電針聯(lián)合rTMS對脊髓損作大鼠損傷脊髓NGF、NT-3蛋白表達(dá)的影響

曹祖懋,趙亞莉,葉 青,胡 煜,李志剛△,時素華,姚海江

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；3.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，北京 100068)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)一般是指受到外傷作用而導(dǎo)致的損傷節(jié)段平面以下功能和感覺功能喪失的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康。研究表明在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，軸突在受傷后再生十分困難且受到嚴(yán)格的條件限制，這種缺乏再生的能力可歸因于成年后減弱了內(nèi)在生長程序的激活以及缺乏生長允許分子，并含有許多生長抑制分子的局部環(huán)[1]。NGF、NT-3是經(jīng)典神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的成員，在促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù)中發(fā)揮了重要的作用[2]。目前的研究結(jié)果表明電針和重復(fù)性經(jīng)顱磁刺激都對SCI大鼠的功能恢復(fù)起到促進(jìn)作用：電針可通過抑制SCI后的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與促進(jìn)神經(jīng)再生等方式來影響神經(jīng)功能的恢復(fù)[3-5]。而重復(fù)性經(jīng)顱磁刺激(rTMS)在SCI后可促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束的神經(jīng)可塑性[6]，作為一種潛在的新的非侵入性治療方法慢慢在SCI康復(fù)中嶄露頭角。本課題組前期研究已經(jīng)證實“通督”電針可促進(jìn)SCI大鼠受損脊髓節(jié)段的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)[7]。然而關(guān)于電針聯(lián)合rTMS治療SCI效果的研究相對較少，故本研究運(yùn)用電針聯(lián)合rTMS干預(yù)SCI大鼠，意在觀察大鼠神經(jīng)功能評分及其損傷部位神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、NT-3的表達(dá)，評價電針聯(lián)合rTMS對SCI的治療效果，為臨床運(yùn)用電針聯(lián)合rTMS治療SCI提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，體質(zhì)量為180～220 g，由北京維通利華公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房，給予自然照明和自由攝食、飲水，室溫(25±2)℃,濕度45%～55%。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)入實驗。隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組、rTMS組與聯(lián)合組(電針+rTMS)，其中模型組、電針組、rTMS組與聯(lián)合組再隨機(jī)分為1 d組與7 d組，各12只。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑 rabbit anti-NGF(美國Abcam公司ab52918);rabbit anti-NT-3(美國Abcam 公司ab16640);碘伏消毒劑(北京聯(lián)昌衛(wèi)生消毒用品有限公司);75% 消毒酒精(邯鄲市捷利康商貿(mào)有限公司);4% 組織細(xì)胞固定液(北京酷來搏科技有限公司);兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Western Blotting檢測試劑盒(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);尼氏染色液、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2.2 儀器 Allen’s打擊裝置(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所);電推剪(深圳市科德士電器有限公司);韓氏電療儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);華佗牌針灸針(0.3 mm×25 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);經(jīng)顱磁刺激儀(武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);RM2235 組織切片機(jī)(德國LEICA公司);BX53自動化智能型正置研究級顯微鏡(日本OLYMPUS公司);移液器(德國eppendorf);電泳儀(美國Bio-rad Power Supplies Basic);臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司 THZ-312)多功能酶標(biāo)儀(美國MD Spectramac M3)、PH計(美國OHAUS STARTER 2C);分析天平(中國精密分析天平 JA3003)。

1.3 造模方法

術(shù)前8 h禁食禁水，手術(shù)器械消毒1 h，大鼠稱重后以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，放置于自制弓形手術(shù)臺上，剃去后背毛發(fā)后消毒，以T10棘突呈中立位為標(biāo)志，向上依次定位T9～11，用手術(shù)刀分離后背肌肉，暴露T9～11段棘突和椎板；眼科彎剪剪除T10椎板及其上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突，暴露脊髓；采用自制的改良式Allen’s打擊裝置，致傷量為10 g×5 cm，造成T10～11節(jié)段脊髓損傷，快速縫合傷口，瓦燈照射大鼠直至清醒，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，保持墊料干燥，定時膀胱擠壓幫助排尿。造模后待老鼠清醒給予5 μ單位青霉素鈉，防止感染，假手術(shù)對照組只暴露脊髓，不損傷，然后縫合傷口。評價模型是否成功的依據(jù)為：①身體痙攣性顫動；②尾巴痙攣性擺動；③硬脊膜內(nèi)充血或血腫，麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 “通督”電針組 參照全國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜” 選取相當(dāng)于人體解剖部位的“大椎”“命門”。用華佗牌規(guī)格0.25 mm×15 mm毫針進(jìn)行針刺，進(jìn)針約0.6 cm。針柄連接韓氏電療儀，上接陰極，下接陽極，持續(xù)脈沖電流，頻率2 Hz，強(qiáng)度2 mA， 治療時間20 min， 輸出強(qiáng)度在剛開始時以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度，待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。1 d于造模清醒后2 h治療1次，以后同一時間每天重復(fù)治療1次，持續(xù)到達(dá)預(yù)定時間。

1.4.2 rTMS組 采用YRD CCY-I型磁刺激儀(武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公司)，脈沖磁場峰值強(qiáng)度為 3 T。造模 1 d 后，將清醒狀態(tài)下的大鼠置于固定器中，頭部固定，圓形線圈(直徑70 mm)磁場中心置于大鼠左前囟上方，強(qiáng)度為最大強(qiáng)度(3 T)的21%。刺激頻率 5 Hz。每序列2 s，間歇28 s，共15 min。1 d于造模清醒后2 h治療1次，以后與1 d同一時間每天重復(fù)治療1次，持續(xù)到達(dá)預(yù)定時間。

1.4.3 聯(lián)合組 干預(yù)方法同電針組和rTMS組。

1.4.4 空白組 相同飼養(yǎng)條件下不做任何處理。

1.4.5 模型組及假手術(shù)組 造模后也不做任何處理，但均要在督脈電針、經(jīng)顱磁刺激治療時抓取1次，以保證處理條件相同。

1.5 行為學(xué)評價

大鼠BBB運(yùn)動功能評分[8]：分別于大鼠造模后1 d、3 d與7 d同一時間由2位熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)且不知道分組的研究人員進(jìn)行分?jǐn)?shù)評定，用以評定大鼠后肢各關(guān)節(jié)活動、步態(tài)及協(xié)調(diào)功能和運(yùn)動中爪的精細(xì)動作。最后取其平均值作為其最終得分。

1.6 HE染色和尼氏染色

分別在術(shù)后1 d、7 d治療相應(yīng)天數(shù)后取各組大鼠6只，以10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉，打開胸腔，充分暴露心臟。用灌注針從心尖部插入直至主動脈，剪開右心耳，灌注生理鹽水；待肝臟顏色呈灰白色且從心臟流出的液體由紅色變成透明清亮的液體時，灌注4%多聚甲醛溶液，待大鼠出現(xiàn)四肢抽搐及全身僵硬、肝臟變硬可停止灌注。以脊髓打擊點(diǎn)為中心，剝離肌肉取出T9～11脊髓節(jié)段，浸入到4%多聚甲醛溶液中固定。將固定好的組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋和切片。分別進(jìn)行HE染色和尼氏染色。

1.7 Western Blot

分別在術(shù)后1 d、7 d用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，迅速剪下大鼠損傷節(jié)段脊髓，剝離肌肉與脊柱，將脊髓組織研磨后提取組織蛋白，用BCA法測量蛋白濃度，每組取相同質(zhì)量的蛋白變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至目的條帶進(jìn)入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)，轉(zhuǎn)至NC膜，將NC膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩2 h；一抗[NGF(1∶1 000)、NT-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)]的平皿中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗(1∶1 000)室溫反應(yīng)2 h，隨后用ECL顯影液顯影，使用ChemiDoc MP Imaging System成像，最后使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

術(shù)后1 d，模型組及各干預(yù)組BBB評分顯著下降，模型組與各干預(yù)組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后3 d，各干預(yù)組較模型組評分上升，但均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且各干預(yù)組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后7 d，rTMS、電針、聯(lián)合組與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，rTMS組與電針組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，rTMS與聯(lián)合組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，電針組與聯(lián)合組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時間段BBB評分比較

2.2 HE染色

空白組和假手術(shù)組形態(tài)規(guī)整，輪廓清晰，中間的灰質(zhì)呈蝴蝶狀。損傷后1 d，模型組可見脊髓組織結(jié)構(gòu)被破壞，灰、白質(zhì)界限模糊，灰質(zhì)內(nèi)觀察到大量血細(xì)胞的浸潤，出血嚴(yán)重，且有空泡形成，灰質(zhì)區(qū)域的運(yùn)動神經(jīng)元大量死亡，神經(jīng)元數(shù)目較空白組和假手術(shù)組明顯減少，各治療組與模型組病理改變相似,但出血現(xiàn)象相對減少。損傷后7 d，模型組可見血細(xì)胞聚集減少，白質(zhì)與灰質(zhì)的邊界仍然模糊不清，灰質(zhì)部位神經(jīng)元數(shù)量極少，大量小膠質(zhì)細(xì)胞增生，各干預(yù)組出血較模型組減少，神經(jīng)元開始出現(xiàn)清晰的邊緣，且神經(jīng)元數(shù)量也比模型組多，出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增生，但較模型組相對要少。見圖1。

圖1 各組大鼠不同時間點(diǎn)受損脊髓(HE染色,bar=50 μm)

2.3 尼氏染色

空白組和假手術(shù)組灰質(zhì)區(qū)域中的運(yùn)動神經(jīng)元胞漿中有呈藍(lán)紫色的斑塊狀或條索狀顆粒的尼氏體，造模后1 d模型組及各干預(yù)組神經(jīng)元數(shù)量減少，且部分神經(jīng)元尼氏體結(jié)構(gòu)模糊，樹突和軸突較少。造模7 d后，模型組和rTMS組有少量尼氏體重現(xiàn)，電針組和聯(lián)合組重現(xiàn)尼氏體數(shù)量較模型組和rTMS組多。見圖2。

圖2 各組大鼠不同時間點(diǎn)受損脊髓(尼氏染色,bar=50 μm)

2.4 NGF的表達(dá)

術(shù)后1 d，模型組及各干預(yù)組NGF含量顯著下降，模型組與各干預(yù)組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后7 d，rTMS組、電針組、聯(lián)合組與模型組比較NGF含量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，電針組與rTMS組比較NGF含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組與rTMS組相比NGF含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組與電針組比較NGF含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

注:1.空白組；2.假手術(shù)組；3. 1 d模型組；4. 1 d rTMS組;5.1 d電針組;6. 1 d聯(lián)合組；7. 7 d模型組；8. 7 d rTMS組;9.7 d 電針組；10. 7 d聯(lián)合組。圖3 各組大鼠受損脊髓組織NGF、NT-3蛋白的表達(dá)情況

表2 各組大鼠術(shù)后不同時間段NGF的表達(dá)

2.5 NT-3的表達(dá)

術(shù)后1 d，模型組及各干預(yù)組NT-3含量顯著下降，模型組與各干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后7 d，rTMS組與模型組比較NT-3含量增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，電針組、聯(lián)合組與模型組比較NT-3含量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，電針組與rTMS組比較NT-3含量增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，聯(lián)合組與rTMS組比較NT-3含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組與電針組比較NT-3含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組大鼠術(shù)后不同時間段NT-3的表達(dá)

3 討論

《難經(jīng)》云：“督脈者，……起于下級之俞，并入脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”，由此可見督脈與現(xiàn)代脊髓的解剖位置高度重合，因此督脈和脊髓有著密切的聯(lián)系，同時《黃帝內(nèi)經(jīng)》中還記載：“身有所傷，血出多及中風(fēng)寒，若有所墜墮，四肢懈惰不收，名曰體惰”以及“督脈為病，脊強(qiáng)反折……治在骨上”。描述了中醫(yī)對SCI的認(rèn)識，并且明確了治療應(yīng)當(dāng)從督脈著手。SCI的本質(zhì)為督脈受損，而督脈統(tǒng)督一身陽氣，為陽脈之海，督脈受損則連及手足三陽經(jīng)，從而導(dǎo)致四肢活動不能與二便失禁[9]?！按笞怠睘槭肿闳柦?jīng)與督脈的交會穴，有統(tǒng)攝一身陽氣的功用，針刺可通督行氣，而“命門”位于兩腎之間，為元?dú)庵?，生命之門戶，針刺可益氣壯陽。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和發(fā)育過程中，軸突再生和突觸連接對于SCI后實現(xiàn)最佳功能恢復(fù)至關(guān)重要[10]。在過去的幾十年中，許多的治療策略，包括針刺治療旨在改善損傷脊髓神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生能力[11-13]，SCI后的各種繼發(fā)性損傷致使孕育不利于神經(jīng)再生的微環(huán)境。導(dǎo)致SCI后不能成功修復(fù)的原因可歸結(jié)于[14-16]:①受損神經(jīng)元生長能力弱；②由于過度炎癥激活和髓鞘碎片積聚導(dǎo)致再生微環(huán)境惡化；③膠質(zhì)瘢痕、囊腔和抑制分子的形成。因此，如何改善受損神經(jīng)元的內(nèi)在能力以及如何為軸突再生創(chuàng)造最佳微環(huán)境是恢復(fù)SCI的關(guān)鍵問題。神經(jīng)營養(yǎng)因子(NFT)是再生軸突微環(huán)境中的一組關(guān)鍵因素，除了可以滋養(yǎng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，還參與損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)[17-18]。

NGF是第一個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其特異性受體為TrkA，在發(fā)育過程中，神經(jīng)系統(tǒng)突觸后細(xì)胞負(fù)責(zé)大部分NGF釋放，從而引導(dǎo)適當(dāng)?shù)陌猩窠?jīng)支配。NGF與TrkA在交感和感覺軸突終末結(jié)合，然后復(fù)合物NGF/TkA逆行運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)元細(xì)胞體，在那里激活神經(jīng)元存活和分化的分子途徑，有研究表明：NGF能提高細(xì)胞生長速度和分化且促進(jìn)神經(jīng)突的發(fā)育，可積極增強(qiáng)AD患者的記憶和學(xué)習(xí)能力[19-20]，NGF也能夠直接與髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)相互作用，調(diào)節(jié)軸突生長和存活，這種新機(jī)制可能介導(dǎo)生長軸突和髓鞘形成之間的通訊[21]，從而促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)。NT-3是基于NGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子同源性而發(fā)現(xiàn)的，有充分證據(jù)表明，NT-3不僅在神經(jīng)元的發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用，而且在受損神經(jīng)元的存活和軸突再生中也發(fā)揮著重要作用。NT-3已顯示影響微管相關(guān)蛋白2(MAP2)的基因表達(dá)，該蛋白被認(rèn)為與神經(jīng)系統(tǒng)生長過程中的活躍軸突生長有關(guān)[22-24]；此外，還有研究證明了將NT-3局部注射到固定的皮質(zhì)脊髓束(CST)靶區(qū)能夠促進(jìn)CST側(cè)索發(fā)育，這對于靶區(qū)發(fā)現(xiàn)、神經(jīng)支配和突觸形成是必要的。更重要的是NGF和NT-3可通過抑制SCI后一氧化氮(NO)過多釋放所致的神經(jīng)毒性作用和抑制Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，對SCI后神經(jīng)元凋亡起抑制作用，從正反兩個方面促進(jìn)SCI后的恢復(fù)[25]。

TMS的基本原理為通過線圈引導(dǎo)幾個特斯拉的磁場，隨著磁場的快速變化，會產(chǎn)生感應(yīng)電流。雖然TMS誘導(dǎo)的磁場力在通過腦外組織(頭皮、骨骼與腦膜)會降低，但它仍然能夠誘導(dǎo)足以使淺表軸突去極化并激活皮質(zhì)中的網(wǎng)絡(luò)的電流[26]，從而調(diào)節(jié)一系列生理生化反應(yīng)，雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)功能的長時程增強(qiáng)或長時程抑制，從多水平發(fā)揮神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)。而rTMS則是在此基礎(chǔ)上的特定大腦區(qū)域給予重復(fù)的磁刺激，rTMS可以激活不同水平的神經(jīng)元，不僅產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，而且影響局部和功能相關(guān)的遠(yuǎn)側(cè)皮層功能，實現(xiàn)皮層功能的區(qū)域重建。來自大腦的更多神經(jīng)沖動沿著脊髓傳遞到運(yùn)動神經(jīng)元，因此可以最大限度地利用殘留的神經(jīng)纖維連接；這不僅有助于SCI后的神經(jīng)再生，還可以增強(qiáng)大腦的可塑性[27]。研究表明：若想要起到增強(qiáng)大腦皮質(zhì)的興奮性作用，則刺激強(qiáng)度應(yīng)≥5 Hz，而當(dāng)刺激強(qiáng)度≤1 Hz時，則會降低大腦皮質(zhì)的興奮性[28]。研究表明：rTMS在治療SCI后痙攣、神經(jīng)性疼痛以及促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)方面展現(xiàn)出了良好的療效[6,29-30]。其可能的機(jī)制是rTMS通過刺激患者的大腦皮質(zhì)，產(chǎn)生興奮效應(yīng)，促使殘余的下行皮質(zhì)脊髓通路的開放，改變細(xì)胞興奮性，加速神經(jīng)細(xì)胞再生、誘導(dǎo)軸突側(cè)芽生長、促進(jìn)神經(jīng)重塑進(jìn)而促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)[31]。

現(xiàn)代研究表明電針可以通過提高機(jī)體清除自由基的能力，排除微環(huán)境中不利于脊髓恢復(fù)的因素，降低了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，從而減少脊髓的繼發(fā)性損害，為脊髓的恢復(fù)提供了前提條件，電針可以減少細(xì)胞凋亡、引導(dǎo)再生的軸突穿過脊髓損傷區(qū)并沿著正確的路徑生長、促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)促進(jìn)神經(jīng)元再生并建立新的突觸聯(lián)系。故以電針刺激督脈治療SCI，有著較為理想的療效[3-5]。前面已經(jīng)闡述中醫(yī)認(rèn)為SCI與督脈關(guān)系密切，而“督脈入絡(luò)腦”，表明SCI與大腦也有緊密的聯(lián)系，現(xiàn)在也有研究表明因為脊髓結(jié)構(gòu)完整性以及脊髓與大腦間雙向通信流中斷，SCI可導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)和功能的重塑[32]。電針和經(jīng)顱磁刺激分別從脊髓和大腦兩個方向治療SCI，且都取得了良好的效果，然而關(guān)于二者聯(lián)合應(yīng)用的研究還相對較少，故本研究從神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)SCI后神經(jīng)再生的角度切入觀察、分析SCI大鼠受損脊髓節(jié)段NGF、NT-3的表達(dá)情況。從促進(jìn)神經(jīng)再生的角度去探討電針聯(lián)合經(jīng)顱磁刺激對脊髓損傷后的神經(jīng)可塑性的影響，為“通督”電針聯(lián)合rTMS干預(yù)的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

本研究結(jié)果中，術(shù)后7 d rTMS組與模型組相比NT-3含量雖然增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其可能的原因是對于NT-3蛋白來說，7 d的rTMS治療時間較短，未能產(chǎn)生積累效應(yīng)，然而聯(lián)合組NT-3蛋白含量最高，則可能是rTMS與電針聯(lián)合后產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，值得注意的是，神經(jīng)元的去極化可導(dǎo)致神經(jīng)元膜上L型電壓門控Ca2+通道(L-VGCC)的開放和鈣內(nèi)流的增加。此外，神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的鈣流入可刺激鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMKs)通路，并激活神經(jīng)元合成和分泌NT-3等神經(jīng)營養(yǎng)因子[33-36]。電針可誘導(dǎo)神經(jīng)元去極化，同時rTMS的作用機(jī)制也與神經(jīng)元的去極化有關(guān)。這可能是協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制之一，而選擇1 d和7 d這兩個時間點(diǎn)的原因則是：一方面可以看損傷后的即刻反應(yīng)，表明SCI后大量神經(jīng)元等細(xì)胞壞死，二來是更好地表現(xiàn)各干預(yù)的療效，與模型組更好地進(jìn)行比較，反映出一個動態(tài)變化的過程。

本研究從電針聯(lián)合rTMS促進(jìn)SCI后大鼠脊髓組織細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)素NGF和NT-3蛋白的角度，明確了二者都能促進(jìn)損傷大鼠的功能恢復(fù)，且二者聯(lián)合的效果更好，其具體的機(jī)制可進(jìn)一步研究探討，以期為電針聯(lián)合rTMS治療SCI的應(yīng)用提供更加明確的依據(jù)。