老芒麥、加拿大披堿草及其雜交一代根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

王伶瑞，紅 雨，2，李慧玲，李景環(huán)

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校生物多樣性保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022）

土壤微生物在提高土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)、系統(tǒng)穩(wěn)定性、抗干擾的能力水平以及資源可持續(xù)利用中都發(fā)揮著重要作用[1]。土壤微生物一方面可以預(yù)測(cè)土壤環(huán)境的變化，另一方面也可作為評(píng)估土壤質(zhì)量和土壤恢復(fù)性能的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)[2-8]。加拿大披堿草（Elymus canadensis L.）與老芒麥（Elymus sibiricus Linn.）均為披堿草屬植物，是我國生態(tài)建設(shè)和畜牧業(yè)發(fā)展中具有耐寒、耐旱能力的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草品種[9-12]，在云錦鳳教授的指導(dǎo)下，已獲得一批具有重要育種價(jià)值的加拿大披堿草與老芒麥雜交后代[13-16]，其抗逆性和適應(yīng)性均有所提高。不同的植物種類會(huì)導(dǎo)致根際土壤微生物群落及養(yǎng)分發(fā)生變化，從而對(duì)植物生物量產(chǎn)生較大影響。因此，研究不同種類植物的土壤微生物群落及養(yǎng)分變化，對(duì)于牧草的種植和改良具有一定意義。

本試驗(yàn)以老芒麥、加拿大披堿草及老芒麥（父本）×加拿大披堿草（母本）雜交一代的根際土壤為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)3種類型土壤16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序分析，并對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)沙壤質(zhì)暗栗鈣土中種植老芒麥、加拿大披堿草及老芒麥×加拿大披堿草雜交一代的根際土壤細(xì)菌分布進(jìn)行分析，旨在揭示環(huán)境因子對(duì)根際土壤細(xì)菌的影響，從而為提升土壤品質(zhì)及推動(dòng)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)方法

1.1.1 樣品的采集

于2014年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)種植了老芒麥、加拿大披堿草和老芒麥（父本）×加拿大披堿草（母本）雜交一代（用分蘗苗移栽）。種植方式為播種，每種植物種植面積為30 m2（3 m×10 m），株距為40 cm。2021年9月下旬在種植老芒麥、加拿大披堿草和老芒麥×加拿大披堿草雜交一代的試驗(yàn)地中采用隨機(jī)取樣法各選取6個(gè)采樣點(diǎn)，用取土鉆采集結(jié)皮下層5 cm土壤裝入樣品袋，以備測(cè)定土壤化學(xué)指標(biāo)。將地表植物落葉除去，沿根系生長(zhǎng)的方向?qū)⑵淙客诔?，輕輕抖動(dòng)根系，再挑選粘有土壤的根放入滅菌的離心管中，此時(shí)根附著的土壤為根際土[17]。將得到的根及根際土置于-80℃保存?zhèn)溆肹18]。將老芒麥、加拿大披堿草和老芒麥×加拿大披堿草雜交一代的結(jié)皮下層土壤分別標(biāo)記為L(zhǎng)、J、F，試驗(yàn)重復(fù)6次（每個(gè)采樣點(diǎn)為1次重復(fù)），各重復(fù)土樣依次命名為L(zhǎng)1～L6、J1～J6、F1～F6。

1.1.2 土壤化學(xué)指標(biāo)測(cè)定

將采集的結(jié)皮下層5 cm土樣晾干，按液土比2.5 mL/g（25 mL溶液中加入10 g土）的比例用0.01 mol/L氯化鈣溶液浸提，充分?jǐn)嚢韬箪o置30 min，用pH計(jì)測(cè)定pH值[19]。速效磷含量測(cè)定方法為0.5 mol/L NaHCO3法，速效氮含量測(cè)定方法為堿解擴(kuò)散法，有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定方法為外加熱法[20]。

1.1.3 樣品總DNA的提取及高通量測(cè)序

稱取不同采樣點(diǎn)的植物根際土壤各0.5 g，依照土壤DNA提取試劑盒說明書提取樣品總DNA，每個(gè)樣品3次重復(fù)，將每次所得的DNA分別混勻，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆肹21-25]。

以得到的DNA溶液為模板，采用16S rRNA基因V3～V4區(qū)域通用引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以反應(yīng)體系1（表1）配制反應(yīng)溶液[26-27]。PCR反應(yīng)條件：94℃3 min；94℃30 s，55℃45 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖（加核酸染料0.01%）電泳檢測(cè)后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序和分析[21，26]。MiSeq流程包括：環(huán)境基因組DNA提取及檢測(cè)、PCR擴(kuò)增、MiSeq文庫構(gòu)建和MiSeq測(cè)序[22]。

表1 反應(yīng)體系1

1.2 多樣性分析、相關(guān)性分析及稀釋性曲線

Alpha多樣性分析與相關(guān)性分析均通過美吉生物云信息平臺(tái)進(jìn)行分析。物種Venn圖分析通過R語言（version 3.3.1）工具統(tǒng)計(jì)和作圖。稀釋性曲線選擇97%相似度的OTU或其他分類學(xué)水平，利用mothur軟件在隨機(jī)抽樣下進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)的計(jì)算，利用R語言工具制作曲線圖[23]。

多樣性指數(shù)的計(jì)算方法

Chao1：常用來估計(jì)物種總數(shù)，本試驗(yàn)分析使用計(jì)算公式如下

式中，SChao1為估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)；n1為只含有一條序列的OTU數(shù)目；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

ACE：用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，常用來估計(jì)物種總數(shù)，本試驗(yàn)分析使用計(jì)算公式如下

其中，

式中，Srare為含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；abund為“優(yōu)勢(shì)”O(jiān)TU的閾值（默認(rèn)為10）。

Simpson：常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。計(jì)算公式如下

Shannon-Wiener：常用來估算樣本中微生物多樣性。計(jì)算公式如下

式中，ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；N為所有的序列數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)得到PE reads，根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，在對(duì)序列質(zhì)量質(zhì)控和過濾的同時(shí)區(qū)分樣本，進(jìn)行物種分類學(xué)分析，基于分類學(xué)分析結(jié)果，在不同分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析和測(cè)序深度的檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行多元分析和差異顯著性檢驗(yàn)等一系列深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析[27-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋性曲線

從所采集的土樣中隨機(jī)抽取若干個(gè)體，對(duì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)成的曲線作稀釋性曲線[22，29]。通過對(duì)3種植物的根際土壤高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可知，L1～L6、J1～J6、F1～F6 18個(gè)樣品的基因測(cè)序分別得到47 688、47 069、48 476、44 715、51 468、51 759、48 366、51 306、53 104、57 743、53 071、46 561、44 743、51 194、48 737、52 769、47 297、47 683條序列。OTU數(shù)目隨序列數(shù)增加而增加，但增幅逐漸變小，稀釋性曲線（圖1）趨于平緩，表明測(cè)序結(jié)果能較好地反映環(huán)境中的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[23]。

圖1 樣品稀釋曲線

2.2 土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與組成分析

對(duì)樣品中的物種組成進(jìn)行分析后，根據(jù)細(xì)菌OTU數(shù)目構(gòu)建Venn圖（圖2）。由圖2可知，3種根際土壤樣品細(xì)菌群落中共有OTU數(shù)目為3 603個(gè)、L和F共有的OTU數(shù)目為3 937個(gè)、J和F共有的OTU數(shù)目為4 113個(gè)、J和L共有的OTU數(shù)目為4 121個(gè)；L中特有OTU數(shù)目為512個(gè)、J中特有OTU數(shù)目為211個(gè)、F中特有OTU數(shù)目為161個(gè)。

圖2 細(xì)菌OTU的Venn圖

在門水平上（圖3），檢測(cè)到的植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)大致相同，主要由放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、黏球菌門（Myxococcota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）等組成。

圖3 門水平上的土壤樣品細(xì)菌群落柱形圖

在所有土樣中，3種植物根際土壤細(xì)菌群落的共同優(yōu)勢(shì)門為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）；老芒麥根際土壤細(xì)菌群落的單獨(dú)優(yōu)勢(shì)門為擬桿菌門（Bacteroidete），占比為6.08%；雜交一代根際土壤細(xì)菌群落的單獨(dú)優(yōu)勢(shì)門也為擬桿菌門（Bacteroidete），但占比為5.96%。

在屬水平上（圖4），所有土樣的細(xì)菌群落中共檢測(cè)到26個(gè)屬，其中，3種植物根際土壤的共同優(yōu)勢(shì)屬為節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter），占比為6.16%，其余屬的占比都低于5%。老芒麥根際土壤細(xì)菌群落的單獨(dú)優(yōu)勢(shì)屬為希瓦氏菌屬（Shewanella），占比為3.14%；加拿大披堿草根際土壤細(xì)菌群落的單獨(dú)優(yōu)勢(shì)屬為類諾卡氏菌屬（Nocardioides），占比為3.14%；雜交一代根際土壤細(xì)菌群落的單獨(dú)優(yōu)勢(shì)屬為norank-f-JG30-KF-CM45，占比為2.78%。

圖4 屬水平上的土壤樣品細(xì)菌群落柱形圖

2.3 多樣性指數(shù)分析

由表2可知，老芒麥根際土壤中細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)都是最高的，分別為6.714 289、4 382.526 453、4 320.070 064；加拿大披堿草根際土壤中細(xì)菌的Simpson指數(shù)最高，為0.017 916；老芒麥與老芒麥×加拿大披堿草雜交一代的多樣性指數(shù)相近。這說明老芒麥根際土壤細(xì)菌群落的物種多樣性和物種豐富度較加拿大披堿草和老芒麥×加拿大披堿草雜交一代更高。

表2 Alpha多樣性指數(shù)

2.4 土壤化學(xué)指標(biāo)分析

由圖5可知，加拿大披堿草根際土壤的pH值低于老芒麥和老芒麥×加拿大披堿草雜交一代的根際土壤。由圖6可知，老芒麥根際土壤的有機(jī)質(zhì)含量最高，加拿大披堿草根際土壤的有機(jī)質(zhì)含量最低；老芒麥根際土壤的速效磷含量顯著高于其他兩種植物根際土壤，分別是加拿大披堿草根際土壤的1.52倍和雜交一代根際土壤的1.23倍；加拿大披堿草根際土壤的速效氮含量最低，為54.25 mg/kg，老芒麥與雜交一代根際土壤的速效氮含量較接近，只相差2.92 mg/kg。

圖5 樣品土壤pH值柱形圖

圖6 樣品土壤化學(xué)指標(biāo)箱型圖

2.5 細(xì)菌組成與土壤化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析表明（圖7），土壤有機(jī)質(zhì)與Pseudomonas、norank-f-norank-o-Subgroup-7和Subgroup-10呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.723 430、0.760 580、0.799 790；與norank-f-norank-o-Gaiellales、Gaiella和norank-f-Gemmatimonadaceae呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.771 300、-0.831 610、-0.781 220。速效氮與Mycobacterium呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.791 090；與Agromyces、norank-f-Gemmatimonadaceae和Arthrobacter呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.665 290、-0.694 310、-0.666 330。速效磷與norank-f-norank-o-SBR1031、norank-fnorank-o-Subgroup-7、Subgroup-10和norank-f-A4b呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.736 430、0.717 980、0.708 680、0.714 880；與norank-f-norank-o-Gaiellales、Gaiella和norank-f-Ilumatobacteraceae呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.743 150、-0.751 810、-0.727 650。pH值 與Agromyces和norank-f-Xantobacteraceae呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.604 870、-0.651 450。

圖7 細(xì)菌組成與土壤化學(xué)指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

植物根際土壤生態(tài)系統(tǒng)由土壤微生物與植物根系構(gòu)成，它們之間會(huì)產(chǎn)生相互作用[30]。由于土壤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性、土壤生物的多樣性和技術(shù)手段的不足等因素，嚴(yán)重制約了人們對(duì)土壤微生物的深入研究。隨著高通量測(cè)序等分子技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物的基礎(chǔ)研究逐漸豐富。研究表明，土壤化學(xué)指標(biāo)與植物根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有密切關(guān)系[31-32]。張永亮等[33]研究發(fā)現(xiàn)，牧草的生長(zhǎng)對(duì)土壤中的速效磷含量有很大影響，不同植物的生長(zhǎng)所消耗的磷含量不同，所以種植不同植物的土壤速效磷含量也不同，這與本試驗(yàn)中種植老芒麥的土壤速效磷含量與加拿大披堿草和雜交一代的含量有顯著差異的結(jié)果相一致。

在OTU水平上，雜交一代與加拿大披堿草樣品相距更近，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似；而雜交一代與老芒麥的樣品較遠(yuǎn)，它們之間的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。有研究表明，老芒麥與加拿大披堿草的雜種后代與雙親的親緣關(guān)系表現(xiàn)為與加拿大披堿草較近，而與老芒麥的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)[9]，本試驗(yàn)也進(jìn)一步證明了該結(jié)論。測(cè)序結(jié)果表明，在門水平上，老芒麥、加拿大披堿草和雜交一代根際土壤的優(yōu)勢(shì)門為 放 線 菌 門（Actinobacteria）、變 形 菌 門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），這與劉艷君等[25]的研究結(jié)果基本一致。而在屬水平上，節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）和希瓦氏菌屬（Shewanella）是老芒麥根際的優(yōu)勢(shì)屬，但劉艷君等[25]研究得出的優(yōu)勢(shì)菌群依次為Norank-c-Subgroup-6、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、Norankf-Gemmatimonadaceae、芽球菌屬（Blastococcus）和RB41，這些屬在本試驗(yàn)中也被檢測(cè)出，但含量不占優(yōu)勢(shì)，說明優(yōu)勢(shì)屬的組成與土壤環(huán)境有關(guān)系。

Alpha多樣性指數(shù)可以較好地反映生物群落的多樣性和豐富度。Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)都可以反映生物群落多樣性，Shannon-Wiener指數(shù)數(shù)值越大，表示該群落的物種多樣性越高，Simpson指數(shù)則與之相反[24，27]。ACE和Chao1指數(shù)都可以反映物種豐富度，其數(shù)值越高，表示該群落的物種豐富度越高[30]。此外，多樣性指數(shù)分析表明，老芒麥根際土壤的細(xì)菌物種豐富度和群落多樣性都是最高的，而加拿大披堿草則最低。研究表明，植物根際土壤的細(xì)菌群落多樣性會(huì)隨種植年限的增加而逐漸降低[25]，本試驗(yàn)暫未針對(duì)種植年限因素進(jìn)行研究，后續(xù)試驗(yàn)將會(huì)進(jìn)行該因素的相關(guān)研究。

土壤微生物與環(huán)境因子間存在復(fù)雜多樣的相互作用[34-35]。在本試驗(yàn)中，對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響最大的是有機(jī)質(zhì)和速效磷，速效氮也有一定的影響。付莉嬌等[36]研究指出，土壤pH值、有機(jī)質(zhì)含量、速效氮含量、速效鉀含量、速效磷含量的變化，都會(huì)導(dǎo)致植物根際微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而影響植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。蘇貝貝等[34]研究表明，高寒地區(qū)不同豆科牧草根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與土壤化學(xué)指標(biāo)存在顯著相關(guān)關(guān)系，并提出其中土壤主要的驅(qū)動(dòng)因子可能是速效磷和有機(jī)質(zhì)。陳孟立等[37]的研究中也提到可以通過改善土壤肥力和環(huán)境狀況，改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而有機(jī)質(zhì)是影響其研究區(qū)域土壤細(xì)菌分布的主要環(huán)境因素之一。這些研究結(jié)果都與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。

本試驗(yàn)通過高通量測(cè)序技術(shù)，分析了老芒麥、加拿大披堿草及其雜交一代根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為了解生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關(guān)系，提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外，有學(xué)者對(duì)不同種植年限、不同種植方式[38]的植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響，以及植物分泌物對(duì)土壤根際微生物的影響[39-40]也進(jìn)行了研究，未來也會(huì)把這些影響因素加入老芒麥、加拿大披堿草及雜交后代根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的試驗(yàn)中進(jìn)行更深入的研究。