA8080氨基酸分析儀，HITACHI；智能型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器設(shè)備有限公司；溫度計(jì)，翼州市耀華器械儀表廠。

1.2 試劑的配制

1.2.1 15 g/100 mL亞鐵氰化鉀溶液

稱(chēng)取15 g亞鐵氰化鉀，加水溶解，用水定容至100 mL。

1.2.2 30 g/100 mL乙酸鋅溶液

稱(chēng)取30 g乙酸鋅，加水溶解，用水定容至100 mL。

1.2.3 1 mol/L鹽酸溶液

吸取9 mL鹽酸，用水稀釋至100 mL。

1.2.4 碳酸鈉緩沖溶液（pH = 9.5）（80 mmol/L）

稱(chēng)取0.424 g無(wú)水碳酸鈉，加40 mL水溶解，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至9.5，用水定容至50 mL。

1.2.5 1.5 mg/mL丹磺酰氯溶液

稱(chēng)取0.15 g丹磺酰氯溶于100 mL乙腈中。

1.2.6 2 g/100 mL鹽酸甲胺溶液

稱(chēng)取0.2 g鹽酸甲胺，加水稀釋至10 mL。

1.2.7 0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH = 4.2）稱(chēng)取0.820 g乙酸鈉，加800mL水溶解稀釋?zhuān)右宜嵴{(diào)pH至4.2，加水定至1 L，混勻后過(guò)0.45μm濾膜。

1.2.8 0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH = 7）

稱(chēng)取0.820 g乙酸鈉，加800 mL水溶解稀釋?zhuān)铀ㄖ? L，混勻后過(guò)0.45μm濾膜，測(cè)得pH為7。

1.2.9 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)取甘氨酸0.100 0 g 至100 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，即配制成1 000 μg/mL 的甘氨酸儲(chǔ)備液。

1.2.10 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液

將甘氨酸儲(chǔ)備液用水稀釋至濃度為1、5、10、20、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理樣品中游離甘氨酸經(jīng)水提取、乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白后，樣液經(jīng)丹磺酰氯衍生，其衍生物經(jīng)高效液相色譜儀分離，用二極陣列管檢測(cè)器檢測(cè)。

1.3.2 試樣提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5～2.0 g 試樣于三角錐形瓶，加入40 mL 40 ℃水，渦旋混勻1 min 使試樣分散，40 ℃超聲20 min，冷卻至室溫后，分別加入1 mL乙酸鋅溶液和1 mL亞鐵氰化鉀溶液，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，加水定容至刻度，混勻，樣液8 000 r/min離心5 min，上清液待用（注意：當(dāng)樣品含量過(guò)高時(shí)，需在衍生前進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂屘幚砗笤龠M(jìn)行衍生操作，避免衍生不完全）。

1.3.3 衍生處理

分別取1 mL樣液和1 mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL比色管，加入1 mL碳酸鈉緩沖液，1 mL丹磺酰氯溶液，充分混勻，室溫下避光衍生2 h后加入0.1 mL鹽酸甲胺溶液混勻，終止反應(yīng)。樣液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3.4 標(biāo)樣或樣品比對(duì)處理

標(biāo)樣或樣品在不同的pH流動(dòng)相、波長(zhǎng)、提取溫度、超聲時(shí)間、稱(chēng)量質(zhì)量、儀器比對(duì)處理方法如下。

不同pH流動(dòng)相比對(duì)處理：將標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（1.2.10）按1.3.3衍生處理后分別通過(guò)1.3.5的流動(dòng)相1、2（詳見(jiàn)1.3.5），其他條件同1.3.5，進(jìn)行上機(jī)比對(duì)，同時(shí)樣品按1.3.2 和1.3.3 處理后，通過(guò)流動(dòng)相1，其他條件同1.3.5，上機(jī)比對(duì)。

波長(zhǎng)比對(duì)：將標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（1.2.10）按1.3.3衍生處理后分別設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為254、300、330 nm，其他條件同1.3.5，上機(jī)測(cè)定。

提取溫度比對(duì)：同一樣品分別在不同超聲溫度（30、40、50、60 ℃）下進(jìn)行提取，其他前處理?xiàng)l件同1.3.2及1.3.3，然后按1.3.5，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

超聲時(shí)間比對(duì)：同一樣品選擇在同一提取及超聲溫度（40 ℃）下進(jìn)行不同超聲時(shí)間（10、20、30 min）比對(duì)，其他前處理?xiàng)l件同1.3.2及1.3.3，然后按1.3.5進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

不同稱(chēng)重質(zhì)量比對(duì)：同一樣品分別稱(chēng)取不同梯度質(zhì)量（0.5、1.0、2.0 g），其他前處理?xiàng)l件同1.3.2及1.3.3，然后按1.3.5進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

不同儀器樣品結(jié)果比對(duì)：隨機(jī)選取水產(chǎn)品中常見(jiàn)的貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蝦試樣（1.1），樣品按1.3.2處理后樣液上氨基酸分析儀，氨基酸分析儀條件參考GB 5009.124-2016[10]。同時(shí)取部分樣液按1.3.3處理后按1.3.5上高效液相色譜儀上機(jī)測(cè)定。

1.3.5 高效液相色譜條件

色譜柱：AQ C18 4.6 mm×250 mm，5μm。

流動(dòng)相1：乙腈+0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH=4.2）（1.2.7）=3+7。

流動(dòng)相2：乙腈+0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH=7）（1.2.8）=3+7。

流速：1.0 mL/min。

柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：20μL。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解后，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，衍生處理后上機(jī)測(cè)試，計(jì)算、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH流動(dòng)相甘氨酸出峰情況

按1.3.4將標(biāo)樣和樣品在不同pH流動(dòng)相下上機(jī)比對(duì)（見(jiàn)圖1～3）。從圖1和圖2可看出，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈的比例保持不變，流動(dòng)相中的乙酸鈉溶液分別在pH 為4.2 和pH 為7，甘氨酸出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)為8.7 min 和5.8 min，即乙酸鈉溶液pH為7時(shí)，甘氨酸的出峰時(shí)間更早。從圖1和圖3則可看出，樣品也按1.3.5的流動(dòng)相1條件上機(jī)測(cè)試，樣品中甘氨酸出峰時(shí)間8.7 min與標(biāo)準(zhǔn)溶液甘氨酸一樣，樣品中的甘氨酸可以很好地與雜質(zhì)峰分離。本實(shí)驗(yàn)還比對(duì)了當(dāng)乙腈更換為甲醇時(shí)，同樣的比例下甘氨酸出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響檢測(cè)效率。故本文選擇乙腈+0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH=4.2）=3+7（1.2.7）為流動(dòng)相。

圖1 流動(dòng)相pH=4.2甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 1 Chromatogram of glycine standard solution in mobile phase pH= 4.2

圖2 流動(dòng)相pH=7甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 2 Chromatogram of glycine standard solution in mobile phase pH= 7

圖3 流動(dòng)相pH=4.2甘氨酸樣品色譜圖Figure 3 Chromatogram of glycine sample in mobile phase pH= 4.2

2.2 波長(zhǎng)比對(duì)

甘氨酸標(biāo)液按1.3.4 處理后，分別設(shè)置不同的檢測(cè)波長(zhǎng)，其他同1.3.5。由表1 可知，甘氨酸在不同波長(zhǎng)下響應(yīng)程度不同，當(dāng)波長(zhǎng)設(shè)置在300 nm 或330 nm時(shí)，甘氨酸的響應(yīng)偏低，不利于低濃度樣品的測(cè)定，而在254 nm 波長(zhǎng)下有很好的響應(yīng)，故本實(shí)驗(yàn)儀器參數(shù)的波長(zhǎng)選擇254 nm。

表1 不同波長(zhǎng)下50 μg/mL甘氨酸標(biāo)液的響應(yīng)Table 1 Response of 50 μg/mL glycine standard solution at different wavelengths

2.3 提取溫度比對(duì)

同一樣品分別在不同超聲溫度（30、40、50、60 ℃）下進(jìn)行提取，其他前處理?xiàng)l件同1.3.2 及1.3.3。樣品甘氨酸的檢測(cè)結(jié)果表明，在提取及超聲溫度為40 ℃時(shí)最佳，故本實(shí)驗(yàn)前處理中選擇提取溶劑水和超聲溫度為40 ℃（見(jiàn)表2）。

表2 同一樣品不同溫度下甘氨酸的檢測(cè)值Table 2 The detection value of glycine in the same sample at different temperatures

2.4 超聲時(shí)間比對(duì)

同一樣品選擇在同一提取及超聲溫度（40 ℃）下進(jìn)行不同超聲時(shí)間（10、20、30 min）比對(duì)，其他前處理?xiàng)l件同1.3.2及1.3.3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲時(shí)間是20 min時(shí)，樣品中甘氨酸的提取效果更佳（見(jiàn)表3），故本實(shí)驗(yàn)前處理選擇超聲20 min。

表3 同一樣品不同超聲時(shí)間下甘氨酸的檢測(cè)值Table 3 The detection value of glycine in the same sample with different ultrasonic time

2.5 不同稱(chēng)重質(zhì)量比對(duì)

同一樣品分別稱(chēng)取不同梯度質(zhì)量，按同樣的前處理?xiàng)l件（1.3.2 及1.3.3）進(jìn)行后上機(jī)測(cè)定，查看其結(jié)果比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。樣品中甘氨酸的結(jié)果相差不大，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%。故本文實(shí)驗(yàn)樣品前處理稱(chēng)量范圍選擇0.5～2.0 g，若樣品含量過(guò)低時(shí)，可考慮增大樣品稱(chēng)重質(zhì)量，使其濃度范圍落在1～50μg/mL范圍內(nèi)。

表4 同一樣品不同稱(chēng)重質(zhì)量下甘氨酸的檢測(cè)值Table 4 The detection value of glycine under different weights of the same sample

2.6 不同儀器樣品結(jié)果比對(duì)

隨機(jī)選取水產(chǎn)品中常見(jiàn)的貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蝦試樣（1.1）同步進(jìn)行高效液相色譜儀與氨基酸分析儀測(cè)定，其中樣品按1.3.2 處理后樣液上氨基酸分析儀，氨基酸分析儀條件參考GB 5009.124-2016[10]。從表5 可知，2種儀器甘氨酸的檢測(cè)值相對(duì)偏差均在10%范圍內(nèi)，可見(jiàn)本文的高效液相色譜法可作為日常方法檢測(cè)的補(bǔ)充方法，其有檢測(cè)時(shí)間更短的優(yōu)勢(shì)。

表5 高效液相色譜儀與氨基酸分析儀測(cè)定樣品甘氨酸的檢測(cè)值比對(duì)Table 5 Comparison of detection values of glycine in samples by highperformance liquid chromatography and amino acid analyzer

2.7 線性范圍、加標(biāo)回收率和檢出限

按確定的方法進(jìn)行測(cè)定，以甘氨酸含量為橫坐標(biāo)，以甘氨酸的峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘氨酸在1～50 μg/mL 成線性關(guān)系（見(jiàn)表6 及圖5），相關(guān)系數(shù)R= 0.999 99；對(duì)水產(chǎn)品樣品進(jìn)行加標(biāo)，在樣品檢出量1/2、1、2 倍范圍進(jìn)行加標(biāo)，回收率為90.4%～101.0%；相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.5%～3.3%，見(jiàn)表7；根據(jù)大于3 倍信噪比確定檢出限，將樣液稀釋至1 μg/mL，其信噪比為9.1，得出甘氨酸的檢出限為50 mg/kg。該方法方便、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確，可很好地實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)定。

表7 回收率和精密度Table 7 Recovery and precision

圖5 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Glycine standard curve

表6 線性回歸方程Table 6 The regression equations

2.8 市售水產(chǎn)品類(lèi)樣品甘氨酸含量普查情況

隨機(jī)檢測(cè)了市售常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、蝦類(lèi)新鮮水產(chǎn)品，由圖6可知，不同新鮮水產(chǎn)品中甘氨酸的含量均不同，高的約10 000 mg/kg，最低的約60 mg/kg，檢測(cè)的這幾類(lèi)水產(chǎn)品中，蝦類(lèi)中甘氨酸的含量普遍最豐富，貝類(lèi)次之，魚(yú)類(lèi)普遍較低。

圖6 市售水產(chǎn)品類(lèi)樣品中甘氨酸含量Figure 6 Glycine content in commercial aquatic product sample

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：樣品稱(chēng)取0.5～2 g，加40 ℃水，40 ℃超聲20 min提取，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白，樣液經(jīng)丹磺酰氯衍生后，經(jīng)C18色譜柱，以乙腈+0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH=4.2）=3+7（1.2.7）作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，利用高效液相色譜法-二極管陣列器進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。甘氨酸出峰時(shí)間適宜，可以和其他雜質(zhì)峰完整分離，并有很好的響應(yīng)。本方法線性范圍為1～50μg/mL，檢出限為50 mg/kg，回收率為90.4%～101.0%。本方法方便、快捷、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短，能很好地實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)定。經(jīng)檢測(cè)的36 個(gè)市售常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、蝦類(lèi)新鮮水產(chǎn)品樣，蝦類(lèi)中甘氨酸的含量普遍最豐富，貝類(lèi)次之，魚(yú)類(lèi)普遍較低。本文研究一方面可作為氨基酸分析儀法的補(bǔ)充檢測(cè)方法，有檢測(cè)時(shí)間更短的優(yōu)勢(shì)，另一方面為新鮮水產(chǎn)品中豐富的甘氨酸資源的利用提供了相關(guān)方向。