基于回腸頂端鈉依賴性膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體探究梔子水提物對小鼠膽汁淤積的治療作用

張國強(qiáng)，文苑潔，董毓松，石曉盼，魏玉輝

基于回腸頂端鈉依賴性膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體探究梔子水提物對小鼠膽汁淤積的治療作用

張國強(qiáng)1, 4，文苑潔3, 4，董毓松1, 2，石曉盼1, 2，魏玉輝1, 4*

1. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000 2. 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 3. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 4. 甘肅省醫(yī)院中藥制劑產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟，甘肅 蘭州 730000

基于回腸頂端鈉依賴性膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT）考察梔子水提物對α-異硫氰酸萘酯（α-naphthyl isothiocyanate，ANIT）誘導(dǎo)的膽汁淤積小鼠的治療作用，并篩選潛在的活性化合物。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、梔子對照（240 mg/kg）組、ANIT組及梔子水提物低、中、高劑量（60、120、240 mg/kg）組和熊去氧膽酸（60 mg/kg）組，每組10只。給予藥物進(jìn)行干預(yù)，2次/d，連續(xù)14 d；于第12天單次ig ANIT（50 mg/kg）誘導(dǎo)小鼠膽汁淤積模型。采用梔子水提物干預(yù)ANIT誘導(dǎo)的小鼠小腸上皮MODE-K細(xì)胞；測定血清生化指標(biāo)及肝臟、血清、膽囊、回腸及糞便中膽酸鹽含量；測定小鼠回腸及MODE-K細(xì)胞ASBT及法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）的表達(dá)；采用原位腸灌流及外翻腸囊法測定回腸組織及肝門靜脈中?；悄懰徕c（taurocholate sodium，TCA）含量；采用定性代謝組學(xué)技術(shù)測定給予梔子水提物2 h后血清及回腸組織中的化合物。與ANIT組比較，梔子水提物能緩解肝臟病變，減少肝臟膽酸鹽及回腸TCA含量（＜0.05、0.01），增加糞便膽酸鹽的含量（＜0.05）；增加小鼠回腸及MODE-K細(xì)胞FXR表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001），減少ASBT的表達(dá)（＜0.01、0.001）。同時，篩選出潛在的活性化合物37個。梔子水提物可通過激活回腸FXR而抑制回腸ASBT的表達(dá)和功能，減少回腸膽酸鹽重吸收并促進(jìn)糞便排泄，減少肝臟膽酸鹽蓄積，從而緩解ANIT誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)膽汁淤積。

梔子；膽汁淤積；頂端鈉依賴性膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體；法尼醇X受體；京尼平；京尼平苷；京尼平龍膽二糖苷

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量19～21 g，8周齡，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，許可證號SCXK（甘）2020-0002。動物飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃、相對濕度40%～60%及通風(fēng)良好的動物房里，給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)維持飼料并自由飲水，每日光照12 h。小鼠于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號LDYYLL2017-72）。

1.2 細(xì)胞

小鼠小腸上皮MODE-K細(xì)胞（批號BNCC338300）購自北納生物。

1.3 藥材

梔子購自甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，產(chǎn)地為江西省樟樹市，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順教授鑒定為茜草科植物梔子Ellis的干燥成熟果實(shí)。

1.4 藥品與試劑

α-異硫氰酸萘酯（α-naphthyl isothiocyanate，ANIT，批號STBH7289）購自美國Sigma-Aldrich公司；?；悄懰徕c（taurocholate sodium，TCA，批號B26949）購自上海源葉生物科技有限公司；RIPA裂解液（批號P0013B）購自碧云天生物技術(shù)研究所；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號C010-2-1）、總膽汁酸（total bile acids，TBA）試劑盒（批號E003-2-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號C009-2-1）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號A059-2-2）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）試劑盒（批號C019-1-1）購自南京建成生物工程研究所；法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）抗體（批號sc-25309）購自Santa Cruz公司；β-actin抗體（批號TA-09）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ASBT抗體（批號ab203205）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號ab6721）、HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠抗體（批號ab6789）購自英國Abcam公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；純化水為蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制。

1.5 儀器

1260型高效液相色譜儀、6460型質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；3k15型高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；TP-24型組織細(xì)胞破碎儀（北京飛馳科學(xué)儀器公司）；AU400型全自動生化分析儀（日本Olympus公司）；LT-224S型電子天平（德國Sartorius公司）。

2 方法

2.1 梔子水提物的制備

梔子水提物與本課題組前期研究[5]為同一批，梔子采用水煎法提取2次，合并濾液，噴霧干燥得粉末，藥材提取率為10%。測定梔子提取物中9種主成分含量用于質(zhì)量控制，其中京尼平苷115 660.02 ng/mL、木犀草苷4 422.28 ng/mL、京尼平龍膽二糖苷1 279.94 ng/mL、木犀草素1 020.7 ng/mL、京尼平苷酸962.46 ng/mL、鼠李檸檬素175.84 ng/mL、6α-羥基梔子苷181.08 ng/mL、梔子苷B 124.86 ng/mL、濱蒿內(nèi)酯101.46 ng/mL。

初中數(shù)學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生邏輯思維的重要學(xué)科。在這個過程中，我們不僅要傳授數(shù)學(xué)基礎(chǔ)知識，同樣還需培養(yǎng)學(xué)生的核心素養(yǎng)。因此教師需要在進(jìn)行數(shù)學(xué)知識教學(xué)的過程中，逐步培養(yǎng)學(xué)生的邏輯能力，推理能力，空間想象等能力，同時強(qiáng)化學(xué)生利用數(shù)學(xué)知識解決問題的能力，綜合提升學(xué)生核心素養(yǎng)。而令學(xué)生具有利用數(shù)學(xué)知識解決問題的能力，首要之急便是將數(shù)學(xué)與實(shí)踐聯(lián)系起來。因此教師在教學(xué)過程中需要通過各種各樣的實(shí)踐活動，令學(xué)生在實(shí)踐之中習(xí)得新知識，感受知識與實(shí)際生活的聯(lián)系。同時在實(shí)驗(yàn)之中，學(xué)生自己動手進(jìn)行探索解決問題更可以提升其核心素養(yǎng)。

2.2 動物分組、給藥及造模

C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、梔子對照（240 mg/kg）組、模型組及梔子水提物低、中、高劑量（60、120、240 mg/kg）組和熊去氧膽酸（60 mg/kg）組，每組10只。對照組ig蒸餾水（0.2 mL/只），梔子對照組ig梔子水提物，2次/d，連續(xù)14 d，并于第12天單次ig玉米油（0.2 mL/只）；模型組ig蒸餾水（0.2 mL/只），各給藥組ig相應(yīng)藥物，2次/d，連續(xù)14 d，并于第12天單次ig ANIT（50 mg/kg，以玉米油溶解）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食并收集2 h內(nèi)糞便，ip 10%水合氯醛麻醉后，摘眼球取血，離心后用于后續(xù)生化分析；取小鼠肝臟、膽囊、結(jié)腸組織，稱定肝臟及膽囊（含膽汁）質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)和膽囊指數(shù)；部分肝臟及回腸組織采用10%甲醛溶液固定，蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察組織病變情況；部分回腸樣品提取總蛋白，采用Western blotting法分析蛋白表達(dá)。

肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量

膽囊指數(shù)＝膽囊（含膽汁）質(zhì)量/肝質(zhì)量

2.3 血清生化及肝臟、回腸組織HE染色

采用試劑盒說明書測定血清中AST、ALP、ALT活性及TBIL水平，肝臟組織、回腸組織、膽汁、糞便及血清中TBA水平；肝臟及回腸組織采用常規(guī)HE染色，于顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.4 Western blotting檢測回腸組織ASBT和FXR蛋白表達(dá)

稱取各組大鼠新鮮的回腸組織0.04 g，加入RIPA裂解液300 μL，提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉，分別加入ASBT（1∶1000）、FXR（1∶500）和β-actin（1∶2000）抗體，4 ℃孵育過夜；洗膜，孵育二抗，曝光，采用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

2.5 在體腸灌流實(shí)驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組5只小鼠，不設(shè)置熊去氧膽酸組。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食12 h，ip 10%水合氯醛麻醉后，游離出回腸10 cm并兩端結(jié)扎，注入10 μmol/L TCA 200 μL，于10 min后一次性取肝門靜脈血，離心取上清，?80 ℃凍存用于后續(xù)分析。

2.6 外翻腸囊實(shí)驗(yàn)

按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組5只小鼠。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食12 h，ip 10%水合氯醛麻醉后，從回盲交界處向上5 cm游離并截取10 cm回腸，立即放入冰的PBS中，剪去腸系膜，外翻腸道并清洗，灌入Krebs-Ringer緩沖液（Krebs-Ringer buffer，KRB）200 μL并夾緊兩頭，將腸囊置入氧飽和的含10 μmol/L TCA的KRB中，37 ℃孵育30 min，收集腸囊內(nèi)液及腸組織，?80 ℃凍存用于后續(xù)分析。

2.7 HPLC-MS/MS分析[13]

血樣及腸內(nèi)液離心取上清液，回腸組織加入甲醇勻漿后離心并取上清，取適量血樣、腸內(nèi)液、回腸組織勻漿上清液，用含內(nèi)標(biāo)（d4-CDCA）的甲醇沉淀各生物樣品中的蛋白，渦旋離心后取上清，按照本課題組前期研究方法[13]檢測各生物樣品中TCA的含量。

2.8 MODE-K細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)

MODE-K細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)、傳代，MTT法分別評價梔子水提物（25～800 μg/mL）及ANIT（12.5～200 μmol/L）對MODE-K細(xì)胞活性的影響；篩選出ANIT 70 μmol/L作為細(xì)胞模型濃度，進(jìn)一步采用MTT評價梔子水提物在ANIT干預(yù)下對MODE-K細(xì)胞活性的影響；采用50、100、200 μg/mL梔子水提物干預(yù)MODE-K細(xì)胞24 h，按“2.4”項(xiàng)下方法評價其對ASBT及FXR蛋白表達(dá)的影響。

2.9 梔子水提物中潛在藥效化合物的篩選

C57BL/6J小鼠分為模型組和給藥組，每組4只。各組ig ANIT（50 mg/kg）48 h后，給藥組ig梔子水提物（240 mg/kg），給藥2 h后采集小鼠的血液和回腸組織。采用UHPLC-QTOF-MS中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測梔子水提物、血清和回腸中共有的化合物；并從蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）中篩選FXR-OCA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB代碼：4QE6），采用Maestro 11.5軟件進(jìn)行分子對接，篩選潛在的FXR激動劑。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間兩兩比較，采用檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 梔子水提物對ANIT誘導(dǎo)小鼠膽汁淤積的治療作用

如圖1-A～C所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP活性及TBIL、膽囊指數(shù)均顯著升高（＜0.05、0.001）；與模型組比較，各給藥組血清中ALT、ALP活性均顯著降低（＜0.01、0.001）；熊去氧膽酸組血清中AST活性顯著降低（＜0.01），肝臟指數(shù)顯著升高（＜0.05）；梔子水提物高劑量組和熊去氧膽酸組血清中TBIL水平及膽囊指數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01）。

如圖1-D、E所示，對照組和梔子對照組膽囊較小且膽汁顏色淡黃色，肝組織肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝板結(jié)構(gòu)排列整齊；ANIT干預(yù)后，可見膽囊充盈且膽汁顏色偏黑；肝組織出現(xiàn)大面積的橋接性壞死及局部點(diǎn)狀壞死，且肝臟壞死區(qū)域數(shù)目較多；梔子提取物及熊去氧膽酸干預(yù)后，膽囊充盈度降低，且膽汁顏色呈淡黃色；肝臟壞死區(qū)域的數(shù)目明顯減少（＜0.05、0.01）。

A-血清生化指標(biāo) B-肝臟指數(shù) C-膽囊指數(shù) D-肝臟壞死病理評分 E-膽囊形態(tài)及肝臟、回腸病理圖片（×100），其中綠色箭頭指示膽囊，肝臟主要病變呈現(xiàn)肝細(xì)胞壞死及炎癥，依據(jù)壞死區(qū)域的大小，將肝損傷程度分為：①重度肝損傷：直徑大于200 μm的肝臟壞死區(qū)域（紅色箭頭）；②中度肝損傷：直徑100～200 μm的肝臟壞死區(qū)域（藍(lán)色箭頭）；③輕度肝損傷：直徑為0～100 μm的肝臟壞死區(qū)域（黑色箭頭），壞死區(qū)域的直徑通過軟件Motic Images plus 2.0 ML軟件的測量功能計(jì)算 AZ60-梔子水提物60 mg·kg?1 AZ120-梔子水提物120 mg·kg?1 AZ240-梔子水提物240 mg·kg?1 AU-熊去氧膽酸 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2 梔子水提物對ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積小鼠膽酸鹽的影響

如圖2-A所示，與對照組比較，模型組肝臟、血清、膽囊中TBA水平均顯著升高（＜0.05、0.001），但糞便中TBA水平顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，梔子水提物高劑量組肝臟、血清、回腸中TBA水平均有不同程度的降低（＜0.05、0.01），糞便中TBA水平顯著升高（＜0.05），提示梔子水提物可能通過促進(jìn)TBA的糞便排泄而利膽。

為了進(jìn)一步明確梔子水提物對回腸重吸收的影響，采用在體腸灌流和外翻腸囊實(shí)驗(yàn)評價了回腸對TCA的攝取。如圖2-B～G所示，與對照組比較，模型組在體腸組織、門靜脈血、回腸囊內(nèi)液、腸囊組織中TCA水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，梔子水提物高劑量組在體腸組織、門靜脈血、回腸囊內(nèi)液中TCA進(jìn)一步降低（＜0.05、0.01），提示梔子水提物可抑制TCA的回腸重吸收。此外，梔子水提物也可抑制正常小鼠回腸TCA的重吸收（圖2-D）。

A-血清、肝臟、膽囊、回腸及糞便中TBA水平(n = 10) B-在體腸灌流實(shí)驗(yàn)示意圖 C-在體腸灌流回腸段組織中TCA水平(n = 5) D-在體腸灌流肝門靜脈血中TCA水平(n = 5) E-外翻腸囊實(shí)驗(yàn)示意圖 F-外翻腸囊囊內(nèi)液中TCA水平(n = 5) G-外翻腸囊腸囊組織中TCA水平(n = 5)

3.3 梔子水提物對小鼠回腸及MODE-K細(xì)胞ASBT及FXR表達(dá)的影響

回腸ASBT是介導(dǎo)膽酸鹽腸道重吸收的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)受回腸FXR的負(fù)調(diào)控。如圖3-A、B所示，與對照組比較，模型組小鼠回腸ASBT及FXR蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，梔子水提物中、高劑量組和熊去氧膽酸組回腸ASBT蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（＜0.01、0.001），各給藥組回腸FXR蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。

A-小鼠回腸組織ASBT蛋白表達(dá)(n = 3) B-小鼠回腸組織FXR蛋白表達(dá)(n = 3) C-梔子水提物對MODE-K細(xì)胞活性的影響(n = 6) D-ANIT對MODE-K細(xì)胞活性的影響(n = 6) E-梔子水提物對ANIT細(xì)胞毒性的拮抗作用(n = 6) F-MODE-K細(xì)胞ASBT蛋白表達(dá)(n = 3) G-MODE-K細(xì)胞FXR蛋白表達(dá)(n = 3)

為了進(jìn)一步明確FXR對ASBT表達(dá)及功能的調(diào)控作用，采用小鼠小腸MODE-K細(xì)胞評價梔子水提物對ASBT表達(dá)的影響。如圖3-C～E所示，梔子水提物在800 μg/mL對MODE-K細(xì)胞活性無顯著影響；ANIT（70～200 μmol/L）顯著抑制MODE-K細(xì)胞活性（＜0.001）；與ANIT組比較，梔子水提物（200、400 μg/mL）對ANIT導(dǎo)致的細(xì)胞毒性具有明顯的保護(hù)作用（＜0.05）。如圖3-F、G所示，與對照組比較，ANIT可明顯降低細(xì)胞ASBT的表達(dá)（＜0.01）；與ANIT組比較，100、200 μg/mL的梔子水提物能顯著降低細(xì)胞ASBT的表達(dá)（＜0.01、0.001），上調(diào)FXR的表達(dá)（＜0.05）。

3.4 篩選梔子水提物中潛在的藥效物質(zhì)

通過UHPLC-QTOF-MS中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測，如圖4所示，通過陽離子及陰離子模式下，梔子提取物、血中及回腸組織中共有的已知化合物37個，陽離子檢測模式下有麥芽三糖、麥芽五糖、2-乙?；?5-(四羥基丁基)咪唑、5,6-二甲基苯并咪唑、2,4-二羥基苯乙酮、(9,11)-13-酮基-亞油酸、(?)-異松蒎醇、5-羥甲基-2-呋喃甲醛、玉葉金花苷酸、木樨欖苷-11-甲酯、9--11-(3-戊基-2-環(huán)氧乙烷)-10-十一碳烯酸、6-羥基-7-甲氧基香豆素、4-羥基苯甲酸異丁酯、京尼平龍膽二糖苷、對甲氧基肉桂酸甲酯、1-苯基乙醇、京尼平、京尼平苷、3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、7,8-二羥基-4-甲基香豆素、斑蝥素、10-羥基-2-癸烯酸、4-香豆酸、刺五加苷E、丹皮酚、(1)-(＋)-樟腦醌、吲哚-3-乳酸、3,6-壬二烯醇、7-羥基-4-甲基香豆素-3-乙酸、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚、crocusatin C、2-hydroxyethyl gardemide A、jasminodiol、6′--sinapoyljasminoside C、epijasminoside A，陰離子檢測模式下有戟葉馬鞭草苷、京尼平苷、jasminoside A。提示這些化合物可能是潛在的活性物質(zhì)，能到達(dá)靶部位發(fā)揮藥效或激活腸道FXR。

進(jìn)一步對37個化合物通過計(jì)算機(jī)分子對接技術(shù)，初步篩選出23種化合物可能為FXR受體潛在的激動劑（表1），其通過激活腸道FXR而抑制ASBT對膽酸鹽的重吸收作用，促進(jìn)了膽酸鹽的糞便排泄而緩解了肝臟膽酸鹽蓄積。

圖4 梔子水提物、血液及回腸組織中質(zhì)譜陽(A) 和陰(B) 離子監(jiān)測模式下的化合物

表1 基于FXR-OCA晶體結(jié)構(gòu)篩選梔子水提物中潛在的FXR激動劑

4 討論

肝內(nèi)膽汁淤積主要是膽酸鹽肝腸循環(huán)障礙，使肝臟膽酸鹽蓄積而引起肝毒性[14]。本研究采用ig ANIT（75 mg/kg）誘導(dǎo)小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型，血清中ALT、AST、ALP活性及TBIL、TBA水平均顯著升高，且肝臟出現(xiàn)大面積橋接性壞死，膽囊充盈且膽汁顏色偏黑，與本課題組前期研究的結(jié)果一致[15]。梔子水提物干預(yù)14 d后，血清生化指標(biāo)均顯著降低，且肝臟病理及膽囊形態(tài)均趨于正常小鼠，以高劑量效果最好，提示梔子水提物對ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積具有明顯的治療作用，且這種作用存在劑量相關(guān)性。

肝臟膽酸鹽蓄積是導(dǎo)致膽汁淤積肝損傷的主要原因。ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積可導(dǎo)致肝臟、膽囊、血清中膽酸鹽顯著升高，但糞便中膽酸鹽降低，提示膽酸鹽在肝臟蓄積，且腸道排泄途徑受阻。梔子水提物（240 mg/kg）可顯著減少肝臟及血清膽酸鹽，增加糞便膽酸鹽含量，提示梔子水提物可促進(jìn)膽酸鹽的糞便排泄。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梔子水提物可促進(jìn)膽酸鹽的尿液排泄[5]，本研究從另一個角度證實(shí)了梔子水提物的利膽作用。TCA是回腸膽酸鹽重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體ASBT的底物，且TCA常用作探針評價回腸ASBT的功能[16]。在體腸灌流及外翻腸囊研究發(fā)現(xiàn)，ANIT干預(yù)后，TCA的回腸重吸收減少，而梔子水提物干預(yù)后TCA的回腸重吸收進(jìn)一步減少，提示ANIT和梔子水提物均能抑制回腸ASBT對TCA的攝取。ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積模型后，雖然抑制了回腸對ASBT對TCA的重吸收過程，但糞便膽酸鹽相比正常小鼠，其含量并未增加；然而，與ANIT組小鼠相比，梔子水提物卻增加了糞便膽酸鹽的排泄，提示梔子水提物除了進(jìn)一步抑制了回腸ASBT對TCA的重吸收外，還可能促進(jìn)了膽酸鹽從回腸向糞便的排泄，如增加腸蠕動等，但尚需更多的研究證實(shí)。

回腸ASBT是介導(dǎo)膽酸鹽重吸收的關(guān)鍵蛋白，約95%的膽酸鹽經(jīng)重吸收進(jìn)入肝門靜脈，再次入肝[9]，因此，阻斷膽酸鹽的重吸收途徑、促進(jìn)膽酸鹽的糞便排泄，是近年來利膽藥物開發(fā)的新思路，而ASBT也成為了治療膽汁淤積的新靶點(diǎn)。研究證實(shí)抑制回腸ASBT可明顯緩解小鼠膽汁淤積肝損傷[8,10]，且以ASBT為靶點(diǎn)治療膽汁淤積相關(guān)疾病的藥物A4250及BAT117213（二者均為ASBT抑制劑）也進(jìn)入了臨床研究階段[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，梔子水提物能明顯抑制小鼠回腸及腸道細(xì)胞中ASBT的表達(dá)，提示梔子水提物可阻斷膽酸鹽的回腸重吸收，從而減少膽酸鹽的肝臟蓄積，而糞便膽酸鹽的增加，則提示梔子進(jìn)一步促進(jìn)了膽酸鹽的糞便排泄?；啬cASBT的表達(dá)和功能受回腸FXR的負(fù)調(diào)控[14]，因此，本研究進(jìn)一步考察了梔子水提物對FXR的影響，發(fā)現(xiàn)梔子水提物可上調(diào)小鼠回腸及腸道細(xì)胞中FXR的表達(dá)，這可能是其抑制回腸ASBT表達(dá)的主要原因。此外，激動回腸FXR受體后，可通過回腸FXR-成纖維細(xì)胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15）通路負(fù)反饋抑制肝臟膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，Cyp7a1）的表達(dá)及功能，減少肝臟膽酸鹽的合成[14]，這可能是梔子水提物緩解肝臟膽酸鹽蓄積毒性的另一途徑，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

藥物通常吸收入血并由血液循環(huán)運(yùn)送至靶部位，才能發(fā)揮相應(yīng)的藥物活性。因此，分析梔子水提物、血液及回腸中可能存在的化合物，或可找到潛在的梔子水提物的活性物質(zhì)。本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，梔子水提物、血液及回腸組織中共有的并且已鑒定出的化合物共37個，并對這37個化合物通過計(jì)算機(jī)分子對接發(fā)現(xiàn)，有23個化合物可能是FXR的潛在激動劑，因此，基于這些化合物的進(jìn)一步研究或可開發(fā)出以回腸FXR-ASBT通路為靶點(diǎn)的膽汁淤積治療藥物。

綜上所述，梔子水提物可通過激活回腸FXR的功能，抑制回腸ASBT的表達(dá)和功能，減少膽酸鹽的回腸重吸收，并促進(jìn)回腸膽酸鹽的糞便排泄，減少膽酸鹽在肝臟的蓄積毒性，緩解了ANIT誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)膽汁淤積。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofwater extract on cholestasis in mice based on apical sodium-dependent bile acid transporter of ileum

ZHANG Guo-qiang1, 4, WEN Yuan-jie3, 4, DONG Yu-song1, 2, SHI Xiao-pan1, 2, WEI Yu-hui1, 4

1. Department of Pharmacy, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. The First Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 3. College of Pharmaceutical Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 4. Industry Technology Innovation Alliance of Hospital Traditional Chinese Medicine Preparation, Lanzhou 730000, China

To investigate the effect ofwater extract on α-naphthyl isothiocyanate (ANIT)-induced cholestasis in mice based on apical sodium dependent bile acid transporter (ASBT) of ileum, and screen the potential active compounds.C57BL/6 mice were randomly divided into control group,control group (240 mg/kg), ANIT group,water extractlow-, medium- and high-dose (60, 120, 240 mg/kg) groups and ursodeoxycholic acid (60 mg/kg) group, with 10 mice in each group. Drug intervention was given twice a day for 14 d; Cholestasis model of mice was induced by single ig ANIT (50 mg/kg) on 12th day.water extract was used to interfere with ANIT-induced MODE-K cells; Serum biochemical indexes and bile salt content in liver, serum, gallbladder, ileum and feces were measured; The expressions of ASBT and farnesoid X receptor (FXR) in ileum of mice and MODE-K cells were measured; The contents of sodium taurocholate (TCA) in ileum and hepatic portal vein were determined byintestinal perfusion and everted intestinal sac method; Qualitative metabonomics was used to determine the compounds in serum and ileum tissue after 2 h of igwater extract.Compared with ANIT group,water extract could alleviate liver diseases, reduce the content of bile salts in liver and TCA in ileum (< 0.05, 0.01), and increase the content of fecal bile salts (< 0.05);water extract increased the expression of FXR in ileum of mice and MODE-K cells (< 0.05, 0.01, 0.001), and decreased the expression of ASBT (< 0.01, 0.001). At the same time, 37 potential active compounds were screened.water extract can inhibit the expression and function of ASBT by activating FXR in ileum, reduce bile salt reabsorption in ileum, promote fecal excretion, and reduce hepatic bile salt accumulation, thereby relieving ANIT-induced intrahepatic cholestasis in mice.

Ellis; cholestasis; apical sodium-dependent bile acid transporter; farnesoid X receptor; genipin; geniposide; genipin-1-β--gentiobioside

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01 - 0122 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.015

2022-07-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82160711）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82174067）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960646）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81702853）；蘭州市科技指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目（2022-ZD-94）；蘭州大學(xué)第一醫(yī)院院內(nèi)基金優(yōu)秀博士科研啟動基金資助項(xiàng)目（ldyyyn2020-94）

張國強(qiáng)，男，博士，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬锔螕p傷及中藥藥理。E-mail: zhanggq15@lzu.edu.cn

通信作者：魏玉輝，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向中藥藥理研究及臨床藥學(xué)。E-mail: yhwei@lzu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]