循環(huán)腫瘤細胞的研究現(xiàn)狀及在結腸癌診療中的應用進展*

成端輝 黃韋政 賴應森 雷國堅

癌癥轉移是癌癥相關死亡的主要原因，且仍然是癌癥治療中的主要挑戰(zhàn)之一。癌癥轉移是一個復雜的多步驟過程，包括癌細胞在原發(fā)部位的侵襲、血管內滲入循環(huán)、循環(huán)中的存活、循環(huán)外滲及轉移部位的附著和定植[1]。癌細胞從原發(fā)性腫瘤脫落滲入血液并在血液中循環(huán)后被稱為循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）[2]。CTC 具有移動、遷移和侵入血管的能力，被認為是體內腫瘤轉移的主要原因[3]。由于CTC 直接來源于腫瘤且是活的細胞，因此CTC 攜帶有原發(fā)性腫瘤和轉移灶的分子和生物學信息，可用于早期疾病檢測、治療反應和疾病進展評估、疾病機制闡明和藥物開發(fā)的治療靶點識別等，是一種有前景的生物標志物[4-5]。結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，常見于40～50 歲男性，是全球第三大常見的癌癥，每年導致近100 萬人死亡[6]。結腸癌在我國的發(fā)病率與死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常見惡性腫瘤，但近年隨著飲食結構的改變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。早期發(fā)現(xiàn)和精準治療是改善結腸癌患者預后的關鍵。過去，結腸癌的確診主要依靠活檢技術，但單個靜態(tài)活檢標本無法實時反映腫瘤的特征。因此，迫切需要一種更安全、更實時的方法來獲取全面、動態(tài)的信息，以反映癌癥的發(fā)展和治療反應，以補充或替代實體組織活檢[8]。CTC 具有提供大量生物信息的潛力，同時支持單細胞分析，引起了研究人員的廣泛關注。

多項研究表明，CTC 對評估結腸癌的預后很有價值。CTC 檢測有利于結腸癌的早期診斷和監(jiān)測動態(tài)變化，同時，CTC 的表型和分子特征與原發(fā)灶和轉移灶類似，有助于揭示結腸癌的發(fā)病機制和轉移機制，并識別靶基因中的特定突變[9]。但是，CTC的稀有性和異質性及檢測和分析技術的發(fā)展限制了CTC 作為一種新的生物標志物的推廣應用。本綜述將概述CTC 的研究現(xiàn)狀，并討論CTC 檢測在結腸癌患者中的效用以及前景。

1 CTC富集和分離技術

有研究表明，CTC 在醫(yī)學影像學檢查檢測到腫瘤病變前就存在于血液，但含量極低[10]。即便到了腫瘤晚期，患者1 mL 外周血中通常只有1 個CTC[11]。此外，當腫瘤細胞脫離原來的組織后容易發(fā)生表型變化，易受細胞凋亡和固有的脆性影響，只有少數細胞可以存活[11]。因此，CTC 的捕獲難度較大，尤其是發(fā)明可有效檢測活CTC 以進行后續(xù)深入分析的分離方法仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

1.1 基于CTC 物理特性捕獲技術 物理富集和分離方法是基于CTC 的物理特性，利用尺寸、膜電荷和密度等方面與血細胞的差異，通過特定平臺進行分離[12]。如AccuCyte 系統(tǒng)的原理是利用CTC 的特定密度。CTC 的密度介于血漿和紅細胞之間，利用密度介質的不同沉降系數梯度離心，不同密度的細胞在分離液中分層分布，實現(xiàn)CTC 的分離[13]。也可利用膜電位差異來檢測和計數CTC。阿尼爾等構建了雙電層門控AlGaN/GaN 高電子遷移率晶體管生物傳感器陣列實現(xiàn)了CTC 的捕獲[14]。但白細胞和CTC 之間存在一些物理性質的重疊，這導致物理方法獲取的CTC 特異性差及一些CTC 丟失。

1.2 基于CTC 生物特性捕獲技術 生物富集和分離方法是利用CTC 特定的表面標記分子，使用分子探針，如抗體、肽鏈和配體等靶向識別標記分子，再通過分選系統(tǒng)篩出CTC，常見的標記分子有EpCAM+、DAPI+、CD45-、細胞角蛋白+等[15]。最具代表性的分選系統(tǒng)是CellSearch 系統(tǒng)[16]。CellSearch 系統(tǒng)首先利用涂有EpCAM 抗體的免疫磁珠與樣本細胞孵育和分離，然后使用抗細胞角蛋白抗體識別CTC 細胞，使用CD45 抗體識別混雜的白細胞，最后通過流式分選出高純度的CTC。CellSearch 系統(tǒng)已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于結直腸癌、乳腺癌和前列腺癌患者的診斷。

近年來，也出現(xiàn)了多種基于EpCAM 的CTC 富集和分離新技術。Cui 等[17]構建了一種具有特異性捕獲和非破壞性釋放癌細胞雙重功能的新型三維微納生物芯片，該芯片可以高效捕獲的CTC，且對細胞活力損傷小。纖維墊是一種可用于分選特異性CTC 的納米材料，Lee 等[18]優(yōu)化了以尼龍6 為主要材料的纖維墊，將環(huán)氧乙烷混合到尼龍6 中，提高了纖維墊的細胞基質親和力和低白細胞吸附能力，提高了對CTC 的分離效率和樣品純度。但基于生物特性的方法仍存在缺點，即不能有效地分離具有非特異性表面抗原表達的CTC。

1.3 最新CTC 捕獲技術 除了上面討論的經典CTC 富集與分離技術外，近年來還出現(xiàn)了一些較新的技術，如基于微流體和基于納米技術的CTC 富集與分離。

微流體捕獲技術結合了生物和物理捕獲技術兩種方法的優(yōu)點，利用循環(huán)內在特性（如流體動力）與人為外在干預（如磁場、電場、聲學和光學力）來分離細胞，提高了CTC 富集與分離的靈敏度和特異度。Jiang 等[19]設計集成了一種微流控系統(tǒng)，可以快速、高靈敏度檢測CTC。該系統(tǒng)利用流體特性，在血液中捕獲綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞實現(xiàn)了90%的捕獲率、50%的純度和90%以上的成活率。在轉移性癌癥患者中該系統(tǒng)的陽性捕獲率為83.3%。該系統(tǒng)與CellSearch 系統(tǒng)的捕獲率無統(tǒng)計學差異，但該系統(tǒng)具有血量、時間和成本的優(yōu)勢，且對細胞活性沒有影響。

基于納米技術的CTC 富集與分離方法目前在疾病早期檢測CTC 和動態(tài)監(jiān)測癌癥發(fā)展方面展現(xiàn)出了良好的前景。納米材料的優(yōu)點是具有大的表面積與體積比，因此可以結合更多的抗體或配體與CTC 特異性結合，進而高效分離純化CTC。目前用于CTC檢測的納米材料包括磁性納米粒子、金納米粒子、量子點等[20]。

2 CTC的生物學信息

CTC 是從原發(fā)性腫瘤脫落滲入血液并在血液中循環(huán)癌細胞。它的來源決定了它攜帶有與原發(fā)性腫瘤和轉移灶癌細胞相似的生物學信息，識別CTC 的生物學信息有助于理解原發(fā)疾病的發(fā)病機制和治療靶點識別等[21]。

2.1 CTC 的分子特征 CTC 主要的分子特征包括上皮標志物、間充質標志物和癌癥特異性CTC 標志物[22]。掌握CTC 的分子特征將有助于癌癥的早期診斷和預防轉移。目前乳腺癌、前列腺癌、大腸癌、胃癌、食道癌等10 余種癌癥的CTC 特異性分子已經被發(fā)現(xiàn)和應用[23]。如乳腺癌中的上皮標志物EpCAM/CK/E-鈣黏蛋白、間充質標志物波形蛋白、特定標記HER2；前列腺癌中的特定標記PSMA；腎癌中的特定標記CD147；大腸癌中的特定標記PI3Kα/CEA 等。

由于大多數癌癥是上皮起源的，因此最常用于識別CTC 的標志分子是EpCAM。但使用EpCAM 作為CTC 標記有局限性。它不能用于EpCAM 陰性或低表達的腫瘤，如神經源性癌癥。即便在EpCAM高表達的腫瘤中，僅檢測EpCAM 陽性CTC 可能會低估了實際的CTC 數量，在某些癌癥類型中，在EpCAM 高表達的腫瘤中存在大量EpCAM 陰性CTC[24]。因此，綜合使用上皮標志物、間充質標志物和癌癥特異性CTC 標志物的檢測方法，在檢出CTC 上更具可靠性。

2.2 CTC 的基因組特征 組織基因分型是傳統(tǒng)上公認的癌癥診斷金標準方法，用于識別人類基因組改變。然而，這種技術是一種高侵入性、昂貴且耗時的方法，不適用于少量腫瘤組織或癌癥的后續(xù)治療。CTC 基因組分析可以提供有關腫瘤細胞突變譜的信息，幫助臨床醫(yī)生選擇治療方法和對患者進行隨訪。

特別是使用非侵入性液體活檢連續(xù)取樣分離CTC 檢測腫瘤的基因組的穩(wěn)定性，可早期發(fā)現(xiàn)腫瘤進化和耐藥腫瘤亞克隆的出現(xiàn)，有助于評估治療反應和精準醫(yī)療。但許多癌癥的CTC 基因突變分析顯示，CTC 和相應的原發(fā)性腫瘤之間的突變不完全一致，因此可能會干擾對病情的評估[25]。如一項結直腸癌CTC 的研究顯示，CTC 和原發(fā)腫瘤之間的突變一致性率為37%～90%[26]。因此，CTC和腫瘤樣本的突變檢測相結合才能更準確地指導治療。

隨著單細胞測序的發(fā)展，目前針對CTC 轉錄組的研究被應用在了癌癥的診斷和預后上。如Magbanua 等[27]發(fā)現(xiàn)轉移性乳腺癌患者中CTC 高表達Ki-67 的預后不良。

3 CTC的臨床應用

目前，臨床上對乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等多種癌癥已經將CTC 檢測作為組織活檢的替代或補充方案。通過液體活檢定期監(jiān)測循環(huán)中的CTC，從而實現(xiàn)對疾病過程的監(jiān)測、檢測新出現(xiàn)的耐藥性基因、識別新的分子靶點。CTC是癌癥轉移的主要原因，因此監(jiān)測CTC 在癌癥診斷、治療、預后評估上有巨大的應用潛力。

3.1 癌癥的早期診斷 計算機斷層掃描、磁共振成像等影像學上檢測到腫瘤病變時，腫瘤實體至少已經具有109個腫瘤細胞。而在多項小鼠模型實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)乳腺癌、胰腺癌80% 的轉移灶來自早期播散性癌細胞，表明CTC 的出現(xiàn)可能是癌癥進展中非常早期的事件[11]。而在人早期乳腺癌研究中，Barrière 等[28]在41%的T1期和47%的腋窩淋巴結陰性乳腺癌患者中檢測到CTC，早于影像學發(fā)現(xiàn)病灶。上述發(fā)現(xiàn)表明CTC 在影像學未察覺腫瘤實體前已經存在。因此CTC 可以應用在癌癥早期診斷。但CTC 數量少、和白細胞生物學特性有重疊，導致早期檢測的敏感性有限，阻礙了它們作為早期癌癥診斷中的有效生物標志物的使用。

3.2 癌癥的治療方案 通過檢測CTC 基因突變，可以監(jiān)測腫瘤耐藥性和篩選有效的治療靶點。如確定EGFR 突變的狀態(tài)對于接受酪氨酸激酶抑制劑治療的非小細胞肺癌患者至關重要。Maheswaran 等[29]對29 例非小細胞肺癌患者進行CTC 檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)生癌癥轉移的患者中92%發(fā)生了EGFR 激活突變，對酪氨酸激酶抑制劑治療效果不佳，特別同時檢測到T790M 突變的患者，該突變導致患者對酪氨酸激酶抑制劑耐藥，無進展生存期明顯縮短。

3.3 預后監(jiān)測指標 CTCs 的預后價值已被廣泛研究。迄今為止，大量研究已經證明CTC 在患有各種類型實體瘤（尤其是乳腺癌）患者中的預后意義。一項統(tǒng)計研究匯總了21 項研究包含2 239 例乳腺癌患者新輔助化療前的CTC 計數，計算CTC 計數對患者生存的影響，結果顯示CTC≥5 個/mL 的患者預后較差[29]。此外，在治療期間CTC 計數增加或未能清除也提示治療反應不好，預后不良。同時，研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 的分子表型亦具有很強的預后價值。如在EpCAM 陽性乳腺癌患者中CTC 過表達WIST1與較差的預后相關[30]。

4 CTC在結腸癌中研究進展

結腸癌是一個重大的全球公共衛(wèi)生問題，是發(fā)達國家最常見的實體癌類型之一。早期發(fā)現(xiàn)和精準治療是改善結腸癌患者預后的關鍵。目前早期結腸癌的標準治療包括手術切除原發(fā)性結腸腫瘤和區(qū)域淋巴結，以及經過手術后被認為仍有癌癥復發(fā)風險的患者進行輔助化療[31]。目前CTC 在結腸癌診療中的應用主要集中在癌癥診斷和病情進展檢測。

4.1 應用CTC 診斷結腸癌 目前，結腸癌的診斷主要依靠組織病理活檢及影像學檢查。然而，這兩種方法均是建立在腫瘤實體組織已經較大的基礎上，無法做到真正的早期診斷。研究已經表明CTC比影像學可見出現(xiàn)更早，因此可以用于癌癥的早期診斷。有研究表明結腸息肉患者和非轉移性結腸癌患者的CTC 計數存在顯著差異[32]。這些差異為疾病篩查和疑似惡性病變的診斷提供了潛力。2019 年一項臺灣前瞻性臨床研究使用CellMax 仿生平臺進行早期CRC 篩查，對667 份樣本（235 名健康對照、120 例癌前病變患者和312 例Ⅰ～Ⅳ期結腸癌患者）進行CTC 檢測，將CTC 檢測結果與結腸鏡檢查、活檢等常規(guī)臨床診斷方法的結果進行比較，總體準確率為86%[33]。該研究進一步證明CTC 對結腸癌具有較大的診斷價值。

4.2 應用CTC 檢測結腸癌進展 經過手術后被認為仍有癌癥復發(fā)風險的患者需要進行輔助化療。輔助化療的目標是根除臨床上未發(fā)現(xiàn)的微小轉移性病灶從而到達治愈。然而，目前缺乏評估早期癌癥患者是否需要輔助化療的可靠評估指標。在目前的臨床實踐中，患者選擇輔助化療是基于術后腫瘤的臨床病理學特征，但這不精確，會導致大量患者治療不足或過度治療。新興研究表明，CTC 是攜帶腫瘤特異性基因組或表觀基因組改變的游離細胞，可作為是否存在微小轉移性病灶的標志物，并有助于對早期結腸癌患者進行高精度的風險分層[34-35]。同時，研究報道，連續(xù)監(jiān)測CTC 可以提供有關結腸癌術后療效的有價值信息，并且能比影像學監(jiān)測方法更早地檢測到癌癥復發(fā)[25，36]。

CTC 的檢測和分析是研究全身腫瘤異質性、促進精準醫(yī)療發(fā)展的新途徑。近年的研究使CTC 在結腸癌患者中的臨床應用取得了重大進展。CTC 不僅可以用于早期診斷，更重要的是可以在基因組、轉錄組、蛋白質組和功能水平上表征和監(jiān)測腫瘤異質性的動態(tài)變化。但是CTC 檢測的敏感性有限，這限制了它在指導輔助治療決策和腫瘤監(jiān)測方面的廣泛臨床應用。CTC 在結腸癌中的應用研究目前主要集中在早期診斷和檢測微小轉移病灶的潛力。CTC 在新輔助治療中評估治療反應的能力是未來探索有前景的一個領域。