基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討心衰合劑治療心力衰竭的分子機制

楊 琳 王振裕 范德宇 鄭 珺 孟 袁 趙佳峪

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)2019級碩士研究生，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院干部保健科，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)2020級碩士研究生，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)2018級碩士研究生，北京 100029；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)2021級碩士研究生，北京 100029)

心力衰竭是一種慢性、自發(fā)進展性疾病，亦是各種心臟疾病的嚴重表現(xiàn)或終末階段[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，心力衰竭的發(fā)生與炎癥和重構(gòu)、心肌肥厚、離子缺陷等機制相關(guān)[2-3]，但對于心力衰竭的反復(fù)發(fā)作、患者生活質(zhì)量下降等問題尚缺乏理想的解決方案[4]。心力衰竭屬中醫(yī)學(xué)“心衰病”“心水病”“喘證”范疇。許心如教授認為其主要的病機是氣虛水停，并首創(chuàng)“瀉肺利水”法治療心力衰竭的學(xué)術(shù)觀點，以《金匱要略》中防己黃芪湯和葶藶大棗瀉肺湯為主方組成心衰合劑，藥物包括黃芪、桑白皮、車前子、葶藶子、防己、赤芍、水紅花子，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用證實具有良好的治療效果[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于不同藥物之間在結(jié)構(gòu)、功效等方面的相似性，考慮機體內(nèi)生物效應(yīng)分子、靶標分子的多種相互作用關(guān)系，通過與疾病相關(guān)基因進行聯(lián)合分析，從而構(gòu)建出“藥物-有效成分-疾病靶點”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7-8]。這與中醫(yī)從整體出發(fā)，確定理法方藥，注重中藥間的“配伍”及“君臣佐使”的特點有異曲同工之處[9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點”的多維網(wǎng)絡(luò)，探索心衰合劑治療心力衰竭的潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 心衰合劑藥物活性成分篩選及潛在靶點獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)篩選出心衰合劑中藥物的活性成分(化合物)，按照化合物口服生物利用度(OB)≥20%、化合物類藥性(DL)≥0.1篩選，并篩選出化合物相對應(yīng)的靶點。

1.2 心力衰竭疾病靶點篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)，以“Heart failure”為關(guān)鍵詞進行搜索，收集心力衰竭相關(guān)疾病靶點，使用R語言4.04軟件進行韋恩圖的繪制。

1.3 候選治療靶點的篩選 通過對心力衰竭疾病靶點和心衰合劑化合物對應(yīng)靶點取交集，獲得候選治療靶點，使用R語言4.04軟件進行韋恩圖的繪制。

1.4 構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.7.2軟件將1.3中得到的候選治療靶點構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，并對各個靶點進行分析，得到其Degree值，即每個節(jié)點的連線數(shù)目，并篩選出排名前7位活性成分作為關(guān)鍵成分，節(jié)點大小依據(jù)Degree值設(shè)置，Degree值越大則節(jié)點越大。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 利用基因間功能關(guān)聯(lián)關(guān)系數(shù)據(jù)庫(STRING)(https://string-db.org)對候選治療靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，置信度為0.95(Confidence=0.95)，去除離散的蛋白。

1.6 篩選核心治療靶點 將1.5中得到的蛋白輸入Cytoscape 3.7.2軟件，利用CytoHubba插件計算每個靶點的Degree、betweenness、eigenvecto、局部邊連通性(LAC)、network及closeness 6個參數(shù)，對這6個參數(shù)以中位值進行2次篩選，得到核心治療靶點。

1.7 候選治療靶點的基因本體(GO)功能富集分析與京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 使用R語言4.04軟件對1.3中得到的候選治療靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析系統(tǒng)包括3個部分：生物過程(BP)、分子功能(MF)及細胞組分(CC)。對差異表達基因做GO功能注釋，挖掘各個基因所代表的生物學(xué)意義。

1.8 分子對接 利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)分別下載相關(guān)有效活性成分的小分子配體的2D結(jié)構(gòu)，再通過Chem 3D軟件將所有2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)，以mol2格式保存，導(dǎo)入到AutoDock Tools 1.5.6軟件中，以“pdbqt”格式保存。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)(http://www.rcsb.org/)分別下載核心治療靶點的蛋白受體結(jié)構(gòu)，利用Pymol 2.4.1軟件去除水分子，分離原配體，保存后導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件中加氫，以“pdbqt”格式保存。最后使用Vina 1.1.2軟件進行分子對接，通過Pymol軟件實現(xiàn)分子對接結(jié)果可視化，建立對接結(jié)果模式圖。

2 結(jié)果

2.1 心衰合劑藥物活性成分篩選及潛在靶點獲取 經(jīng)過篩選，心衰合劑每種藥物的活性成分數(shù)量如下表(見表1)，運用TCMSP靶點預(yù)測模型對活性成分的作用靶點進行預(yù)測并去重，得到活性成分共216個，得到潛在作用靶點284個。

表1 心衰合劑藥物活性成分數(shù)量統(tǒng)計

2.2 心力衰竭疾病靶點篩選 經(jīng)統(tǒng)計，GeneCards數(shù)據(jù)庫共有11 208個疾病靶點，DrugBank數(shù)據(jù)庫共有103個疾病靶點，OMIM數(shù)據(jù)庫共有247個疾病靶點，PharmGKB數(shù)據(jù)庫共有1個疾病靶點，TTD數(shù)據(jù)庫共有71個疾病靶點，共得到疾病靶點1 1630個，使用R語言4.04軟件進行韋恩圖的繪制并去除重復(fù)靶點，得到疾病靶點11 215個。見圖1。

圖1 心力衰竭疾病靶點韋恩圖

2.3 候選治療靶點的篩選 對心衰合劑藥物靶點(2.1項)和心力衰竭疾病靶點(2.2項)取交集共得到255個候選治療靶點。靶點交集韋恩圖見圖2。

圖2 心衰合劑藥物-心力衰竭疾病靶點交集韋恩圖

2.4 “藥物-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)可視化 使用Cytoscape 3.7.2軟件將2.3項中得到的255個候選治療靶點進行“藥物-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)可視化(見圖3)，并篩選得到Degree值排名前7的關(guān)鍵成分依次為槲皮素(Degree值209)、山奈酚(Degree值61)、芹菜素(Degree值61)、異鼠李素(Degree值36)、黃芩素(Degree值28)、常春藤皂苷元(Degree值21)、兒茶素(Degree值13)(見表2)。

圖3 “藥物-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)

表2 心衰合劑治療心力衰竭的部分活性成分信息

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 利用STRING對2.3項中得到的255個候選治療靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，去除離散的蛋白，得到160個節(jié)點和467條邊的互作網(wǎng)絡(luò)。見圖4。

圖4 255個候選治療靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 篩選核心治療靶點 將2.5項中得到的160個蛋白輸入Cytoscape 3.7.2軟件，利用CytoHubba插件計算并篩選。首先以Degree>4、betweenness>36.7、eigenvector>0.025、LAC>1.143、network>2、closeness>0.106進行第1次篩選，由160個蛋白篩選至47個，篩選網(wǎng)絡(luò)圖中黃色節(jié)點則是篩選到的蛋白(見圖5)。接下來再以Degree> 8.5、betweenness> 26.3、eigenvector>0.126、LAC>3.055、network>4.48、closeness>0.5進行第2次篩選，由47個蛋白篩選得到15個，推測這15個蛋白為心衰合劑治療心力衰竭的核心治療靶點，依次為腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤蛋白p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、紅細胞沉降率(ESR)、Ju-Nana原癌基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14、MYC、FOS、細胞周期蛋白D1(CCND1)、C-X-C基序趨化因子8(CXCL8)、視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1(RB1)、細胞周期素依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)及IL-2。篩選網(wǎng)絡(luò)圖中黃色節(jié)點則是篩選到的蛋白(見圖6)。

圖5 第1次篩選得到的網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 第2次篩選得到的網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 候選治療靶點的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 對2.3項中得到的255個候選治療靶點進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。共富集到175個KEGG通路，主要包含脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、磷脂酰肌酶3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染信號通路等。GO富集條目2873個，其中BP 2545條，主要有藥物反應(yīng)、對脂多糖抗氧化反應(yīng)等；CC 81條，主要有膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等；MF 247條，主要有細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、受體配體活動等。把KEGG通路富集結(jié)果的前30條通路用氣泡圖展示(見圖7)，GO功能富集結(jié)果分別取BP、CC、MF的前10條目用條形圖展示(見圖8)。

圖7 255個候選治療靶點的KEGG通路富集分析氣泡圖

圖8 255個候選治療靶點的GO功能富集分析條形圖

2.8 分子對接 對所有核心治療靶點與其對應(yīng)的藥物活性成分進行分子對接處理，取結(jié)合能最小的3組進行展示(見圖9～11)。

圖9 RELA與黃芩素分子對接結(jié)果(最低結(jié)合能-9.4 kcal/mol)

圖10 FOS與黃芩素分子對接結(jié)果(最低結(jié)合能-9.6 kcal/mol)

圖11 FOS與漢防己甲素分子對接結(jié)果(最低結(jié)合能-9.7 kcal/mol)

3 討論

心衰合劑是具有利水消腫、瀉肺平喘、益氣活血功效的中藥方劑，可有效改善心力衰竭患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，相關(guān)動物實驗研究證實心衰合劑可以有效抑制慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)[10]。通過心衰合劑“藥物-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果顯示，常春藤皂苷元、山奈酚、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、兒茶素、黃芩素活性成分與候選作用靶點關(guān)聯(lián)度較大。常春藤皂苷元是一種五環(huán)三萜類化合物，體內(nèi)外研究證實常春藤皂苷元具有抗病毒、抗腫瘤、降血脂等重要的生物活性[11-12]。槲皮素、芹菜素、異鼠李素、黃芩素、山奈酚及兒茶素均屬于黃酮類化合物。槲皮素具有廣泛的心臟活性，可防止動脈粥樣硬化，體內(nèi)外實驗證實其可以拮抗心力衰竭，抑制心肌重構(gòu)，改善心功能[13-14]。芹菜素的心腦血管保護作用體現(xiàn)在抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等方面，同時芹菜素具有抗腫瘤、抗神經(jīng)退行性變及抗2型糖尿病等作用[15-16]。異鼠李素具有抗動脈粥樣硬化、抑制心肌纖維化和心肌肥大、抗高血壓、抗血栓等作用[17]。黃芩素可通過調(diào)節(jié)血管收縮、清除氧自由基等多種途徑，保護心腦血管及神經(jīng)[18-19]。山奈酚具有抗氧化、保護心肌細胞、抑制心臟成纖維細胞增殖與活化、預(yù)防心肌肥大等功效[20-21]。兒茶素具有抗氧化、抗炎等多種藥理活性，動物實驗表明其可以通過抑制過度活化的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，顯著改善大鼠心力衰竭癥狀[22]。

通過對候選治療靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析，篩選出TNF、IL-6、TP53、RELA、ESR等靶點可能為心衰合劑治療心力衰竭的核心靶點。TNF和IL-6是重要的炎癥因子，在心力衰竭、心肌細胞肥厚及凋亡中起到重要作用[23]。TNF可通過激活一氧化氮合酶、降低心肌收縮力等途徑，誘導(dǎo)心功能不全[24]，亦能通過蛋白酶途徑刺激細胞凋亡，增強基礎(chǔ)代謝，TNF-α升高會引起過度的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致左心室功能不良及負性肌力作用[25-26]。IL-6可通過促進心肌細胞凋亡、誘導(dǎo)一氧化氮產(chǎn)生、增加負性肌力等途徑，參與心力衰竭過程[27]。TP53在細胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細胞凋亡與衰老的各種過程中具有關(guān)鍵作用[28]，TP53還能夠充當心臟結(jié)構(gòu)和功能的多效調(diào)節(jié)劑，維持心臟功能穩(wěn)態(tài)[29-30]。RELA是核因子激活的核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)家族成員之一，NF-κB能夠抑制心肌細胞黏附，保護心肌損傷[31]，具有促進心肌細胞凋亡與抑制心肌細胞凋亡的雙重作用[32]。相關(guān)實驗研究表明，RELA能夠調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖、凋亡及黏附功能，從而抑制動脈粥樣硬化進展[33]。ESR在心肌肥厚及心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，其可能是通過抑制TNF-α的表達、激活A(yù)kt引起心肌細胞凋亡來實現(xiàn)的，此外ESR還能與NF-κB協(xié)作，發(fā)揮抗心臟或血管損傷的作用[34-35]。

候選治療靶點的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，主要參與了脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、PI3K/Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路等信號通路，主要涉及藥物反應(yīng)、對脂多糖抗氧化反應(yīng)等生物過程，膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等是參與反應(yīng)的主要細胞組分，分子功能主要包括細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、受體配體活動等。大量臨床研究證實，動脈粥樣硬化是心血管疾病的重要危險因素，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。PI3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)血管再生、調(diào)控細胞凋亡與自噬、調(diào)節(jié)細胞代謝、影響鈣離子通道、激活炎癥等機制在心力衰竭進程中發(fā)揮重大作用[36]。Akt是PI3K的下游基因之一，其短期活化對衰竭早期的心肌細胞有益，能夠減少心肌細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路是調(diào)控內(nèi)皮細胞的重要通路，在動員、遷移、分化及抗凋亡等方面具有明確作用，進而參與流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化途徑[37]。同時流體剪切應(yīng)力在心血管系統(tǒng)疾病中起著重要的作用，可影響內(nèi)皮細胞的形態(tài)與功能[38]。膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)均是細胞膜的結(jié)構(gòu)組成，故推測細胞膜是發(fā)生生物反應(yīng)和進行分子功能活動的主要位置。

最后對核心治療靶點及其對應(yīng)的活性成分進行分子對接，得到3組結(jié)合能最小的組合：RELA與黃芩素結(jié)構(gòu)(最低結(jié)合能-9.4 kcal/mol)、FOS與黃芩素結(jié)構(gòu)(最低結(jié)合能-9.6 kcal/mol)、FOS與漢防己甲素結(jié)構(gòu)(最低結(jié)合能-9.7 kcal/mol)。核心治療靶點在與活性成分的分子對接模擬中呈現(xiàn)了良好的結(jié)合活性，驗證了核心治療靶點和活性成分的合理性。以上結(jié)果表明黃芩素、漢防己甲素等活性分子可能作為潛在的藥物小分子作用于TNF、IL-6、TP53、RELA、ESR、FOS等受體蛋白，進而改善心力衰竭的癥狀。

綜上所述，心衰合劑治療心力衰竭可能是通過常春藤皂苷元、山奈酚、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、兒茶素、黃芩素等活性成分，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號等通路，作用于TNF、IL-6、TP53、RELA、ESR等靶點，涉及炎性反應(yīng)、細胞凋亡、細胞增殖等機制，集中于膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等區(qū)域來實現(xiàn)的。后續(xù)研究中，我們將進一步尋找心衰合劑藥物活性成分，篩選關(guān)鍵靶點與通路，分析心衰合劑多成分、多靶點、多途徑治療的可能作用機制，為臨床應(yīng)用提供參考。