黃芪甲苷通過HMGB1/NF-κB通路減輕膿毒癥大鼠相關(guān)肺損傷

趙雅彬 李琨琨 張志偉 楊寧 運(yùn)苛政 孫同文

膿毒癥是由病原微生物感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是危重癥的常見并發(fā)癥，死亡率高達(dá)30%[1]。全球每年約1900萬人罹患膿毒癥，肺臟是膿毒癥導(dǎo)致多臟器功能損傷中較早損傷的臟器，表現(xiàn)為急性肺損傷[2-3]。目前膿毒癥臨床治療所使用的抗生素類藥物，因毒副作用大且易引起藥物依賴性，亟需開發(fā)安全高效的新型藥物[4]。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ)是提取自黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎消腫、調(diào)節(jié)免疫功能和鎮(zhèn)痛等作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ能夠有效減輕膿毒癥大鼠全身炎癥反應(yīng)，但其作用機(jī)制尚不明確[6]。因此，本研究旨在建立膿毒癥大鼠肺損傷模型，探討AS-Ⅳ對肺損傷的改善作用及其可能作用機(jī)制，為AS-Ⅳ藥物開發(fā)及膿毒癥臨床治療提供參考。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物 60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK(浙)2019-0001。所有實驗動物在溫度20℃～24℃，相對濕度50%～60%，自然晝夜節(jié)律光照的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，所有飼養(yǎng)設(shè)備均經(jīng)過高壓、高溫滅菌，適應(yīng)期間可自由獲取食物和水，墊料每日進(jìn)行更換(倫理編號：2022-2xyy-008)。

2 藥品、主要試劑和儀器 AS-Ⅳ(純度≥98%，上海吉至生化科技有限公司，貨號：A70100)；腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(深圳科潤達(dá)生物工程有限公司，貨號：ELH-TNF-α)；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒(深圳海思安生物技術(shù)有限公司，貨號：HAS-47926，HAS-48678)；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠高遷移率族蛋白B1(High mobility group proteins B1, HMGB1)、核因子-κB p65(nuclear factor- κB, NF-κB p65)多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG(上海晶抗生物有限公司，貨號：JKR18050，JKR6202，JKR19225)。IQ5TM型熒光實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；石蠟組織切片機(jī)(RM2265，德國LEICA公司)。

二、方法

1 膿毒癥大鼠模型建立 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，模型組、AS-Ⅳ各劑量組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥大鼠模型[7]，術(shù)前12 h禁食，自由飲水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術(shù)臺上，沿腹中線左側(cè)1 cm作一切口，長約1 cm，找到盲腸末端1.5 cm處，手術(shù)線結(jié)扎22號針穿刺2次，逐層縫合。對照組大鼠只開腹，不進(jìn)行盲腸的結(jié)扎和穿刺。術(shù)后大鼠出現(xiàn)呼吸頻率明顯加快、腹瀉，精神萎靡，毛色失去光澤及抓取時全無抵抗之力等表現(xiàn)提示建模成功。

2 分組與給藥 60大鼠隨機(jī)分為對照組12只、模型組(12只)、AS-Ⅳ低劑量組(12只)、AS-Ⅳ中劑量組(12只)和AS-Ⅳ高劑量組(12只)。參照文獻(xiàn)[8-9]，AS-Ⅳ低、中、高劑量組灌胃20、40、80 mg/kg AS-Ⅳ混懸液(生理鹽水配制)，對照組及模型組于相同時間給予等量生理鹽水。各組給藥1次/d，連續(xù)7 d。

三、檢測指標(biāo)

1 標(biāo)本采集 末次給藥后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，翻正反射消失后，開腹。腹主動脈采集血液，于4℃下3000 r/min高速離心機(jī)離心15 min，分離血清，-20℃保存。斷頭法處死大鼠，取出肺組織，使用預(yù)冷的生理鹽水沖洗肺組織，取部分左肺組織浸入4%多聚甲醛液固定24 h備用，其余左肺組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 肺組織濕干重比(W/D)測定 取出大鼠右肺組織后，濾紙吸取肺組織表面多余血液，天平準(zhǔn)確稱取右肺組織質(zhì)量記為濕重，再將肺組織放入80℃烤箱烘烤48 h至恒重，記為干重，計算肺組織W/D。肺組織W/D=肺組織濕重/肺組織干重。

3 炎癥因子水平檢測 取出血清和試劑盒，恢復(fù)至室溫后使用，根據(jù)TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書操作。試劑盒采用雙抗體夾心法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，先用標(biāo)本稀釋液1:1稀釋標(biāo)本50 μL加入反應(yīng)孔。其余各孔加入待測樣品，再加入50 μL生物素抗體工作液，蓋上膜板，輕輕震蕩混勻，37℃孵育30 min。甩去液體，每孔加入洗滌液，震蕩30 s，反復(fù)操作3次。再加入80 μL親和鏈霉素HRP，37℃溫育30 min，洗滌液清洗拍干，加入顯色液、終止液，使用酶標(biāo)測定儀于450 nm波長處檢測各孔吸光值，計算樣品濃度。

4 肺組織HE染色觀察 取出固定后的肺組織，浸泡梯度濃度酒精溶液脫水，再使用二甲苯透明，去除透明劑后進(jìn)行石蠟包埋，使用切片機(jī)切成厚度為5 μm的切片。40℃烘箱烘干，過夜。再將切片常規(guī)透明、脫水，放入蘇木精染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗，再次脫水透明。使用中性樹膠，蓋片封固。觀察肺組織病理學(xué)變化。

5 肺組織病理學(xué)評分 光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)變化，并采用改良版肺組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[7]對各組大鼠肺組織進(jìn)行評分，從大鼠肺組織肺間隔厚度、炎性細(xì)胞浸潤程度、肺泡塌陷程度評定肺組織病變程度，各部分?jǐn)?shù)相加為最終得分。評分越高表明肺組織病變程度越嚴(yán)重，詳細(xì)評定標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。

表1 肺組織病理學(xué)評定標(biāo)準(zhǔn)

6 HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá) 取出備用肺組織并剪碎，加入TRIZOL液靜置裂解。按照RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA，檢測RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，配制轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)：R Nase free ddH2O 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，5×g DNA digester Mix 2 μL，4× Hifair Super Mix 5 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為95℃ 25 s，56℃ 35 s，72℃ 65 s進(jìn)行40個循環(huán)。取樣本CT值平均數(shù)，以目的基因相對內(nèi)參的表達(dá)量計算各樣本之間基因表達(dá)差異。引物序列設(shè)計為HMGB1-F：5′-GCATCCTGGCTTATCCATTGG-3′、HMGB1-R：5′-GGCTGCTTGTCATCTGCTG-3′；NF-κB p65-F：5′-AGAGGGGATTTCGATTCCGC-3′、NF-κB p65-R：5′-CCTGTGGGTAGGATTTCTTGTTC-3′；β-actin-F：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′、β-actin-R：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

7 HMGB1、NF-κB p65蛋白表達(dá) 取出備用肺組織加入細(xì)胞裂解液，冰上充分研磨勻漿等待完全裂解，4℃下12000 rpm離心機(jī)離心10 min，收集上清液。使用BCA蛋白濃度試劑盒，檢測蛋白濃度。取40 μL樣品蛋白，加入配制好的分離膠與濃縮膠，恒壓80 V電泳30 min，恒壓120 V電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)底部。260 mA電流下，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶搖床封閉2 h，再加入1:1000一抗稀釋液，4℃過夜，TBST充分清洗3次，每次10 min。加入1：3000二抗稀釋液，室溫封閉60 min，TBST清洗，滴加適量顯影液放入凝膠圖像分析儀進(jìn)行顯影，保存圖像，以β-actin為內(nèi)參，觀察并分析條帶上相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、肺組織W/D比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織W/D升高(P<0.05)。與模型組比較，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織W/D均降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織W/D降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組肺組織W/D降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肺組織W/D比較

二、炎癥因子水平比較

與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)(見表3)。

表3 大鼠血清炎癥因子水平比較

三、肺組織HE染色比較

結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤、水腫等現(xiàn)象。模型組大鼠肺組織嚴(yán)重病變，肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁明顯增厚，部分肺泡可見出血、間質(zhì)水腫現(xiàn)象，存在大量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象得到改善，肺泡間隔減小，肺泡出血和間質(zhì)水腫現(xiàn)象減輕，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少(見圖1)。

圖1 肺組織HE染色結(jié)果(×200，標(biāo)尺=50 μm，A:對照組，B:模型組，C:AS-Ⅳ低劑量組，D:AS-Ⅳ中劑量組，E:AS-Ⅳ高劑量組)

四、肺組織病理學(xué)評分比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織病理學(xué)評分升高(P<0.05)。與模型組比較，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織病理學(xué)評分均降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織病理學(xué)評分降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組肺組織病理學(xué)評分降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠肺組織病理學(xué)評分比較 分)

五、HMGB1、NF-κB p65 mRNA水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。與模型組比，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)(見表5)。

表5 大鼠HMGB1、NF-κB p65 mRNA水平比較

六、HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與模型組比，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)(見表6，圖2)。

表6 大鼠HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比較

圖2 肺組織蛋白檢測

討 論

膿毒癥患者由于體內(nèi)感染的病原體毒素持續(xù)釋放，機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到過度激活，炎性因子高度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞、組織器官和免疫系統(tǒng)均會受到不可逆的損傷[8]。多達(dá)70%的膿毒癥患者會出現(xiàn)嚴(yán)重的肺損傷，表現(xiàn)出呼吸困難等表癥[9]。針對膿毒癥肺損傷的治療集中在控制感染源、液體治療、血管活性藥物的應(yīng)用和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些針對炎癥信號通路的靶向藥物在膿毒癥的治療中取得良好效用[10]。

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)氣中草藥，其主要成分包括AS-Ⅳ、黃芪苷、異黃芪苷、三萜皂苷、黃酮及多糖等[11]。AS-Ⅳ作為黃芪的標(biāo)志成分之一，因其抗炎、活血化瘀的藥效臨床常用于炎癥介質(zhì)的靶向治療[12]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥大鼠模型，從分子機(jī)制上探討AS-Ⅳ對膿毒癥大鼠肺臟損傷的修復(fù)作用。結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織W/D比值、肺組織病理學(xué)評分、TNF-α、IL-1β、IL-6均升高，表明膿毒癥模型建立成功且模型組大鼠肺組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，大鼠體內(nèi)伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。給予不同劑量的AS-Ⅳ治療后大鼠均表現(xiàn)肺組織W/D比值、肺組織病理學(xué)評分、TNF-α、IL-1β、IL-6降低，提示大鼠肺組織損傷得到修復(fù)，體內(nèi)的炎癥反應(yīng)也明顯減輕。此外，大鼠肺組織HE染色結(jié)果也表明肺泡間隔縮小，肺泡出血和間質(zhì)水腫現(xiàn)象減輕，細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少。以上結(jié)果均證實AS-Ⅳ對膿毒癥大鼠肺組織損傷具有修復(fù)作用。

在本研究中，與模型組比較，AS-Ⅳ各劑量組大鼠肺組織HMGB1和NF-κB p65 mRNA水平降低，且HMGB1和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)降低趨勢。HMGB1作為下游炎癥重要參與因子，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中均起到關(guān)鍵作用[13]。在細(xì)胞內(nèi)，HMGB1參與核小體內(nèi)DNA復(fù)制、修復(fù)，細(xì)胞分化等多種生理過程；釋放至細(xì)胞外時，HMGB1可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤生長等，參與更廣泛的生物學(xué)行為[14]。炎癥反應(yīng)是膿毒癥引起臟器損傷的重要機(jī)制之一，在膿毒癥病程發(fā)展中，外周的炎性因子集中在組織已受到破壞的臟器，激活HMGB1/NF-κB通路釋放更多的促炎因子從而進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，加劇臟器損傷[15]。HMGB1分泌到細(xì)胞外發(fā)揮促炎作用時，通過與受體結(jié)合，激活下游NF-κB信號通路，在膿毒癥發(fā)展過程中，活化的NF-κB通路能夠釋放大量TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[16]。結(jié)合血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平變化，可見AS-Ⅳ能夠抑制HMGB1/NF-κB通路，減少NF-κB p65磷酸化，減輕炎癥反應(yīng)，對大鼠肺組織損傷有積極影響。

綜上所述，AS-Ⅳ能夠改善膿毒癥大鼠肺組織損傷，減輕炎癥反應(yīng)，可能是通過抑制HMGB1/NF-κB通路，減少NF-κB p65磷酸化蛋白表達(dá)發(fā)揮作用，為臨床治療膿毒癥提供實驗依據(jù)。