血清miR-1273g-3p在慢性丙型肝炎肝纖維化診療中的作用研究※

賈英杰 張曉博 張新元 楊紅霞 郭爭榮

(河北省石家莊市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050011)

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染引起的一種慢性肝炎。近年來HCV相關(guān)肝纖維化的研究隨著分子生物學(xué)的發(fā)展逐漸向纖維化發(fā)生相關(guān)基因轉(zhuǎn)移[1-2]。微小RNA(microRNA,miR)是一種非編碼單鏈RNA,長約22 nt[3-6]。有研究表明，人類肝星狀細(xì)胞和激活后的肝星狀細(xì)胞在靜息狀態(tài)下有miRNAs水平差異存在，循環(huán)血液中miR-1273g-3p水平可有效反映肝功能損害和肝纖維化程度[7-9]。2018年1月至2020年1月，我們采用利巴韋林聯(lián)合強肝膠囊防治CHC相關(guān)肝纖維化60例，并通過觀察患者外周血miR-1273g-3p水平變化,探討其在CHC肝纖維化診療中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北省石家莊市人民醫(yī)院消化內(nèi)科收治的CHC患者60例作為研究組，男36例，女24例，年齡22～54歲，平均(38.14±6.36)歲。另選取同期健康體檢人員60例作為健康對照組，男38例，女22例，年齡21～53歲，平均(37.25±6.12)歲。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) CHC參照《丙型肝炎防治指南(2019年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合上述CHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者知情并自愿參加本研究，簽署知情同意書，經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒感染者；合并酒精性、藥物性及自身免疫性肝病者；合并人類免疫缺陷病毒感染者；病情處于失代償期肝硬化者。

1.3 治療方法 研究組給予利巴韋林片(廣東華南藥業(yè)集團有限公司，國藥準(zhǔn)字H10950323)3粒，每日3次口服；強肝膠囊 (石家莊東方藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10980012) 5粒，每日2次口服。共治療24周。健康對照組不做任何相關(guān)藥物治療。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 肝纖維化分期 研究組患者治療前首先在B超引導(dǎo)下通過肝穿刺活檢術(shù)進行肝組織病理學(xué)檢查，在10%甲醛溶液中置入2～3條肝組織，固定，送檢，分別進行肝組織HE染色及Masson染色，顯微鏡下觀察，并運用Metavir評分系統(tǒng)對肝纖維化程度進行判定，分析血清miR-1273g-3p與CHC肝纖維化的相關(guān)性。F 0期：無纖維化；F 1期：小葉、竇周內(nèi)纖維化；F 2期：纖維化向匯管區(qū)周圍擴大；F 3期：小葉結(jié)構(gòu)紊亂伴纖維間隔形成，無肝硬化；F 4期：早期肝硬化[11-12]。

1.4.2 血清miR-1273g-3p檢測 2組治療前后均采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法檢測血清miR-1273g-3p的相對表達量，相關(guān)檢測按照試劑盒說明書進行。本研究以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，所涉及引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 研究組患者CHC肝纖維化分期及病理表現(xiàn)情況 研究組肝纖維分期情況：F 0期14例，F(xiàn) 1～2期21例，F(xiàn) 3～4期25例。F 0期患者肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常；F 1～2期患者肝板排列整齊，小葉內(nèi)可見點灶狀炎細(xì)胞浸潤，竇周纖維化不明顯，匯管區(qū)輕度擴大，纖維組織輕度增生，呈星芒狀向小葉內(nèi)伸展；F 3～4期患者可見肝細(xì)胞極度水樣變、氣球樣變，竇周纖維化，匯管區(qū)明顯擴大，可見淋巴濾泡結(jié)構(gòu)形成，肝小葉內(nèi)纖維組織增生明顯，可見纖維間隔形成。見圖1。

圖1 研究組患者CHC肝纖維化情況

2.2 CHC肝纖維化與血清miR-1273g-3p相關(guān)性分析 與健康對照組比較，研究組CHC肝纖維化F 1～2期及F 3～4期患者miR-1273g-3p相對表達量均升高(P<0.05)，F(xiàn) 0期患者與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究組不同分期患者組間比較，F(xiàn) 1～2期及F 3～4期患者miR-1273g-3p相對表達量均高于F 0期患者(P<0.05)，且F 3～4期患者miR-1273g-3p相對表達量高于F 1～2期(P<0.05)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)性分析顯示，CHC肝纖維化分期與血清miR-1273g-3p相對表達量呈正相關(guān)(r=0.656，P<0.05)。見表2。

表2 CHC肝纖維化與血清miR-1273g-3p相關(guān)性分析

2.3 2組治療前后血清miR-1273g-3p相對表達量比較 與本組治療前比較，研究組CHC肝纖維化F 1～2期及F 3～4期患者治療后血清miR-1273g-3p相對表達量均降低(P<0.05)，研究組CHC肝纖維化F 1～2期及F 3～4期患者治療后血清miR-1273g-3p相對表達量均高于健康對照組(P<0.05)。研究組CHC肝纖維化F 0期患者和健康對照組治療前后血清miR-1273g-3p相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且2組組間比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組治療前后血清miR-1273g-3p相對表達量比較

3 討論

CHC是臨床上慢性肝炎的主要表現(xiàn)類型之一，以HCV感染后導(dǎo)致的肝臟損傷為主要表現(xiàn)，如不及時治療則可進一步導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，最終可發(fā)展為肝硬化,甚至肝癌，對患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅。通常情況下由于肝臟具有強大的代償能力，CHC患者早期并不會出現(xiàn)明顯的癥狀體征，隨著病情發(fā)展患者可出現(xiàn)容易疲倦、渾身乏力、無精打采等肝纖維化的早期癥狀，并可伴有食欲下降甚至惡心、嘔吐等，部分患者在早期還會表現(xiàn)為肝區(qū)的疼痛不適[13]。中、重度的CHC肝纖維化患者則會出現(xiàn)肝掌、蜘蛛痣等體表皮膚的改變，甚至部分患者的肝臟會出現(xiàn)腫大，其次患者的凝血功能也會出現(xiàn)改變，表現(xiàn)為肝臟凝血酶原及其他凝血因子發(fā)生合成障礙，出現(xiàn)牙齦出血等[14-15]。現(xiàn)代研究表明，肝纖維化在組織學(xué)上并非不可逆，通過積極有效的治療可有效阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生，因此快速有效的對CHC患者肝纖維化情況做出評估和判斷具有重要的臨床意義。肝活檢進行組織病理學(xué)觀察雖是肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬于有創(chuàng)性檢查手段，易出現(xiàn)疼痛、出血、感染等并發(fā)癥，探索新的檢查方法和觀察指標(biāo)一直是臨床研究的重點之一[16]。

miR是機體內(nèi)的一類非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、自噬等過程，具有重要的生物學(xué)作用。miR調(diào)控的靶基因主要有血小板衍生生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR在轉(zhuǎn)化TGF-β/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Smad)信號通路中發(fā)揮著重要作用，TGF-β/Smad信號通路增強可導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)上調(diào),從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解降低，同時還可以促進VEGF等纖維化因子活化,從而促進肝纖維化的發(fā)生[18]。牛學(xué)敏[19]研究表明，HCV肝纖維化患者血清miR-1273g-3p的水平較正常健康患者明顯上調(diào)，并在中、重度肝纖維化患者中水平更高，提示miR-1273g-3p與CHC肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進一步體外實驗表明，靶向抑制miR-1273g-3p表達可減少肝星狀細(xì)胞的活化與增殖，并促進其凋亡，減少膠原分泌，從而減輕肝纖維化的進展。本研究結(jié)果顯示，研究組CHC肝纖維化F 1～2期及F 3～4期患者治療前miR-1273g-3p相對表達量均高于健康對照組(P<0.05)，且miR-1273g-3p相對表達量隨著肝纖維化分期嚴(yán)重程度的增加而明顯升高(P<0.05)，具有正相關(guān)性(r=0.656，P<0.05)，提示血清miR-1273g-3p表達水平變化可作為評估CHC肝纖維化分期情況的觀察指標(biāo)。

目前臨床上對于CHC的治療仍以抗病毒對癥治療為主，利巴韋林是臨床上常用的抗病毒藥，可通過阻礙病毒核酸的合成而對病毒起到抑制作用[20]。強肝膠囊是臨床治療慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝等常用的中成藥。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CHC雖然臨床證候錯綜復(fù)雜,但其基本病機是正衰邪盛,濕熱未盡兼有血瘀[21]。強肝膠囊由茵陳、板藍(lán)根、秦艽、當(dāng)歸、白芍、丹參、郁金、黃芪、黨參、澤瀉、黃精、熟地黃、山藥、山楂、六神曲及甘草組成，方中茵陳、板藍(lán)根、秦艽清熱利濕解毒，清肝利膽退黃；當(dāng)歸、白芍補血活血，養(yǎng)血柔肝；丹參、郁金活血止痛，行氣解郁；黃芪、黨參補中益氣，扶正固表；澤瀉利水滲濕，化濁降脂；黃精、熟地黃補氣養(yǎng)陰，健脾益腎；山藥、山楂、六神曲健脾和胃，消食調(diào)中；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏健脾益氣、扶正祛邪、祛濕化瘀、清肝利膽的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參可改善肝臟血液循環(huán)，提高膠原酶活性，從而促進纖維降解，減輕炎性反應(yīng)，促進肝細(xì)胞修復(fù)，抗肝纖維化作用明確，其機制可能與下調(diào)細(xì)胞因子、阻斷肝臟枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的活化，減少膠原組織的合成，以及促進自由基的清除和抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)[22]；黃芪可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，降低膠原蛋白含量及膠原在肝臟中的沉積，從而起到抗肝纖維化的作用[23]；當(dāng)歸可抑制纖維細(xì)胞的再生及膠原的沉積，可促進肝細(xì)胞再生、促進白蛋白合成[24]；茵陳可以預(yù)防實驗性肝損傷,減輕肝細(xì)胞炎癥程度[25]。本研究結(jié)果顯示，研究組CHC肝纖維化F 1～2期及F 3～4期患者治療后血清miR-1273g-3p相對表達量較治療前均明顯降低(P<0.05)，但其治療后水平仍高于健康對照組(P<0.05)，這也驗證了血清miR-1273g-3p水平與CHC肝纖維化相關(guān)的結(jié)論。

綜上所述，血清miR-1273g-3p可作為評估CHC肝纖維化程度的重要指標(biāo)，對CHC肝纖維化的分期診斷及預(yù)后評估均有指導(dǎo)意義。