籽用美洲南瓜離體快繁技術(shù)研究

李石恒，王 萍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011）

籽用美洲南瓜為葫蘆科南瓜屬一年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲南部，19世紀(jì)中葉從歐洲引入中國(guó)，世界各地均有分布。籽用美洲南瓜籽粒不僅含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，還含有豐富的葫蘆巴堿和鉀、磷，具有防癌、降脂、降糖、止癢、潤(rùn)膚的功效。《本草綱目》對(duì)南瓜籽也有記載：南瓜籽能驅(qū)蟲、消腫，可治療蛔蟲、百日咳、痔瘡等[2]。此外，南瓜籽還富含鋅元素，是優(yōu)良的保健食品[3]。

近年來(lái)，關(guān)于南瓜作物離體快繁技術(shù)的報(bào)道較多。研究表明，中國(guó)南瓜不定芽再生率低，再生周期長(zhǎng)，為70 d左右[4]；印度南瓜子葉節(jié)離體再生不定芽誘導(dǎo)率在56.1%左右，誘導(dǎo)率較低，但在MS、MS+NAA（1 mg/L）及MS+活性炭（2 g/L）培養(yǎng)基中，生根率極高，為90.7%～97.6%[5]；中國(guó)南瓜貝粟灰、永安2號(hào)和永安5號(hào)子葉節(jié)離體再生效果較好，不定芽誘導(dǎo)率較高，為88.89%，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，生根率最高，達(dá)到83.33%[6]；中國(guó)南瓜大果蜜本子葉節(jié)離體再生不定芽誘導(dǎo)率為58.33%，成苗率為85.00%[7]。

籽用美洲南瓜葉片容易受到白粉病[8]、病毒病[9]、蔓枯病等不同程度的病害影響。但南瓜抗病材料匱乏，遭受病害蔓延迅速，周年侵染，藥劑防治效果往往不佳，極易造成葉片早衰減產(chǎn)，且長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)給食用帶來(lái)安全隱患，并加劇環(huán)境污染。因此，研究一種籽用美洲南瓜高效離體快速繁殖方法，探究組培苗的抗病性，對(duì)縮短組培苗繁育周期、減少籽用美洲南瓜病害具有十分重要的意義。本試驗(yàn)以籽用美洲南瓜品種弘昌211子葉為供試材料，進(jìn)行離體快繁技術(shù)研究，旨在縮短籽用美洲南瓜再生周期，獲得抗病性較強(qiáng)的組培苗。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為京成7091、金蘋果、金豐光板、弘昌211、金豐八號(hào)、晶瑩118、瑞豐九號(hào)、希望驕子、金地1號(hào)，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)籽用美洲南瓜課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萌發(fā)培養(yǎng)

50℃溫水浸泡籽用美洲南瓜種子30 min，去殼后將種子置于75%乙醇中表面消毒15 s，無(wú)菌水沖洗3次，再用4%NaClO消毒15 min，無(wú)菌水沖洗6次。將種子接種于MS培養(yǎng)基（30.0 g/L蔗糖和6.5 g/L瓊脂）中，黑暗環(huán)境下萌發(fā)培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度為25℃），每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5～7粒種子。種子萌發(fā)3～5 d后，進(jìn)行萌發(fā)率、污染率、芽長(zhǎng)的測(cè)定。

1.2.2 離體快繁試驗(yàn)

1.2.2 .1 外植體制備

萌發(fā)培養(yǎng)后，以弘昌211為組培材料于超凈工作臺(tái)內(nèi)移去無(wú)污染幼苗的下胚軸，以子葉為外植體，切取不同的部位及大小。A：用解剖刀橫切子葉，制成近下胚軸的1/2子葉外植體；B：用解剖刀橫切子葉，制成遠(yuǎn)下胚軸的1/2子葉外植體；C：用解剖刀橫切子葉，取近下胚軸的1/2子葉，并將其豎切，制成1/4子葉外植體；D：用解剖刀橫切子葉，取近下胚軸的1/2子葉，并將2片1/2子葉沿中間縫隙切開，制成單片1/2子葉外植體；E：用解剖刀橫切子葉，取近下胚軸的1/2子葉，先豎切，制成1/4子葉，再將2片1/4子葉沿中間縫隙切開，制成1/8子葉外植體。

近下胚軸的外植體均帶有部分生長(zhǎng)點(diǎn)，每種制備方式提供90粒種子，觀察記錄不同制備方式外植體誘導(dǎo)出芽、成苗及繁殖系數(shù)。外植體制備見圖1。

1.2.2 .2 初代培養(yǎng)

將外植體接種于添加不同濃度6-BA及TDZ的MS培養(yǎng)基中，置于溫度25℃、14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)，并設(shè)置13組激素濃度配比（表1）。初代培養(yǎng)14 d后，測(cè)定株高與株幅。

表1 初代培養(yǎng)培養(yǎng)基中激素濃度配比

1.2.2 .3 生根培養(yǎng)

初代培養(yǎng)14～28 d后，進(jìn)行生根培養(yǎng)10～20 d。將初代組培苗接種于添加不同濃度6-BA、NAA的MS培養(yǎng)基，置于溫度25℃、14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)，并設(shè)置13組激素濃度配比（表2）。生根培養(yǎng)15 d后，測(cè)量根長(zhǎng)、根重。

表2 生根培養(yǎng)培養(yǎng)基中激素濃度配比

1.2.2 .4 煉苗

選擇生長(zhǎng)健壯的植株進(jìn)行煉苗及移栽。當(dāng)植株真葉數(shù)為3葉、5葉、7葉時(shí)，采用不同的煉苗方式：（1）人工氣候室中培養(yǎng)瓶全打開1 d后移栽；（2）人工氣候室中培養(yǎng)瓶全打開2 d后移栽；（3）人工氣候室中培養(yǎng)瓶半打開1 d、全打開1 d后移栽。

1.2.2 .5 組培苗移栽后生長(zhǎng)狀況觀察

待5葉1心煉苗完成后，以催芽播種的普通苗為對(duì)照，選擇5葉1心的普通苗和組培苗同時(shí)定植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)教學(xué)實(shí)踐基地溫室中，分別于定植后10、35、60 d觀察組培苗與普通苗的植株長(zhǎng)勢(shì)、葉片顏色及發(fā)病情況。

1.2.2.6白粉病、病毒病病情指數(shù)

白粉病、病毒病分別參照馬雙武[10]、付洪冰等[11]的調(diào)查方法與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算及處理

采用Excel 2020軟件作圖，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同籽用美洲南瓜品種種子萌發(fā)比較

由表3可知，不同籽用美洲南瓜品種種子萌發(fā)情況差異顯著（P＜0.05）。希望驕子、弘昌211、金豐八號(hào)、瑞豐九號(hào)、金地1號(hào)的萌發(fā)率較高、污染率較低、芽長(zhǎng)＞3 cm的萌發(fā)種子數(shù)較多；金豐光板、京成7091種子萌發(fā)率較低、污染率較高，不宜進(jìn)行種子萌發(fā)培養(yǎng)及離體快繁培養(yǎng)。其中弘昌211萌發(fā)率較高、污染率最低（1.01%），適宜進(jìn)行籽用美洲南瓜離體再生快繁體系的研究。

表3 不同籽用美洲南瓜品種種子萌發(fā)測(cè)定指標(biāo)

2.2 弘昌211不同制備方式外植體誘導(dǎo)成苗分析

由表4可知，不同制備方式外植體對(duì)弘昌211組培苗誘導(dǎo)差異顯著（P＜0.05）。近下胚軸的1/2子葉為外植體時(shí)，組培苗不定芽誘導(dǎo)率、成苗率及繁殖系數(shù)最高，分別為98.99%、96.67%、0.97，誘導(dǎo)效果最好；遠(yuǎn)下胚軸的1/2子葉為外植體時(shí)，誘導(dǎo)效果最差，不定芽誘導(dǎo)率雖有35.55%，但成苗率極低，為5.56%。

表4 弘昌211不同制備方式外植體誘導(dǎo)成苗情況

2.3 不同激素配比培養(yǎng)基對(duì)弘昌211組培苗初代培養(yǎng)的影響

由圖2可知，不同激素配比對(duì)弘昌211組培苗初代培養(yǎng)株高及株幅的影響差異顯著（P＜0.05）。初代培養(yǎng)14 d，各處理均能產(chǎn)生組培苗，以T7處理的株高最高，為3.423 cm；株幅最大，為4.565 cm，且與其他處理相比差異顯著（P＜0.05）。由此可見，初代培養(yǎng)的最優(yōu)激素配比組合為2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ。

圖2 初代培養(yǎng)14 d后弘昌211組培苗株高及株幅

2.4 不同激素配比對(duì)弘昌211組培苗生根培養(yǎng)的影響

由圖3可知，不同激素配比對(duì)弘昌211組培苗根長(zhǎng)影響差異顯著（P＜0.05）。Z2、Z5、Z7、Z8首先誘導(dǎo)成苗，生根培養(yǎng)15 d后根長(zhǎng)表現(xiàn)為Z7＞Z8＞Z9＞Z5＞H3＞Z6＞Z2＞Z3＞Z1＞H2＞H1＞CK。Z7處理的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，為5.72 cm，且與其他處理相比差異顯著（P＜0.05）。

圖3 生根培養(yǎng)15 d后弘昌211組培苗根長(zhǎng)

由圖4可知，不同激素配比對(duì)弘昌211組培苗根重影響差異顯著（P＜0.05）。生根培養(yǎng)15 d后根重表現(xiàn)為Z7＞Z8＞Z9＞Z5＞H3＞Z6＞Z2＞Z3＞Z1＞H2＞H1＞CK。Z7處理的根重最重，為0.602 g，且與其他處理相比差異顯著（P＜0.05）。

圖4 生根培養(yǎng)15 d后弘昌211組培苗根重

由表5可知，弘昌211組培苗生根培養(yǎng)15 d后，Z7處理的平均根數(shù)最多，為5.62條；生根率最高，為100%，且植株健壯，根系粗長(zhǎng)，無(wú)愈傷化及玻璃化現(xiàn)象。結(jié)合圖3、圖4結(jié)果可知，生根培養(yǎng)最優(yōu)激素濃度配比為2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

表5 生根培養(yǎng)15 d后弘昌211組培苗生長(zhǎng)狀況

2.5 不同煉苗方式對(duì)弘昌211組培苗成活率的影響

由表6可知，不同煉苗方式對(duì)弘昌211組培苗移栽成活率影響差異顯著（P＜0.05）。人工氣候室中培養(yǎng)瓶半打開1 d、全打開1 d后移栽成活率最高，3片真葉、5片真葉、7片真葉時(shí)移栽，成活率分別為82.27%、97.75%、88.24%，其中以5片真葉時(shí)移栽成活率最高。3片真葉、人工氣候室中培養(yǎng)瓶全打開煉苗2 d，部分組培苗出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，最終植株死亡。

表6 不同煉苗方式弘昌211組培苗移栽成活率

2.6 弘昌211組培苗再生周期

由圖5可知，弘昌211種子萌發(fā)3 d后，取近下胚軸的1/2子葉，在含有2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)14～28 d，在含有2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)10～20 d，人工氣候室煉苗2 d、移栽5 d后定植于溫室，再生周期為45 d左右。

圖5 弘昌211組培苗再生周期

2.7 弘昌211組培苗移栽后生長(zhǎng)狀況

由圖6可知，弘昌211移栽后10 d普通苗感染白粉病，且病情重于組培苗；移栽后35 d，普通苗與組培苗均開花，但普通苗白粉病及病毒病發(fā)病嚴(yán)重，且植株矮??；組培苗白粉病發(fā)病輕，無(wú)病毒病發(fā)生，植株長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于普通苗。移栽后60 d，普通苗白粉病及病毒病發(fā)病嚴(yán)重，出現(xiàn)蔓枯病，葉片黃白相間；組培苗葉片無(wú)蔓枯病，白粉病及病毒病發(fā)病極輕，葉片鮮綠。

圖6 弘昌211組培苗與普通苗移栽后生長(zhǎng)狀況

2.8 弘昌211組培苗與普通苗病情指數(shù)分析

2.8.1 組培苗與普通苗白粉病病情指數(shù)分析

由圖7可知，組培苗與普通苗在定植后10、35、60 d白粉病病情指數(shù)差異顯著（P＜0.05）。定植后10 d，組培苗未出現(xiàn)白粉病，而普通苗病情指數(shù)為8.27；定植后35 d，普通苗病情指數(shù)為35.21（感），組培苗病情指數(shù)為2.40（高抗）；定植后60 d，普通苗病情指數(shù)為57.24（中感），組培苗病情指數(shù)為5.21（高抗）。

圖7 組培苗與普通苗白粉病病情指數(shù)

2.8.2 組培苗與普通苗病毒病病情指數(shù)分析

由圖8可知，組培苗與普通苗在定植后35、60 d病毒病病情指數(shù)差異顯著（P＜0.05）。定植后10 d，組培苗與普通苗均未出現(xiàn)病毒??；定植后35 d，普通苗病情指數(shù)為20.14，組培苗未出現(xiàn)病毒病；定植后60 d，普通苗病情指數(shù)為62.41（感），組培苗病情指數(shù)為8.52（抗）。

圖8 組培苗與普通苗病毒病病情指數(shù)

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有的籽用美洲南瓜從子葉接種到苗再生需要70 d左右，周期較長(zhǎng)。本試驗(yàn)籽用美洲南瓜品種弘昌211從子葉接種到苗再生周期為45 d左右，較中國(guó)南瓜高效再生體系的建立試驗(yàn)獲得再生苗周期縮短25 d左右[4]，較印度南瓜離體再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化試驗(yàn)獲得再生苗周期縮短20 d左右[12]。本試驗(yàn)選擇籽用美洲南瓜品種弘昌211近下胚軸的1/2子葉為外植體，不定芽誘導(dǎo)率為98.99%、成苗率為96.67%，較印度南瓜[5]子葉節(jié)離體再生不定芽誘導(dǎo)率提高43.79%，較中國(guó)南瓜[6]貝粟灰子葉節(jié)離體再生不定芽誘導(dǎo)率提高10.10%，較中國(guó)南瓜[7]大果蜜本子葉節(jié)離體再生不定芽誘導(dǎo)率提高40.66%、成苗率提高11.67%。本試驗(yàn)籽用美洲南瓜品種弘昌211組培苗離體再生誘導(dǎo)效果好，成苗時(shí)間短。

本試驗(yàn)初代培養(yǎng)設(shè)置不同濃度6-BA與TDZ組合，發(fā)現(xiàn)兩種激素組合具有促進(jìn)籽用美洲南瓜分裂分化及生根的雙重作用。不同濃度6-BA與TDZ組合在紅紋鳳仙花[13]、月季[14]、大豆[15]、草莓[16]等植物離體培養(yǎng)中已有報(bào)道，本試驗(yàn)適當(dāng)?shù)丶哟罅薚DZ激素的用量，與TDZ在卷丹百合[17]、蘋果[18]、金葉復(fù)葉槭[19]、蝴蝶蘭[20]等植物上的應(yīng)用相比效果更好，表現(xiàn)為籽用美洲南瓜組培苗不定芽誘導(dǎo)率較高，且部分再生苗直接誘導(dǎo)出發(fā)達(dá)的根系，再生植株葉片鮮綠，無(wú)褐化現(xiàn)象，煉苗移栽后植株高大、健壯。生根培養(yǎng)設(shè)置不同濃度6-BA與NAA，獲得了根系發(fā)達(dá)、移栽易成活的籽用美洲南瓜組培苗。

本試驗(yàn)籽用美洲南瓜品種弘昌211組培苗不定芽誘導(dǎo)率、成苗率較高，組培苗再生周期短，與普通苗相比，表現(xiàn)出對(duì)白粉病、病毒病較強(qiáng)的抗性，減輕了種傳病害對(duì)籽用美洲南瓜的危害。