高效液相色譜法檢測肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵液中的3-羥基丙酸

田 甜，張 炎，平文祥，葛菁萍, b, *

(黑龍江大學(xué) a．生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080; b．農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500)

0 引 言

3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)碳骨架的兩端分別為一個(gè)羧基和一個(gè)羥基，化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡涑善窞闊o色、無味的油狀液體[1]。3-HP通過氧化、還原、脫水、酯化反應(yīng)等可合成多種重要的化學(xué)物質(zhì)，還可作為食品或飼料的添加劑和防腐劑，是一種應(yīng)用價(jià)值極高的有機(jī)化合物[2-4]。3-HP的合成分為化學(xué)合成法和生物合成法，相對(duì)于化學(xué)合成法來說，生物合成法可避免化學(xué)合成法所帶來的弊端，更具有發(fā)展?jié)摿5]。微生物生產(chǎn)3-HP的途徑主要以葡萄糖、甘油和CO2為底物。其中，以甘油為底物的生產(chǎn)方式因其具有簡單的代謝途徑、底物廉價(jià)及無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)[6]，是最利于工業(yè)化生產(chǎn)的途徑。

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，生長速度快，在有氧和厭氧條件下均可以甘油作為唯一的碳源生長[7-8]。由于K.pneumoniae自身存在著完整的維生素B12合成體系，可在厭氧條件下合成維生素B12，天然產(chǎn)生的維生素是用于合成商業(yè)上重要的化學(xué)品3-HP的必需輔助因子[9-11]。因此，近年來對(duì)K.pneumoniae生產(chǎn)3-HP的研究逐漸增多[12]。K.pneumoniae利用甘油生產(chǎn)3-HP的過程中，常伴有乳酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，然而3-HP與乳酸為同分異構(gòu)體，性質(zhì)相近。在利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測3-HP產(chǎn)量時(shí)，常會(huì)遇到兩者色譜峰重疊、難以有效檢測3-HP 產(chǎn)量的問題[13]。通過選擇與優(yōu)化HPLC的檢測條件來有效分離3-HP和乳酸混合標(biāo)樣是非常重要的。Su M Y等[14]利用HPLC對(duì)K.pneumoniaeDSM 2026發(fā)酵液中的3-HP進(jìn)行分離與檢測，準(zhǔn)確度高、檢測效果好。但關(guān)于選擇與優(yōu)化HPLC的檢測條件來有效分離3-HP和乳酸的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。

本文通過選擇與優(yōu)化HPLC的檢測條件，建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確度高的檢測方法，不僅提高了3-HP的檢測效率和檢測精度，還可以準(zhǔn)確檢測發(fā)酵過程中產(chǎn)物的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

K.pneumoniaeHD67，由黑龍江大學(xué)微生物省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，pH調(diào)整為7.0，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油20，酵母粉3，磷酸二氫鉀1.3，磷酸氫二鉀3.4，硫酸銨4，硫酸鎂0.5，碳酸鈣0.1，微量元素1.25 mL，pH值調(diào)至7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀LC20A(日本島津)；美國伯樂HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm)；依特利C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)選擇HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm)和C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，探究色譜柱類型對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的影響。選擇5 mmol·L-1H2SO4和5 mmol·L-1H3PO4，探究流動(dòng)相種類對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其及分離效果的影響。在流動(dòng)相中常加的2種有機(jī)相：乙腈和甲醇，分別配制成1%、5%和10%的相應(yīng)溶液，探究有機(jī)相的添加對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的影響。選擇4種流速：0.4 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1，探究不同流動(dòng)相流速對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的影響。選擇5種柱溫：35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃和75 ℃，探究色譜柱柱溫對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的影響。在最優(yōu)HPLC條件下，對(duì)同一發(fā)酵液連續(xù)進(jìn)樣5次檢測，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)。在最優(yōu)HPLC條件下，對(duì)同一濃度發(fā)酵液分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣1次檢測，對(duì)其RSD值進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱對(duì)檢測條件的影響

通過HPX-87H色譜柱和C18色譜柱對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的比較研究，結(jié)果見表1。雖然HPX-87H色譜柱和C18色譜柱均可分離檢測3-HP和乳酸混合標(biāo)樣，但是HPX-87H色譜柱的分離度超過2.0，而且在實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定性較高。因此，色譜柱型號(hào)選擇為HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

2.2.1 流動(dòng)相對(duì)檢測條件的影響

通過對(duì)5 mmol·L-1H2SO4和5 mmol·L-1H3PO4兩種流動(dòng)相對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的比較研究，結(jié)果見表2。混標(biāo)的分離度在流動(dòng)相為5 mmol·L-1H2SO4時(shí)達(dá)到最好為2.367。因此，選擇流動(dòng)相為H2SO4。

表1 不同色譜柱下3-HP的保留時(shí)間及分離效果

表2 不同流動(dòng)相下3-HP的保留時(shí)間及分離效果

2.2.2 有機(jī)相對(duì)檢測條件的影響

通過對(duì)添加不同種類有機(jī)相對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的比較研究，結(jié)果見表3。添加5%和10%的乙腈以及1%的甲醇時(shí)檢測不到混合標(biāo)樣的色譜峰，而1%的乙腈的分離效果很差。隨著甲醇濃度的上升，混標(biāo)的分離度先上升(1.763)后降低(1.025)。然而分離度最好的條件下較不添加有機(jī)相時(shí)的分離度差(表2，2.367)。因此，選擇不添加有機(jī)相。

2.3 流速和柱溫的選擇

2.3.1 流速對(duì)檢測條件的影響

表3 不同有機(jī)相下3-HP的保留時(shí)間及分離效果

一般情況下，在相同的溫度，隨著流速越低，混標(biāo)的分離效果越好，但色譜柱的柱壓也越來越低，其測樣時(shí)間也會(huì)變長。通過不同流速對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的比較研究，結(jié)果見表4。流速為1.0 mL·min-1時(shí)，測樣時(shí)間為12 min且最短，混標(biāo)的分離度較好，但是色譜柱的柱壓較高，且在實(shí)際檢測過程中，柱壓在短時(shí)間內(nèi)迅速升高，流速為0.8 mL·min-1時(shí)也具有同樣的問題；流速為0.4 mL·min-1時(shí)，低流速引起分析時(shí)間過長。綜上，流速選擇0.6 mL·min-1。

表4 不同流速下3-HP的保留時(shí)間及分離效果

2.3.2 柱溫對(duì)檢測條件的影響

通過不同柱溫對(duì)3-HP的保留時(shí)間及其分離效果的比較研究，結(jié)果見表5。柱溫越高，混標(biāo)分離度越高，但溫度超過75 ℃時(shí)，檢測不到標(biāo)樣混合物的峰，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：3-HP受熱易分解，在較高的溫度下，分子結(jié)構(gòu)受到破壞。因此，本試驗(yàn)選擇柱溫65 ℃。

2.4 回歸分析、檢出限測定

根據(jù)3-HP標(biāo)準(zhǔn)曲線y=50 842x+61 665，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，說明線性關(guān)系良好。且以3倍

表5 不同柱溫下3-HP的保留時(shí)間及分離效果

信噪比(S/N)計(jì)算檢出限為5 μg·mL-1，表明檢測具有較高的靈敏度。

2.5 方法性能評(píng)價(jià)

2.5.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

HPLC檢測3-HP的精密度試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可見，對(duì)3-HP的色譜峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD結(jié)果為0.618%，表明此HPLC具有良好的精密度。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

HPLC檢測3-HP的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可見，根據(jù)3-HP的色譜峰面積計(jì)算RSD為0.773%，發(fā)酵液在8 h內(nèi)均具有良好的穩(wěn)定性，此分析方法可靠。

表6 HPLC檢測3-HP的精密度試驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，檢測3-HP的保留時(shí)間及分離效果的最佳色譜條件見表8。另外，獲得了3-HP的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=50 842x+61 665，r=0.999 8，說明此檢測條件具有選擇性和重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度和靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，適用于對(duì)接下來單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵過程及其代謝產(chǎn)物的檢測。

3 討 論

HPLC檢測成功的基礎(chǔ)是選擇一個(gè)合適的色譜柱，C18色譜柱固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，3-HP和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品極性大于流動(dòng)相極性，不宜使用此色譜柱[15]。當(dāng)選擇HPX-87H色譜柱時(shí)，3-HP和乳酸標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)品分離度高，且峰形完好。Jiang J Q等[9]采用HPLC，配備HPX-87H色譜柱測定K.pneumoniaeJJQ02發(fā)酵液中3-HP的產(chǎn)量。流動(dòng)相對(duì)改善3-HP和乳酸的分離效果也有重要的輔助效應(yīng)，流動(dòng)相是影響HPLC性能的重要因素，正確的選擇流動(dòng)相至關(guān)重要[16]。Chen Y等[17]采用HPLC，以0.5 mmol·L-1H2SO4為流動(dòng)相測定釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)代謝產(chǎn)物3-HP的產(chǎn)量。

表7 HPLC檢測3-HP的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表8 檢測3-HP含量的最佳色譜條件

此外，流速的大小直接關(guān)系到色譜柱柱壓及分析時(shí)間的變換。流速過低，則柱效差且分析時(shí)間長；流速過高，則柱壓高且分析時(shí)間短。因此，選擇適當(dāng)?shù)牧魉倮诒Ｗo(hù)色譜柱。詹元龍[18]利用HPLC，在0.6 mL·min-1的流速下，檢測分析大腸桿菌(Escherichiacoli)發(fā)酵液中3-HP產(chǎn)量。柱溫也是影響色譜柱柱效和混標(biāo)分離度的主要因素之一。隨著柱溫的升高，降低流動(dòng)相粘度，使有機(jī)酸在流動(dòng)相中發(fā)生解離平衡，能夠有效提高柱效;有機(jī)酸在離子狀態(tài)下不利于色譜柱對(duì)其分離，而且高溫會(huì)對(duì)色譜柱的內(nèi)部造成一定的損耗。Kumar V等[19]采用HPLC，在柱溫為65 ℃時(shí)，測定K.pneumoniaeJ2B代謝產(chǎn)物3-HP的產(chǎn)量。

HPLC法測定K.pneumoniae中3-HP產(chǎn)量的方法有所差異，差異主要表現(xiàn)在流動(dòng)相種類及其濃度、柱溫的不同，可能是所用儀器類型及型號(hào)和色譜柱的不同，在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，同樣的儀器、色譜柱及相同的條件，不同型號(hào)儀器的檢出效果差異很大。

4 結(jié) 論

K.pneumoniaeHD67中3-HP產(chǎn)量的最佳HPLC檢測條件為：色譜柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm, 5 μm)；流動(dòng)相5 mmol·L-1H2SO4，不加有機(jī)相；流動(dòng)相流速0.6 mL·min-1；柱溫65 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；檢測器為紫外檢測器(210 nm)。本研究建立HPLC檢測K.pneumoniaeHD67中3-HP產(chǎn)量的方法具有操作簡便、準(zhǔn)確度和靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，為后續(xù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)酵過程及其代謝產(chǎn)物的檢測提供了可供借鑒的技術(shù)支持。