針刺“百會(huì)”透“曲鬢”通過miR-34a-5p/KLF4信號(hào)通路治療腦出血大鼠的機(jī)制研究

李 丹，朱 曦，鄧曉豐，李 龍

(1.黑龍江神志醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

腦出血(Intracerebral hemorage，ICH)作為一種非創(chuàng)傷性的因腦內(nèi)血管破裂導(dǎo)致血液聚積在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的疾病，是一種以病情兇險(xiǎn)、病死率高為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國的腦出血發(fā)病率為0.045%，患病率為0.215%，死亡率為0.060%，而3個(gè)月致死致殘率則高達(dá)40.4%～59.5%[2]。同時(shí)腦出血康復(fù)后仍有很高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，且其致殘的嚴(yán)重程度不一，大多數(shù)表現(xiàn)為行動(dòng)和意識(shí)障礙[3]。高血壓、睡眠呼吸暫停綜合征、年齡、性別與抗凝藥物使用甚至醫(yī)療保險(xiǎn)不健全等都可能成為引起腦出血的危險(xiǎn)因素[4]。目前內(nèi)科與外科均有一些治療腦出血的方法，但目前尚未明確哪一種方法能夠有效改善腦出血的不良預(yù)后。闡明腦出血損傷的機(jī)制，研究有效的治療方法，已成為這一疾病研究需要盡快解決的首要問題。

隨著對(duì)腦出血治療機(jī)理研究的不斷深化，研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在腦卒中患者血液中的表達(dá)上調(diào)[5]，在腦出血大鼠腦組織中，KLF4的表達(dá)顯著降低。近年有研究發(fā)現(xiàn)“百會(huì)”透“針刺”療法能夠?qū)Υ笫笊窠?jīng)功能學(xué)評(píng)分產(chǎn)生正向影響[6]。在血管內(nèi)皮中過度表達(dá)的miR-34a-5p還會(huì)破壞血腦屏障，使線粒體功能發(fā)生障礙[7]。作為一種鋅指蛋白，KLF4能夠通過易位表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而促進(jìn)血管新生[6]。在腦組織中，高表達(dá)的KLF4還可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[8]、調(diào)控上皮細(xì)胞-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9]和使得支持細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化[10]等，可在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中產(chǎn)生影響。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，針刺在治療腦出血這一損傷時(shí)具有積極作用[11-12]，但其治療腦出血的機(jī)制尚不明確，亟需進(jìn)一步研究?！鞍贂?huì)”透“曲鬢”針刺療法的作用已得到眾多實(shí)驗(yàn)的證實(shí)[13-15]，但該療法的具體作用機(jī)理還沒有闡釋明確?，F(xiàn)有研究大都從細(xì)胞因子表達(dá)層面上進(jìn)行研究[16-17]，但其對(duì)于minRNA及mRNA表達(dá)的影響尚需進(jìn)一步闡釋。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)“百會(huì)”透“曲鬢”針刺療法上調(diào)了KLF4表達(dá)水平，下調(diào)了miR-34a-5p的表達(dá)水平，推測(cè)調(diào)節(jié)miR-34a-5p/KLF4信號(hào)通路是“百會(huì)”透“曲鬢”針刺療法能夠減輕腦出血后神經(jīng)損傷的途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取60只清潔級(jí)健康的雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，使用許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008，3月齡，體質(zhì)量250～300 g，大鼠全部采用分籠飼養(yǎng)于溫度(25±1)℃、濕度45%～55%和明暗周期12 h/12 h循環(huán)環(huán)境下，自由飲食。按隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)均分5組，每組又隨機(jī)分1 d和7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理分委員會(huì)審批(編號(hào)No:BUVM-4-2021122002-4106)。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器 NW10LVF型超純水系統(tǒng)(香港,Heal Force);H-2050R型超速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙,湖南湘儀);Proline型微量移液器(蘇州,BIOHIT);DZF-6050型真空干燥箱(上海,SYSBERY);NANO 2000型紫外分光光度計(jì)(美國,Thermo);PVDF膜(美國,Thermo Fisher Scientific公司);Exicycler 96型熒光定量PCR儀(韓國,BIONEER);WD-9405B型水平搖床、DYY-7C型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽和DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀(北京,北京六一);DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津,天津泰斯特);ELX-800型酶標(biāo)儀(美國,BIOTEK)。

1.2.2 試劑 TRIpure、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、2×Power Taq PCR MasterMix及RNase inhibitor(北京,BioTeke)；SYBR Green(北京,Solarbio);ECL發(fā)光液(中國,7 Sea biotech);預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(加拿大,Fermentas);BSA(中國,Biosharp);RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、30% Acr-Bis(29:1)和SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(中國,beyotime);KLF4 antibody、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG和內(nèi)參抗體β-actin(中國,Proteintech)等。

1.3 造模及干預(yù)方法

1.3.1 ICH模型制作 運(yùn)用自體血注入尾殼核制取腦出血模型。禁食12 h和禁水6 h后造模。采用自體血注射的方法,根據(jù)大鼠的立體定位圖譜，向大鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，以俯臥位的形式將大鼠固定在立體定位儀上，隨后將定位儀兩側(cè)耳桿插入大鼠骨性外耳道，將大鼠門齒定位在門齒孔上，通過調(diào)整高度來保證前囟點(diǎn)和人字點(diǎn)處于水平位置。以兩耳尖連線中點(diǎn)為標(biāo)志，進(jìn)行備皮、消毒和切口，鈍性分離皮下骨膜后，將前囟點(diǎn)及冠狀縫充分暴露，用立體定位儀定位坐標(biāo)點(diǎn)(前囟點(diǎn)為中心，右側(cè)3.5 mm，后側(cè)0.2 mm)，用1.0 mm直徑鉆頭鉆孔至硬腦膜表面，若落空感停止，但要注意避免穿孔過深，從而損傷腦組織。在對(duì)鼠尾進(jìn)行消毒后，由實(shí)驗(yàn)人員在距尾端3 cm處a剪斷，這時(shí)采血50 μL，將大鼠重新固定在立體定位儀上，以20 μL/min注入自體血，針頭刺入深度6 mm，進(jìn)行5 min留針后緩慢出針。最后在大鼠斷尾處進(jìn)行消毒包扎，在頭部抗菌用牙科水泥密封顱骨鉆孔，使用碘伏消毒，縫合，防止感染。

1.3.2 大鼠隨機(jī)分組及干預(yù)方法 本研究選用60只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，3月齡，體質(zhì)量約250～300 g，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。按體質(zhì)量將健康雄性大鼠隨機(jī)平均分為5組，每組6只大鼠，每組再隨機(jī)分為1 d、7 d兩個(gè)亞組。

假手術(shù)組(Sham)：開皮、鉆孔、注射生理鹽水和縫合，對(duì)大鼠進(jìn)行每天1次與針刺組相同的捆綁，每次30 min。

模型組(ICH)：復(fù)制腦出血模型，建模12 h后對(duì)大鼠進(jìn)行每天1次與針刺組相同的捆綁，每次30 min。

模型+針刺治療組(ICH+acupuncture)：腦出血造模后12 h給予針刺治療，每24 h針刺1次。參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》進(jìn)行針刺部位選擇，取大鼠百會(huì)穴(頂骨正中)、患側(cè)曲鬢穴(眶外緣與外耳口連線的后2/3)。針刺方法:使用由百會(huì)向曲鬢穴透刺的方法，針灸針快速刺入并以透刺的手法刺向曲鬢穴，施以捻轉(zhuǎn)速度為200 r/min的快速捻轉(zhuǎn)手法，持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min，后間隔5 min，反復(fù)操作，共留針30 min。針刺治療后于腦出血造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別取材。

模型+針刺治療+agomir陰性對(duì)照組(ICH+acupuncture+agomir-NC)：將購買的miR-34a-5p agomir-NC稀釋至終濃度為50 μM，取5 μL聯(lián)合12.5 μL轉(zhuǎn)染試劑于建模前3 d行側(cè)腦室(前囟后0.8 mm，中縫右1.5 mm，頭骨表面以下4.5 mm深)注射。復(fù)制腦出血模型，建模12 h后給予針刺治療，每24 h針刺1次，具體操作方法同模型+針刺治療組保持一致。

模型+針刺治療+miR-34a-5p agomir組(ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir)：(將購買的miR-34a-5p agomir稀釋至終濃度為50 μM，取5 μL聯(lián)合12.5 μL轉(zhuǎn)染試劑于建模前3 d行側(cè)腦室(前囟后0.8 mm，中縫右1.5 mm，頭骨表面以下4.5 mm深)注射。復(fù)制腦出血模型，建模12 h后給予針刺治療，每24 h針刺1次，具體操作方法同模型+針刺治療組保持一致。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分 大鼠造模完成，等待大鼠意識(shí)清醒后，于建模后1 d、7 d時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能測(cè)評(píng)，采用Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。分為5個(gè)等級(jí),0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：病灶對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)，大鼠向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)，大鼠向病灶對(duì)側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，存在意識(shí)障礙。納入造模時(shí)評(píng)分為1～3分的大鼠。

1.4.2 Real-time PCR檢測(cè)miR-34a-5p和KLF4表達(dá) 測(cè)定完大鼠Longa評(píng)分后，對(duì)大鼠腹腔注射200 mg/kg過量戊巴比妥鈉處死，運(yùn)用高純度總RNA快速提取試劑盒提取小鼠腦部血腫周圍中的總RNA，并且運(yùn)用紫外分光光度計(jì)定量分析。運(yùn)用miR-34a-5p莖環(huán)RT引物或相應(yīng)的引物將分離的RNA轉(zhuǎn)錄到相應(yīng)的cDNA中去，所用相關(guān)引物為miR-34a-5p：上游5′-GGACTTGGCAGTGTCTTAGCTG-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；5S：上游5′-GATCTCGGAAGCTAAGCAGG-3′，下游5′-TGGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；KLF4 mRNA：上游5′-GGAGCCCAAGCCAAAGAGG-3′，下游5′-CGTCCCAGTCACAGTGGTAAGGT-3′；β-肌動(dòng)蛋白：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。miR-34a-5p的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，循環(huán)40次；KLF4 mRNA的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，循環(huán)40次。運(yùn)用SYBR Green進(jìn)行RT-PCR分析，在Exicycler 96系統(tǒng)中檢測(cè)miR-34a-5p和KLF4 mRNA的表達(dá)水平。以5S和β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照物，使用2△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡分析KLF4表達(dá)水平 RIPA裂解緩沖液提取大鼠腦內(nèi)血腫周圍的總蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行定量分析。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)移到PVDF膜中，之后封閉。孵育一抗(KLF4 antibody 1∶500)，夜間4 ℃過夜；孵育二抗(羊抗兔IgG-HRP 1∶10 000)，37 ℃ 45 min。 在Gel-Pro分析系統(tǒng)中運(yùn)用熒光試劑盒進(jìn)行可視化展示。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照物。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納整理，多組之間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，檢驗(yàn)水平α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 不良事件

在實(shí)驗(yàn)過程中密切觀察大鼠活動(dòng)情況及生命狀態(tài)，若大鼠特別痛苦或Longa評(píng)分被評(píng)為4分，則對(duì)大鼠實(shí)行安樂死。在本研究進(jìn)行過程中，未觀測(cè)到預(yù)期或未預(yù)期的不良事件。

2 結(jié)果

2.1 針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)腦出血大鼠Longa評(píng)分的影響

如表1所示，各時(shí)間點(diǎn)，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠Longa評(píng)分升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且Sham組腦出血大鼠Longa評(píng)分為0。1 d時(shí)，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠Longa評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠Longa評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。7 d時(shí)，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠Longa評(píng)分降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠Longa評(píng)分升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明miR-34a-5p可能對(duì)針刺緩解腦出血造成的神經(jīng)損傷的療效會(huì)起到抑制作用；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠Longa評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分結(jié)果

2.2 針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達(dá)的影響

如表2和圖1所示，各時(shí)間點(diǎn)，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1 d、7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p水平

圖1 miR-34a-5p溶解曲線及擴(kuò)增曲線圖

2.3 針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA水平的影響

如表3和圖2所示，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1 d、7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA水平比較

圖2 KLF4 mRNA溶解曲線及擴(kuò)增曲線圖

2.4 針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平的影響

如表4、圖3所示，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1 d、7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

針刺療法是中醫(yī)學(xué)的重要外治方法，是目前針對(duì)治療腦出血疾病的熱點(diǎn)話題。現(xiàn)有研究表明，針刺作為腦出血患者的輔助治療時(shí)，不僅具有良好的治療安全性，可以減少長(zhǎng)期使用藥物對(duì)人體的刺激，保護(hù)神經(jīng)功能，抑制全身的炎性反應(yīng)，優(yōu)化腦血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)[18]。在本課題組的前期研究中，針刺能夠通過調(diào)控腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巢蛋白[19]，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[20]，達(dá)到促進(jìn)組織修復(fù)并抑制細(xì)胞凋亡的效果[21]。

表4 各組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平

圖3 各組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白表達(dá)

在本課題組的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，KLF4在ICH大鼠腦組織中含量顯著下降，而miR-34a-5p的表達(dá)含量則顯著上升。本研究旨在明確針刺對(duì)于改善腦出血預(yù)后的有效性，探究miR-34a-5p對(duì)腦出血疾病發(fā)展及預(yù)后的影響。探討miR-34a-5p對(duì)KLF4的調(diào)節(jié)作用，了解頭針治療對(duì)miR-34a-5p和KLF4的影響，為針刺治療ICH提供新的理論。

在最近有關(guān)miR-34a-5p以及KLF4的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p在缺血性中風(fēng)患者的血液中表達(dá)升高[22]，且在腦出血大鼠血腫周圍表達(dá)升高，過表達(dá)的miR-34a-5p則會(huì)引起神經(jīng)元的凋亡，同時(shí)加重血腫周圍的形態(tài)學(xué)改變[23]，這表明miR-34a-5p的過表達(dá)可能會(huì)引起腦出血后損傷加重；KLF4則在微血管內(nèi)皮中能夠抑制細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[24]，過表達(dá)的KLF4能夠調(diào)節(jié)腦梗死后緊密蛋白的表達(dá)[25]，對(duì)缺血性腦卒中引起的腦神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。除去對(duì)于神經(jīng)元的作用外，KLF4也可以在促進(jìn)血管新生上發(fā)揮積極作用[26]，趙松耀則在其臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，腦梗死預(yù)后不良的患者較腦梗死預(yù)后良好的患者外周血液中KLF4 mRNA表達(dá)降低，且KLF4 mRNA表達(dá)的情況與溶栓效果成正相關(guān)，可以作為評(píng)估溶栓效果的指標(biāo)[27]。相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)了KLF4的3’-UTR區(qū)可以同miR-34a-5p結(jié)合，且存在靶向關(guān)系[28]，miR-34a-5p很可能是通過靶向抑制KLF4，使得KLF4對(duì)腦血管及神經(jīng)組織的保護(hù)作用下降，進(jìn)而抑制針刺減輕腦出血損傷的能力。

本研究分為假手術(shù)組、模型組、模型+針刺治療組、模型+針刺治療+agomir陰性對(duì)照組與模型+針刺治療+miR-34a-5p agomir組5組，使用Longa評(píng)分評(píng)定大鼠神經(jīng)功能缺損情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)“百會(huì)”透“曲鬢”針刺療法能夠降低大鼠Longa評(píng)分，改善大鼠神經(jīng)功能損傷的情況，但miR-34a-5p能夠抑制針刺對(duì)損傷的治療效果。同時(shí)對(duì)腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p、KLF4 mRNA水平與KLF4蛋白表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)針刺“百會(huì)”透“曲鬢”能夠下調(diào)腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5的表達(dá)，上調(diào)KLF4 mRNA水平與KLF4蛋白表達(dá)。筆者發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p表達(dá)水平與KLF4的mRNA和蛋白表達(dá)趨勢(shì)相反，并且KLF4的mRNA和蛋白水平隨著miR-34a-5p的過度表達(dá)而降低，這提示KLF4應(yīng)當(dāng)是miR-34a-5p的靶點(diǎn)之一，也是針刺“百會(huì)”透“曲鬢”減輕腦出血大鼠神經(jīng)損害的靶點(diǎn)之一。

綜上所述，此研究驗(yàn)證了miR-34a-5p/KLF4信號(hào)通路是針刺“百會(huì)”透“曲鬢”減輕腦出血損傷的靶點(diǎn)之一?！鞍贂?huì)”透“曲鬢”針刺可以降低腦出血大鼠Longa評(píng)分，抑制miR-34a-5p表達(dá)，促進(jìn)KLF4 mRNA表達(dá)，促進(jìn)KLF4蛋白表達(dá)，減輕腦出血后神經(jīng)損害，為今后針刺“百會(huì)”透“曲鬢”在腦出血疾病方面提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。