高效液相色譜法同時測定蜂王漿口服液中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸方法研究

黃柳霞，陳 茹，張 琴，陳麗香，馮志強

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511446；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511446；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗站，廣東 廣州 511446）

蜂王漿又稱王漿、蜂乳、蜂皇漿，是工蜂舌腺和上顎腺分泌的乳狀物質(zhì)[1]，含有多種氨基酸和糖類物質(zhì)，是集營養(yǎng)、食療及保健多功效為一體的天然物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及護膚美容等多方面藥理作用[2]。5-羥甲基糠醛（C6H6O3）是由葡萄糖和果糖等化合物在高溫或酸性條件下部分脫水生成的具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的醛類化合物[3]?，F(xiàn)有研究表明，5-羥甲基糠醛對人體有潛在的危害，攝入過量的5-羥甲基糠醛可能會造成橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，對人體有致敏性、致癌性、神經(jīng)毒性、基因毒性等副作用[4-5]。10-羥基-2-癸烯酸（C10H18O3）是蜂王漿中的主要功效成分，無法進行人工合成[6]。中國的蜂王漿出口和生產(chǎn)量占全世界的90%[7]。蜂王漿口服液是以蜂王漿為原料，經(jīng)與其他成分配比后生產(chǎn)的相關制品，具有免疫調(diào)節(jié)的保健功能，深受現(xiàn)代消費者青睞。目前常使用高效液相色譜法檢測蜂王漿、蜂王漿凍干粉中10-羥基-2-癸烯酸含量；而高效液相色譜法、液相色譜/質(zhì)譜法和氣相色譜/質(zhì)譜法是檢測蜂蜜、乳與乳制品、葡萄酒、飲料的5-羥甲基糠醛的主要方法?，F(xiàn)有的檢測方法不能對蜂王漿口服液中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的同時檢測，因此建立一種同時測定蜂王漿口服液中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的方法，一方面有助于評價蜂王漿口服液新鮮度，在貯藏、加工條件控制中起重要作用；另一方面可為蜂王漿及相關制品的質(zhì)量把控提供更快捷的方法，大大提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；智能型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器設備有限公司；5-羥甲基糠醛標準物質(zhì)，北京振翔科技有限公司，純度≥97%；10-羥基-2-癸烯酸標準物質(zhì)，北京振翔科技有限公司，純度≥98%；甲醇（色譜純），廣州泛宏貿(mào)易有限公司；濃鹽酸（優(yōu)級純），廣州市廣聯(lián)津化工有限公司；去離子水符合GB/T 6682。

1.2 試劑的配制

1.2.1 0.01 mol/L鹽酸溶液

取0.9 mL濃鹽酸加水稀釋至1 000 mL。

1.2.2 流動相溶液

取550 mL甲醇、450 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液混勻。

1.2.3 5-羥基糠醛儲備液

稱取5-羥甲基糠醛0.010 00 g至10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即配成含1 000μg/mL 的5-羥甲基糠醛儲備液。

1.2.4 10-羥基-2-癸烯酸儲備液

稱取10-羥基-2-癸烯酸0.010 00 g至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即配成1 000μg/mL的10-羥基-2-癸烯酸儲備液。

1.2.5 5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸混標中間液

分別吸取1.00 mL 5-羥甲基糠醛儲備液、1.00 mL 10-羥基-2-癸烯酸儲備液至10 mL容量瓶，加甲醇稀釋定容至刻度，即配成100μg/mL的混標中間液。

1.2.6 5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸混標使用液

分別吸取0.050、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000 mL混標中間液至10 mL容量瓶，加流動相稀釋至刻度，即得濃度為0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/mL的混標使用液。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

蜂王漿口服液試樣，稱樣前搖勻樣液，稱取試樣0.5～1.0 g（精確至0.001 g）至10 mL容量瓶，加入4.5 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液，渦旋混勻，再加入適量甲醇，混勻，超聲10 min，冷卻至室溫，加甲醇定容至刻度，混勻，吸取樣液用0.45μm有機濾膜壓濾上機。

1.3.2 標樣或樣品比對處理

標樣處理：將標液濃度為20μg/mL的10-羥基-2-癸烯酸在不同時間（第1～4 d）進行測定；

樣品比對處理：同一樣品在不同超聲時間（10、20、30 min）下，其他前處理條件同1.3.1。5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的混標分別通過流動相稀釋、甲醇稀釋、乙醇稀釋后上機比對。

1.4 儀器條件

色譜柱：AQC18250 mm×4.6 mm,5μm。流動相：甲醇+0.01 mol/L 鹽酸溶液=55+45。流速：1.0 mL/min。波長：0～6 min為285 nm，6～15 min為210 nm。（實際可結(jié)合2個目標峰出峰時間進行調(diào)整）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間測定同一瓶10-羥基-2-癸烯酸標液（20 μg/mL）的峰面積情況

內(nèi)標法檢測10-羥基-2-癸烯酸是標準的檢測方法，多是以對羥基苯甲酸甲酯為內(nèi)標[1][8]。而本文通過不同時間測定同一瓶標液，觀察了10-羥基-2-癸烯酸儲備液峰面積的變化，在幾天時間內(nèi)多次上機測定，發(fā)現(xiàn)10-羥基-2-癸烯酸儲備液峰面積無太大變化（見表1），RSD值為3.0%，故本文采用外標法定量。

表1 不同時間測定同一瓶10-羥基-2-癸烯酸標液（20 μg/mL）的峰面積Table 1 Determination of Peak areas of the same bottle of 10-hydroxy-2-decenoic acid standard solution(20 μg/mL)at different time

2.2 超聲時間比對

在同一前處理條件下，分別通過設置不同超聲時間10、20、30 min，測定同一樣品中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的含量，發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的含量并無太大的波動（見表2），其對應的RSD值均在5%范圍內(nèi)，故本文選擇了10 min的超聲時間，以實現(xiàn)更高效率的檢測。

表2 同一樣品在不同超聲時間后測定的含量Table 2 The content of the same sample measured after different ultrasonic time

2.3 流動相比對

從圖1～3標樣的出峰可以清晰看出，使用流動相稀釋標液得到的標樣峰型正常。用甲醇稀釋的標液目標峰均出現(xiàn)了峰寬變大，峰前沿拖尾。用乙醇稀釋的標液則出現(xiàn)了5-羥甲基糠醛峰分叉，峰寬變大；10-羥基-2-癸烯酸峰寬變大，峰型不佳。故結(jié)合實驗情況，選擇了以流動相溶液稀釋標液進行外標法定量。

圖1 流動相稀釋標液高效液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatography of mobile phase dilution standard solution

2.4 方法線性范圍、檢出限及定量限、標樣重復性和樣品加標回收率

按確定的方法進行測定，分別以5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸含量為橫坐標，5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的峰面積為縱坐標，作出標準曲線。實驗結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸均在0.5～20μg/mL 范圍內(nèi)成線性關系（見表3），5-羥甲基糠醛相關系數(shù)R= 0.999 97，10-羥基-2-癸烯酸相關系數(shù)R=0.999 95；其中標曲最低點0.5μg/mL的10-羥基-2-癸烯酸和5-羥甲基糠醛信噪比分別為40.2、10.8，根據(jù)大于3倍和10倍信噪比確定檢出限和定量限，得出10-羥基-2-癸烯酸和5-羥甲基糠醛的檢出限及定量限均為5 mg/kg。標曲最低濃度點0.5μg/mL重復進樣6次，峰面積見表4，其中5-羥甲基糠醛的RSD數(shù)值為1.5%，10-羥基-2-癸烯酸的RSD數(shù)值為1.7%。5-羥甲基糠醛回收率為89.4%～103.0%，相關標準偏差（RSD）為0.98%～2.10%；10-羥基-2-癸烯酸回收率為88.9%～102.0%，相關標準偏差（RSD）為0.57%～2.80%（見表5）。該方法方便、靈敏度高、定性定量準確，可很好地實現(xiàn)蜂王漿口服液中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸的測定。

表3 線性回歸方程Table 3 Linear regression equation

表4 標點0.5 μg/mL重復測定6次的峰面積情況Table 4 The peak area of 0.5 μg/mL ofter repeated determination of 6 times

表5 回收率和精密度Table 5 Recovery and precision

圖2 甲醇稀釋標液高效液相色譜圖Figure 2 HPLC chromatography of methanol diluted standard solution

圖3 乙醇稀釋標液高效液相色譜圖Figure 3 HPLC chromatography of the ethanol diluted standard solution

2.5 市售蜂王漿口服液中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸檢出結(jié)果

由表6可見，目前隨機抽查的市售部分蜂王漿口服液均檢出不同數(shù)值的10-羥基-2-癸烯酸，反映不同產(chǎn)品中10-羥基-2-癸烯酸含量有較大差異性；大部分產(chǎn)品均檢出有5-羥甲基糠醛，一定程度上反映了產(chǎn)品的不同新鮮程度，增加了產(chǎn)品的貯藏條件的理論依據(jù)。

表6 蜂王漿口服液中5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸檢出結(jié)果Table 6 Detection of 5-hydroxymethylfurfural and 10-hydroxy-2-decenoic acid in royal jelly oral liquid

3 結(jié)論

采用0.01 mol/L的鹽酸溶液和甲醇溶解蜂王漿口服液并沉淀蛋白質(zhì)后超聲提取10 min，以甲醇（55%）+0.01 moL/L鹽酸溶液（45%）為流動相，檢測波長280 nm（5-羥甲基糠醛）及210 nm（10-羥基-2-癸烯酸），經(jīng)高效液相色譜法可同時測定5-羥甲基糠醛和10-羥基-2-癸烯酸2種物質(zhì)。該方法以出峰時間定性，以外標法定量，方便，快捷，靈敏度高，適用于蜂王漿其他相關產(chǎn)品，為蜂王漿及相關制品的質(zhì)量把控提供了可行的檢測方法。