基于氧化鋅納米花的心肌肌鈣蛋白I夾心式電化學(xué)免疫傳感器構(gòu)建研究*

朱 彤，王 琴，蘇會(huì)嵐

成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院（ 成都 610050）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是因持續(xù)性缺血缺氧而引起的心肌壞死，臨床常采用心電圖、血常規(guī)檢查等方法進(jìn)行診斷[1]。研究[2-3]表明，心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）含量在AMI發(fā)生3～6 h后迅速增高，增高倍數(shù)通常超過(guò)總肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）含量的增高倍數(shù)，比CK-MB更具時(shí)效性。其中，高靈敏度的cTnI在臨床檢測(cè)中備受關(guān)注，對(duì)AMI的早期診斷及療效判斷具有重要的臨床意義[4-5]。目前，臨床檢測(cè)cTnI的方法主要包括免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法以及免疫比濁法等[6-7]。李志梁等[8]結(jié)合免疫層析技術(shù)與納米技術(shù)成功構(gòu)建膠體金免疫層析法，在血清中實(shí)現(xiàn)對(duì)cTnI的快速定量測(cè)定。

相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，電化學(xué)免疫傳感器具有高靈敏度、高特異度、操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[9-10]。Jia等[11]用固載有兩種酶（辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶）和兩種電活性物質(zhì)（硫堇、二茂鐵）的氧化石墨烯標(biāo)記第二抗體，制得檢測(cè)探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）的同時(shí)檢測(cè)，該傳感器檢測(cè)CEA和AFP具有較寬的線性范圍（0.01～100.00 μg/L），較低的檢出限（CEA為1.64×10-3μg/L，AFP為1.33×10-3μg/L）。為提高檢測(cè)靈敏度，有研究[12]發(fā)現(xiàn)，利用金屬合金納米材料設(shè)計(jì)一種無(wú)標(biāo)記型cTnI電化學(xué)免疫傳感器，檢測(cè)限低至0.003 μg/L，線性范圍為0.01～100.00 μg/L。另外，研究[13]表明，夾心式的免疫傳感可有效提高檢測(cè)靈敏度。氧化鋅納米花具備優(yōu)異的導(dǎo)電性及催化性，在電化學(xué)傳感器構(gòu)建中常被用作電極修飾材料或載體等，但關(guān)于氧化鋅納米材料結(jié)合其他物質(zhì)作為第二抗體的標(biāo)記材料的研究較少。本研究采用氧化鋅納米花結(jié)合電活性物質(zhì)硫堇及cTnI抗體構(gòu)成檢測(cè)抗體，構(gòu)建一種雙抗體夾心式電化學(xué)免疫傳感器，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)cTnI的高靈敏快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 聚乙二醇400（macrogol 400，PEG-400）、七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）及50%戊二醛購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉（NaOH）購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTE）購(gòu)自上海默克sigmaaldrich公司；cTnI試劑盒購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；氧化鋁拋光粉購(gòu)自天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司；氯金酸購(gòu)自天津凱瑪特化工科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、硫堇購(gòu)自上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.2 主要儀器 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），KH-50B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），78HW-1型恒溫磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠），BSA124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），PHS-320酸度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司），超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司），BPH-9082精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），KDC-12低速離心機(jī)（合肥科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 方法

1.2.1 氧化鋅納米花的制備 采用直接沉淀法制備氧化鋅納米花。稱量1.076 g ZnSO4·7H2O溶于6.25 mL超純水?dāng)嚢柚镣耆芙?；然后? mL PEG-400加入ZnSO4·7H2O水溶液中攪拌混勻；再將50 mL 1.2 mol/L的NaOH溶液快速注入上述混合溶液中，緩慢攪拌5 min，超聲條件下震蕩2 h，然后靜置24 h；最后用無(wú)水乙醇與超純水交替洗滌4 次后離心（離心速度10 000 r/min，離心半徑5 cm，離心10 min），60 ℃干燥獲得氧化鋅納米花。

1.2.2 氧化鋅納米花標(biāo)記抗體 2 mL 5%的APTE與1 mL氧化鋅納米花（1 g/L）混合攪拌15 min，使氧化鋅納米花氨基化，離心洗滌除去多余的APTE；再向其中加入2 mL 2%的戊二醛交聯(lián)劑溶液，攪拌20 min后注入0.3 mL cTnI抗體原液，繼續(xù)攪拌1 h；最后加入600 μL 3 mmol/L電活性物質(zhì)硫堇，緩慢攪拌1 h使其與氧化鋅納米花充分結(jié)合后得到氧化鋅納米花、抗體及硫堇免疫復(fù)合物，保存于4 ℃冰箱以備后用。

1.2.3 電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建 電化學(xué)免疫傳感器構(gòu)建過(guò)程：1）先依次用 1.00、0.30、0.05 μm的氧化鋁拋光粉將電極表面打磨拋光，分別用無(wú)水乙醇和超純水超聲交替清洗4次。2）利用三電極系統(tǒng)，以1%氯金酸為底液，采用恒電位溶出法在電極表面修飾納米金，室溫晾干后在電極表面滴涂7 μL 25% 的cTnI抗體溶液。3）將修飾電極置于4 ℃環(huán)境中孵育30 min后取出，用超純水洗去多余抗體，再置于 BSA溶液中浸泡20 min以封閉非特異性吸附位點(diǎn)。4）將制備好的免疫傳感器與不同濃度的cTnI抗原于35 ℃ 恒溫箱中孵育25 min；取出清洗后在電極表面滴涂10 μL檢測(cè)抗體繼續(xù)孵育35 min；最后在磷酸緩沖溶液中用示差脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）檢測(cè)電信號(hào)變化（圖 1）。

圖1 cTnI電化學(xué)免疫傳感器制備過(guò)程示意圖

1.2.4 檢測(cè)方法 本研究采用DPV方法對(duì)檢測(cè)電信號(hào)進(jìn)行測(cè)定；采用循環(huán)伏安法在0.5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液內(nèi)對(duì)傳感界面構(gòu)建過(guò)程進(jìn)行研究，掃描電位區(qū)間為 -0.2～0.8 V，掃描速度為50 mV/s。

1.2.5 材料表征方法 本研究通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）對(duì)制備的氧化鋅納米花進(jìn)行表征。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化方法 1） pH優(yōu)化：因抗原抗體分子均為蛋白質(zhì)分子，pH高低均會(huì)影響蛋白質(zhì)活性。實(shí)驗(yàn)制備梯度pH（3.5、4.5、5.0、5.5、6.0）的測(cè)試底液，探究pH對(duì)該傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。將制備好的免疫傳感器置于不同pH的測(cè)試底液中，在其他條件相同的情況下，采用DPV法測(cè)得各pH下響應(yīng)電流的大小。2） 孵育溫度優(yōu)化：在一定范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運(yùn)動(dòng)，抗原與抗體碰撞機(jī)會(huì)增多，使反應(yīng)更完全，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致抗原抗體解離變性，因此溫度也是影響檢測(cè)性能的關(guān)鍵因素。其他條件保持一致，將備好的傳感器分別置于15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃溫度下孵育。3） 孵育時(shí)間優(yōu)化：孵育時(shí)間也會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合效果，保證其他條件一致，探究傳感器與待測(cè)物孵育不同時(shí)間后的電流響應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 金電極傳感界面及氧化鋅納米花表征

循環(huán)伏安法測(cè)定結(jié)果顯示，修飾有納米金粒子的電極峰電流高于裸電極。當(dāng)cTnI抗體固載到電極表面后，阻礙電子傳遞，峰電流降低。BSA與cTnI抗原的結(jié)合進(jìn)一步阻礙電子傳遞，峰電流再次降低，電極修飾成功（圖2）。材料表征結(jié)果顯示，氧化鋅納米花尺寸為1～5 μm，形態(tài)呈花狀，具有多個(gè)片層結(jié)構(gòu)，可為抗體的固載提供較大的比表面積和活性位點(diǎn)；材料分散較均勻，有助于提高抗體結(jié)合后的穩(wěn)定性（圖3）。

圖2 電極修飾過(guò)程中的循環(huán)伏安表征

圖3 氧化鋅納米花的SEM表征圖

2.2 電化學(xué)免疫傳感器的電流信號(hào)分析

在免疫傳感器識(shí)別檢測(cè)抗體后，其電信號(hào)經(jīng)DPV檢測(cè)顯示，當(dāng)溶液內(nèi)加入H2O2后，峰電流明顯增強(qiáng)，電流變化約為4 μA（圖4）。

圖4 加入H2O2前后DPV響應(yīng)電流對(duì)比圖

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化分析

當(dāng)測(cè)試底液的pH為5.5時(shí)，該免疫傳感器的電流響應(yīng)最佳；當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，電流變化最大；孵育時(shí)間為20 min時(shí)，響應(yīng)電流趨于穩(wěn)定，故最優(yōu)孵育時(shí)間為20 min（圖 5）。

圖5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化分析

2.4 電化學(xué)免疫傳感器性能分析

2.4.1 電化學(xué)免疫傳感器對(duì)不同濃度cTnI的響應(yīng)cTnI抗原濃度越大，與抗體結(jié)合形成的復(fù)合物越多，在電極表面固載的電活性物質(zhì)越多，電流變化越大。cTnI抗原濃度與電流變化之間的線性關(guān)系顯示，cTnI抗原濃度分別在0.05～0.25 μg/L和0.50～8.00 μg/L范圍內(nèi)與ΔI呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.014 3 μg/L（S/N=3）。線性回歸方程分別為電流變化= 134.42CcTnI+19.68，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.917 5；電流變化 = 1.88CcTnI+ 53.39，R2=0.942 5（圖6）。

圖6 cTnI抗原濃度與響應(yīng)電流峰差值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性分析 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，用5個(gè)相同的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)cTnI抗原溶液，經(jīng)計(jì)算得出5次電流變化平均值為34.43 μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）為 1.86%（表 1）。

表1 電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性分析（μA）

2.4.3 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性分析 在最優(yōu)條件下，用制備好的電化學(xué)免疫傳感器分別檢測(cè)2 μg/L的cTnI抗原、20 μg/L的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）與cTnI抗原的混合物、20 μg/L的熱休克蛋白90α（heat shock proteins 90α，HSP-90α）與cTnI抗原的混合物。cTnI+AFB1與cTnI+HSP-90α所測(cè)得的電流變化與cTnI抗原的電流變化相近（表2）。

表2 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性分析（μA）

2.4.4 回收率測(cè)定結(jié)果 采用加標(biāo)回收法計(jì)算電化學(xué)免疫傳感器的準(zhǔn)確度，用血液環(huán)境模擬液將cTnI抗原溶液稀釋至4.00、5.00、6.00 μg/L，用本研究的電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行測(cè)定，回收率為96.00%～104.00%（表3）。

表3 電化學(xué)免疫傳感器測(cè)定cTnI加標(biāo)回收率

3 討論

AMI是冠狀動(dòng)脈閉塞、血流中斷、心肌持久性缺血發(fā)生局部壞死而引起的疾病，嚴(yán)重危害人類健康，近年來(lái)我國(guó)AMI的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[14]。AMI起病急、變化快且不易控制，早期診斷對(duì)患者臨床治療和愈后極為重要。cTn是心肌收縮的特異性調(diào)節(jié)蛋白，由cTnI、cTnT和TnC3種不同亞基組成。目前，將cTnI和cTnT作為AMI實(shí)驗(yàn)室診斷的生化指標(biāo)，其中cTnI對(duì)心肌梗塞檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度均高于cTnT。研究[15-16]表明，cTnI可作為AMI的臨床診斷的生化指標(biāo)，能提高AMI臨床診斷的特異度和準(zhǔn)確度。電化學(xué)免疫傳感器通過(guò)對(duì)免疫反應(yīng)前后待測(cè)物濃度變化所產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)、轉(zhuǎn)換，從而對(duì)抗原抗體實(shí)現(xiàn)定量定性檢測(cè)的一類方法。該方法具備高靈敏度、低成本、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用來(lái)檢測(cè)cTnI[17]。

為提高cTnI檢測(cè)的靈敏度，本研究通過(guò)合成氧化鋅納米花來(lái)固載cTnI抗體及硫堇作為檢測(cè)抗體，構(gòu)建夾心式的cTnI免疫傳感器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化鋅納米花獨(dú)特的片層結(jié)構(gòu)為固載大量抗體及硫堇提供了豐富的位點(diǎn)；氧化鋅納米花具備優(yōu)異的類過(guò)氧化物酶活性，能通過(guò)催化底物實(shí)現(xiàn)電信號(hào)放大。納米金修飾電極可加快電子傳輸，明顯增強(qiáng)電極導(dǎo)電性。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該cTnI免疫傳感器具備較寬的線性范圍（0.05～0.25 μg/L，0.50～8.00 μg/L）與較低的檢測(cè)限（0.014 3 μg/L，S/N=3）。另外，在其他干擾物質(zhì)存在時(shí)，該電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)性能并未受到影響，表明電化學(xué)免疫傳感器具備良好的選擇性；5個(gè)相同電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)cTnI，RSD為1.86%，電化學(xué)免疫傳感器重現(xiàn)性良好；在血液模擬環(huán)境中加標(biāo)回收率為96.00%～104.00%，表明電化學(xué)免疫傳感器具備較好的準(zhǔn)確度，具備用于臨床檢測(cè)的潛在價(jià)值。Wang等[18]基于MXene設(shè)計(jì)了一種紙基cTnI電化學(xué)免疫傳感器，該方法檢測(cè)限為0.58 μg/L；沈廣宇等[19]基于雙醛基功能化離子液體構(gòu)建的cTnI電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)限為0.06 μg/L；因此本次構(gòu)建的檢測(cè)方法具有更高的靈敏度。

綜上所述，本研究基于氧化鋅納米花優(yōu)異的物理及化學(xué)特性，成功構(gòu)建一種雙抗夾心式cTnI電化學(xué)免疫傳感器，可實(shí)現(xiàn)對(duì)AMI標(biāo)志物cTnI的定量檢測(cè)，提高了cTnI檢測(cè)靈敏度與特異度。本研究提出的檢測(cè)方法為AMI早期檢測(cè)提供了新思路，但該cTnI電化學(xué)免疫傳感器在實(shí)現(xiàn)臨床自動(dòng)化、智能化、批量檢測(cè)方面仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，在技術(shù)的完善、成熟、運(yùn)用等方面依然需要不斷探索。