一種簡便分離假禾谷鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基

徐建強，范蓉思媛，王 碩，羅詩瑤，韓 易，李建鋒，劉圣明

(1.河南科技大學 園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，河南 洛陽 471003)

0 引言

近十幾年，黃淮海地區(qū)廣泛推廣小麥-玉米秸稈還田技術。秸稈還田能提高小麥生育后期土壤酶活性，促進秸稈分解，提高土壤養(yǎng)分含量[1]，并能提高土壤蓄水保墑能力，促進小麥根系生長發(fā)育，提高產(chǎn)量[2]。但發(fā)病秸稈滯留在田間，導致病原菌菌量逐年累積，小麥土傳病害發(fā)生愈加嚴重[3]。主要由禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的小麥紋枯病，現(xiàn)已在河南各麥區(qū)普遍發(fā)生，且田間已出現(xiàn)了對防治藥劑敏感性下降的菌株[4]。主要由假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)侵染所致的小麥莖基腐病是中國黃淮海地區(qū)小麥生產(chǎn)中近幾年出現(xiàn)的一種新的土傳病害[5]。該病害從分蘗至成熟期均可為害，發(fā)病后會導致小麥莖基部近地面1～2段莖稈變褐腐爛，影響植株水分和無機鹽運輸，使其地上部分矮縮，嚴重時導致小麥枯白穗，影響小麥產(chǎn)量[6]。病菌產(chǎn)生的毒素盡管無法運輸?shù)禁溋?，但由小麥秸稈制成的動物飼料，卻仍存在潛在威脅[7]。小麥莖基腐病已被河北省和陜西省列為二類農(nóng)作物病蟲害[8-9]，而小麥紋枯病及小麥莖基腐病則同時被河南省和山東省列為二類農(nóng)作物病蟲害[10-11]。

對假禾谷鐮刀菌的分離、培養(yǎng)是進行小麥莖基腐病研究的第一步。作為一種新病害，目前國內(nèi)外對假禾谷鐮刀菌的分離大多采用傳統(tǒng)的組織分離法[12-13]。組織分離法廣泛應用于植物病原菌分離，在樣品較少時容易操作，但分離大量病原菌群體時組織分離法的諸多弊端便會顯現(xiàn)。鑒于此，多位研究者開發(fā)了分離病原菌的選擇性培養(yǎng)基，如分離棉花枯萎病菌[14]、黃萎病菌[15]、牡丹黃斑病菌[16]和小麥紋枯病菌[17]。本文以馬鈴薯蔗糖瓊脂(potato sucrose agar，PSA)培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，研究了硫酸鏈霉素、乙膦鋁、代森錳鋅和多菌靈對假禾谷鐮刀菌和常見的污染菌——青霉、曲霉和鏈格孢菌菌絲生長的影響，優(yōu)化了4種物質(zhì)使用時的質(zhì)量濃度，制備了一種可快速、大量分離假禾谷鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：小麥莖基腐病菌株SQYC-2，河南科技大學菌物資源及病害防控實驗室(以下簡稱實驗室)保存，2021年采用組織分離法自河南省商丘市虞城縣的小麥病株上分離，特異性引物擴增后鑒定為假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)；青霉菌株SQYCP-1，實驗室保存，分離假禾谷鐮刀菌時的污染菌，純化后鑒定為擴展青霉(Penicilliumexpansum)；曲霉SQYCAs-1，實驗室保存，分離假禾谷鐮刀菌時的污染菌，純化后鑒定為焦曲霉(Aspergillusustus)；鏈格孢SQYCAl-1，實驗室保存，分離假禾谷鐮刀菌時的污染菌，純化后鑒定為小麥生鏈格孢(Alternariatriticicola)。

供試藥劑。72%硫酸鏈霉素可溶性粉劑(soluble powder，SP)：河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司；70%代森錳鋅可濕性粉劑(wettable powder，WP)，陜西上格之路生物科學有限公司；80%乙膦鋁可濕性粉劑，美國世科姆公司。制劑均預溶于滅菌雙蒸水中，其中硫酸鏈霉素配成105μg/mL母液，代森錳鋅和乙膦鋁配成104μg/mL母液。98%多菌靈原藥：山東省雙星農(nóng)藥廠，預溶于0.1 mol/L稀鹽酸中，配成104μg/mL母液。所有母液均放入4℃冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 4種藥劑對假禾谷鐮刀菌及污染真菌菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法[18]。選取供試的4種藥劑，以PSA為基礎培養(yǎng)基，各設置6個質(zhì)量濃度(表1)，于平板中央分別接入直徑5 mm的供試菌株的新鮮菌餅，每處理重復3次，以不含藥劑的PSA平板上接種的菌餅為對照。25℃下培養(yǎng)3～5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑(mm)，按下式計算各質(zhì)量濃度處理時藥劑對菌絲生長的抑制率(%)。

菌絲生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑平均值-處理菌落直徑平均值)/(對照菌落平均值-菌餅直徑)]×100%。

1.2.2 供試藥劑的正交設計

利用正交設計篩選4種抑菌物質(zhì)不同濃度的配比效果。結(jié)合1.2.1中確定的每種抑菌物質(zhì)在選擇性培養(yǎng)基中的使用質(zhì)量濃度，選擇各藥劑中對假禾谷鐮刀菌抑制作用較弱、而對3種污染菌抑制作用較強的質(zhì)量濃度；在SPSS 20.0軟件中進行4因素3水平共9個處理L9(34)的正交設計，按照各處理中各抑菌物質(zhì)的質(zhì)量濃度，制備含藥培養(yǎng)基，將4種供試菌株分別接入含藥培養(yǎng)基中，方法同1.2.1。

1.2.3 選擇性培養(yǎng)基在假禾谷鐮刀菌分離中的應用

2022年5月，攜帶室內(nèi)配制好的假禾谷鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基，至河南省洛陽市伊川縣彭婆鎮(zhèn)楊營村和新安縣五頭鎮(zhèn)五頭村的小麥試驗田。在這2塊試驗田中，小麥莖基腐病發(fā)生普遍。從2塊田中各選取癥狀典型(莖稈第1，第2莖節(jié)變褐)的病株60株。30株直接在田間地頭采用選擇性培養(yǎng)基法分離：剪取發(fā)病莖節(jié)交界處，直接放入選擇性培養(yǎng)基上；另外30株帶回實驗室，采用組織分離法分離。比較2種分離方法的異同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件計算各處理平均菌落直徑及抑菌率。利用DPS V6.55軟件中的最小顯著差異(least significant difference，LSD)法進行藥劑不同質(zhì)量濃度間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對假禾谷鐮刀菌及3種污染菌菌絲生長的影響

表1為4種殺菌劑對假禾谷鐮刀菌及3種污染菌菌落直徑的抑制作用。表2為4種殺菌劑對假禾谷鐮刀菌及3種污染菌菌落直徑的平均抑制率。由表1及表2可知：硫酸鏈霉素低質(zhì)量濃度(5～25 μg/mL)時對假禾谷鐮刀菌有較強的抑制作用，但高質(zhì)量濃度(50～100 μg/mL)時抑制作用卻減弱，這可能是由于假禾谷鐮刀菌對硫酸鏈霉素的耐藥性機制。對青霉生長有一定的促進作用，對曲霉的抑制表現(xiàn)為同假禾谷鐮刀菌一樣的效果，而高質(zhì)量濃度(50～100 μg/mL)對鏈格孢的生長有較強的抑制作用。

表1 4種殺菌劑對假禾谷鐮刀菌及3種污染菌菌落直徑的抑制作用

表2 4種殺菌劑對假禾谷鐮刀菌及3種污染菌菌落直徑的平均抑制率

隨著乙膦鋁質(zhì)量濃度增加，對真菌的抑制作用有增強的趨勢，對假禾谷鐮刀菌也有一定的抑制作用。在250 μg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，對假禾谷鐮刀菌的抑制率在30%以下。對青霉的抑制作用較強，而對曲霉和鏈格孢的抑制作用稍弱。

低質(zhì)量濃度多菌靈(0.062 5～0.25 μg/mL)對假禾谷鐮刀菌的抑制作用較弱，最高僅為13.470%，但質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時，對假禾谷鐮刀菌的抑制作用增強，達到47.460%。低質(zhì)量濃度多菌靈對青霉、曲霉有強烈的抑制作用，0.5 μg/mL時抑制作用即可達到100%。對鏈格孢的抑制效果隨質(zhì)量濃度增加而增強，低質(zhì)量濃度時的抑制率在50%左右。

在質(zhì)量濃度為3.125～25 μg/mL時，代森錳鋅對假禾谷鐮刀菌的抑制作用均較弱，而50 μg/mL時，抑制作用增強。低質(zhì)量濃度對青霉的抑制作用較弱，25 μg/mL以上時抑制作用增強。對曲霉的抑制作用較弱，12.5 μg/mL以上甚至有促進作用。對鏈格孢的抑制作用隨著質(zhì)量濃度增加而增強。

由上述分析可知，選擇性培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素、乙膦鋁、多菌靈和代森錳鋅的適宜質(zhì)量濃度分別為50～100 μg/mL、150～250 μg/mL、0.062 5～0.25 μg/mL及6.25～25 μg/mL。但綜合考慮4種藥劑對假禾谷鐮刀菌及3種污染菌的抑制率，可以看出單獨添加上述藥劑后，如果用于篩選分離假禾谷鐮刀菌效果均不理想，需進行4種藥劑的正交設計試驗，以確定選擇性培養(yǎng)基中抑菌物質(zhì)的合適質(zhì)量濃度。

2.2 4種抑菌物的正交設計

利用SPSS 20.0軟件進行4因素3水平的正交設計，及對假禾谷鐮刀菌菌落直徑的抑制作用如表3所示。由表3中可以看出，共9個處理L9(34)。4種抑菌物質(zhì)不同質(zhì)量濃度配比，對假禾谷鐮刀菌會產(chǎn)生不同的抑制率，平均抑制率從26.660%到56.760%；盡管在T4、T6和T8這3種處理下，平均抑制率均超過50%，但此時的菌落直徑仍達到34.333～35.500 mm，且假禾谷鐮刀菌生長速率較快，可以通過將選擇性培養(yǎng)基上長出的假禾谷鐮刀菌盡快轉(zhuǎn)接到PSA培養(yǎng)基上，獲得純培養(yǎng)。9個處理對青霉、曲霉和鏈格孢均有很好的抑制作用，平均抑制率均達到90%以上，大部分都達到了100%。故選擇性培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素、乙膦鋁、多菌靈和代森錳鋅的使用質(zhì)量濃度分別為50～100 μg/mL、150～250 μg/mL、0.062 5～0.25 μg/mL和6.25～25 μg/mL，最適宜濃度分別為75 μg/mL、200 μg/mL、0.25 μg/mL和6.25 μg/mL。

表3 4種殺菌劑的正交設計及對假禾谷鐮刀菌菌落直徑的抑制作用

2.3 選擇性培養(yǎng)基的應用

表4為組織分離法和選擇性培養(yǎng)基法的差異。采用組織分離法分離時，需經(jīng)過莖稈分段再切塊、多次消毒、清水沖洗及濾紙吸干等步驟，1個病樣分離約需10～15 min，病株多時相當費力。且2次消毒及3次清洗時需要的培養(yǎng)皿較多(多于100副)，培養(yǎng)時每個病株又需要1個培養(yǎng)皿，所需耗材很多。操作過程中如乙醇及次氯酸鈉(NaClO)消毒時間把握不準，易將病菌也殺死，故對操作要求高。50個病株分離了4 d才完成，共分離到小麥莖基腐病菌45株，分離頻率為90%。

表4 組織分離法和選擇性培養(yǎng)基法的差異

采用選擇性培養(yǎng)基法分離時，剪取第1、第2莖節(jié)變褐的莖段，約0.5 cm，直接放入選擇性培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，待病變組織長出菌絲后，將菌絲轉(zhuǎn)入新鮮的PSA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)出純菌落后轉(zhuǎn)接保存。選擇性培養(yǎng)基的制備是此法的關鍵，制備好后0.5 d即可完成50株病菌的分離，3～5 d即可獲得莖基腐病菌的純培養(yǎng)物，操作時間大大縮短，操作步驟大大簡化。經(jīng)過5 d，50株小麥莖基腐病病株全部分離完畢，共得到小麥莖基腐病菌47株，分離頻率為94%。

圖1為PSA培養(yǎng)基及選擇性培養(yǎng)基自發(fā)病莖段上分離小麥莖基腐病菌的效果比較。圖1a為組織分離法操作時平板上長出的菌落，有部分莖稈未長出，且有的莖稈長出的菌落較小。圖1b為選擇性培養(yǎng)基法操作時平板上長出的菌落，每個莖稈都長出，且菌落較大。2種分離方法獲得的菌落的形態(tài)相似：氣生菌絲茂盛，有色素的分泌，都是鐮刀菌菌落的典型特征。對2種分離方法獲得的92株病菌進行菌落形態(tài)特征觀察，結(jié)果表明：92株全部為鐮刀菌。

(a) 組織分離法PSA培養(yǎng)基上長出的菌落 (b) 選擇性培養(yǎng)基上長出的菌落

3 討論

本文采用向PSA培養(yǎng)基中添加抑菌物質(zhì)的方法，基于假禾谷鐮刀菌和3種常見污染菌對藥劑敏感性的差異，獲得了一種自發(fā)病小麥莖稈上簡便分離假禾谷鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基，即在PSA培養(yǎng)基基礎上，添加50～100 μg/mL的硫酸鏈霉素、150～250 μg/mL的乙膦鋁、6.25～25 μg/mL的代森錳鋅及0.062 5～0.25 μg/mL的多菌靈，可以達到選擇性分離假禾谷鐮刀菌的目的。采用選擇性培養(yǎng)基法，不僅可以提高分離成功率，而且可以在自然條件下進行，具有省時、省力的特點，適合大量病株的分離。

本文中硫酸鏈霉素所用質(zhì)量濃度同文獻[14]報道的選擇性培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素的質(zhì)量濃度相同，不僅可抑制分離時細菌的滋生，而且對鏈格孢也表現(xiàn)出較強的抑制作用。對于分離時的青霉、曲霉等污染菌，文獻[14]和文獻[19]采用培養(yǎng)基中加入敵克松(敵磺鈉)的方法，但敵克松易光解，不適宜將選擇性培養(yǎng)基帶到大田里使用，且有病組織的培養(yǎng)基在放置時也需避光培養(yǎng)。本文研究結(jié)果表明：在較高質(zhì)量濃度時，多菌靈對假禾谷鐮刀菌和3種污染菌都有很強的抑制作用，質(zhì)量濃度降低，對假禾谷鐮刀菌的抑制作用減弱，但達不到對3種污染菌的抑制作用。為此，本文加入了代森錳鋅，在兩者同時添加的情況下，可以達到對3種污染菌很好的抑制作用。文獻[20]在分離荔枝霜疫霉時則是將多菌靈和咪鮮胺、異菌脲同時添加，達到對污染菌的抑制作用。

基礎培養(yǎng)基的成分及抑菌物質(zhì)的選擇和適宜濃度是選擇性培養(yǎng)基制備的關鍵。本文中4種抑菌物質(zhì)也可以用來制備分離牡丹黃斑病菌的選擇性培養(yǎng)基，但由于病菌對藥劑的敏感性不同，4種物質(zhì)的配比及適宜濃度有所差異[16]。另外，以水瓊脂培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，向其中加入100 μg/mL的硫酸鏈霉素、1 μg/mL的多菌靈和50 μg/mL的多果定，還可以選擇性地分離禾谷絲核菌[17]。

在分離假禾谷鐮刀菌時，偶爾還會受到根霉菌的污染。本文在篩選抑菌物質(zhì)時，曾參照文獻[20]在篩選荔枝霜疫霉選擇性培養(yǎng)基時抑制毛霉菌的方法，使用200 μg/mL的異菌脲，但對根霉的抑制作用并不理想，有必要繼續(xù)篩選對根霉有選擇性抑制作用的殺菌劑。在實際操作中，由于假禾谷鐮刀菌生長速率快，在根霉布滿整個培養(yǎng)皿前可及時轉(zhuǎn)接來避免根霉的影響，故根霉對假禾谷鐮刀菌的分離和純化影響較小。

小麥莖基腐病是由多種病菌引起，除了假禾谷鐮刀菌外，禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、三線鐮刀菌(F.tricinctum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)等也可侵染致病，但分離頻率較低[12,21]。本文的選擇性培養(yǎng)基，在分離引起莖基腐病的其他鐮刀菌上是否可用，尚需進一步的驗證。而對于假禾谷鐮刀菌為優(yōu)勢種群的河南、河北及山東等地，則在生產(chǎn)中可以推廣、使用本文開發(fā)的小麥莖基腐病菌選擇性培養(yǎng)基。