紅花不同花色變異類型葉綠體基因組特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析

丁怡寧，畢光耀，胡賽文，周 艷，李賀敏，夏 至

紅花不同花色變異類型葉綠體基因組特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析

丁怡寧，畢光耀，胡賽文，周 艷，李賀敏*，夏 至*

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046

以紅花不同花色變異類型為材料，比較分析其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)及其與近緣類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為中藥材紅花種質(zhì)資源鑒定和群體遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。利用華大MGISEQ-2000PE150測(cè)序平臺(tái)，雙末端測(cè)序策略對(duì)紅花不同花色類型全基因組DNA建庫(kù)測(cè)序，用NOVOPlasty組裝葉綠體基因組，采用最大似然法（maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。紅花3種花色變異類型葉綠體基因組全長(zhǎng)均為153 114 bp，完全一致，GC值均為37.8%，具1個(gè)典型的四分區(qū)域結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）、1對(duì)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeats，IR）和1個(gè)短單拷貝區(qū)（small single copy，SSC），4個(gè)區(qū)序列長(zhǎng)度分別為84 128、25 194、18 598 bp。紅花的葉綠體基因組均有130個(gè)基因，其中編碼蛋白基因、rRNA基因與tRNA基因的數(shù)量均為84、8、38個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，紅花3種花色變異類型聚在一支，與菜薊族的鋪散矢車菊構(gòu)成一單系分支，具有100%支持率。葉綠體基因組數(shù)據(jù)支持紅花3種花色變異類型來(lái)源為同一種，藥用植物紅花（所在紅花屬）隸屬于菊科菜薊族的矢車菊亞族。

紅花；葉綠體基因組；組裝；系統(tǒng)發(fā)育；近緣類群

藥用植物紅花L.，隸屬于菊科（Asteraceae）紅花屬L.，為一年生草本[1]。紅花原產(chǎn)中亞地區(qū)，引種后在我國(guó)廣為栽培，以河南和新疆栽培面積大，所產(chǎn)紅花質(zhì)量好?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定紅花有效成分為羥基紅花黃色素A[2]。近年來(lái)，化學(xué)成分研究表明紅花主要含黃酮類物質(zhì)、脂肪酸、色素、酚酸、揮發(fā)油等多種活性成分[3]，具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病等藥理作用，臨床應(yīng)用十分廣泛[4]。藥用植物紅花在栽培過(guò)程中，常出現(xiàn)花色分化現(xiàn)象，除常見(jiàn)的橙紅色花，還有部分淺黃色和白色花。這些花色變異的類型是種內(nèi)變異還是來(lái)源于同屬不同物種，需要進(jìn)一步的形態(tài)和分子驗(yàn)證。目前，藥用植物紅花的葉綠體基因組雖然已經(jīng)報(bào)道[5]，但是對(duì)于紅花不同花色變異類型的葉綠體基因組組裝、基因組特征和系統(tǒng)進(jìn)化分析等未見(jiàn)報(bào)道。

葉綠體是植物最重要的細(xì)胞器之一，具有一整套用于光合作用、能量代謝、蛋白質(zhì)合成及氮、硫同化相關(guān)的基因，分布在大小為120～180 kb的環(huán)狀基因組上，具有結(jié)構(gòu)保守，母性遺傳等特點(diǎn)[6-7]。葉綠體基因組一般為閉環(huán)雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，陸生植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)通常由1個(gè)大單拷貝區(qū)域（large single copy，LSC）、1個(gè)短單拷貝區(qū)域（small single copy，SSC）和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)域（inverted repeat，IR）組成[8]。葉綠體基因組擁有相對(duì)獨(dú)立的基因組和遺傳序列，并且不像核基因組一般有著復(fù)雜的重復(fù)序列，其基因序列保守，間隔區(qū)變異位點(diǎn)豐富，適宜的進(jìn)化速率能夠?yàn)橹参锊煌燃?jí)的親緣關(guān)系[9]，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及遺傳多樣性研究提供較為可靠的信息[10]。

近年來(lái)，葉綠體全基因組測(cè)序研究的快速發(fā)展為藥用植物的分子鑒定研究提供了新的平臺(tái)及思路[11]。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷改進(jìn)，測(cè)序平臺(tái)的不斷升級(jí)，一系列組裝和注釋軟件如plasmid SPAdes[12]、NOVOPlasty[13]、GetOrganelle[14]等的開(kāi)發(fā)與更新，多種重要的藥用植物葉綠體基因組已完成測(cè)序和分析，如人參C. A. Meyer[15]、厚樸(Rehder & E. H. Wilson) N. H. Xia & C. Y. Wu[16]、紅豆杉(Pilger) Florin[17]、肉蓯蓉Ma[18]、三七(Burkill) F. H. Chen ex C. Chow & W. G. Huang[19]、野菊Linnaeus[20]、石斛Lindl.[21]、地黃(Gaert.) Libosch. ex Fisch. et Mey[22]、射干(L.) Redouté[23]等的葉綠體全基因組序列的分析已有相關(guān)報(bào)道。本研究以紅花不同花色變異類型為材料，利用高通量測(cè)序方法測(cè)定其基因組DNA序列，并對(duì)該植物的葉綠體基因組進(jìn)行組裝和注釋。分析藥用植物紅花3種花色類型葉綠體基因組序列特征，IR邊界特征，間隔區(qū)信息位點(diǎn)的特征，并對(duì)紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）植物的葉綠體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，驗(yàn)證其在科級(jí)系統(tǒng)發(fā)育中的位置，為藥用植物紅花的種質(zhì)資源的鑒定、開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

紅花L. 3種顏色（橙紅色、淺黃色、白色）的新鮮葉片釆集于河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣小吳莊村河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)（35°6′32″N，113°56′34″E），憑證標(biāo)本號(hào)分別為XZ-2020-30、XZ-2020-29、XZ-2020-28。葉片裝入取樣袋后帶回實(shí)驗(yàn)室，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，晾干后置于?80 ℃冰箱備用。樣品由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系高致明教授和夏至副教授鑒定為菊科紅花屬的紅花。憑證標(biāo)本保存于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本館，紅花及其近緣物種葉綠體基因組序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)驗(yàn)材料詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 DNA的提取和高通量測(cè)序

采用北京天根生化植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，中國(guó)）提取樣品紅花新鮮葉片的總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。樣品送至華大生物科技公司（北京）后，進(jìn)行NanoDrop2000微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)）檢測(cè)總DNA的純度和濃度。MGISEQ-2000 PE150測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序完成后，利用華大自主開(kāi)發(fā)的過(guò)濾軟件SOAPnuke過(guò)濾參數(shù)，過(guò)濾步驟：（1）過(guò)濾接頭：測(cè)序read匹配上adapter序列的25%或者以上則刪除整條read；（2）過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)：如果測(cè)序read中質(zhì)量值低于20的堿基占整條read的30%或者以上則刪除整條read；（3）去N：如果測(cè)序read中N含量占整條read的1%或者以上，則刪除整條read；（4）獲得Clean reads。數(shù)據(jù)以FASTQ格式儲(chǔ)存，用于后續(xù)的拼接和注釋。

2.2 葉綠體基因組的拼接和注釋

葉綠體基因組拼接釆用NOVOPlasty[13]程序，插入片段大小設(shè)為150 bp。過(guò)濾后的reads用Geneious 11.0.3[24]拼接軟件組裝成重疊群，并對(duì)組裝中的簡(jiǎn)并堿基，進(jìn)行人工修正。利用Geneq-Annotation of Organellar（https://chlorobox.mpimpgolm.mpg.de/ geseq.html），結(jié)合NCBI上已報(bào)道的紅花（GenBank登錄號(hào)：KM207677）注釋結(jié)果對(duì)紅花的3個(gè)樣品葉綠體全基因組進(jìn)行基因注釋，參數(shù)為默認(rèn)值，最后進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整。tRNA用ANAGORNV1.2.38（https:// chlorobox. mpimp golm.mpg.de/geseq.html）預(yù)測(cè)。注釋完成后，提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/ genbank/），GenBank登錄號(hào)分別為MZ779040（橙紅色，XZ2130），MZ779039（淺黃色，XZ2129），MZ779038（白色，XZ2128）。利用在線工具OGDRAW-DRAW Organelle Genome Maps（https: //chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw. html）繪制葉綠體結(jié)構(gòu)圖。

表1 植物樣品來(lái)源

2.3 葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴(kuò)張分析

IR區(qū)域在葉綠體基因中具有高度保守性，IR邊界的膨脹和收縮被認(rèn)為是被子植物葉綠體全基因組大小變化的主要機(jī)制[25]。在植物進(jìn)化過(guò)程中，IR/SC邊界不同程度的擴(kuò)張和收縮是導(dǎo)致邊界和基因組長(zhǎng)度多樣性的原因[26]。本研究使用Geneious 11.0.3[22]軟件獲得紅花及菊科其他11種植物葉綠體基因組的IRA/IRB、LSC和SSC和邊界基因的序列長(zhǎng)度，進(jìn)行比較分析，探討菊科植物葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴(kuò)張?zhí)卣?。并使用Adobe illustrator軟件繪制菊科管狀花亞科12個(gè)屬植物葉綠體基因組IR邊界對(duì)比圖。

2.4 葉綠體基因組基因間隔區(qū)信息位點(diǎn)分析

相比葉綠體基因編碼區(qū)，葉綠體基因間隔區(qū)在近緣物種間往往具有更高的變異位點(diǎn)，常被用來(lái)構(gòu)建屬間、屬內(nèi)、種間物種系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育關(guān)系[27]。本研究基于紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）植物的葉綠體基因組序列特征，利用Phylosuite vl.2.1[28]提取紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）植物的葉綠體基因組共有的間隔區(qū)。統(tǒng)計(jì)這些間隔區(qū)的信息位點(diǎn)百分率，為下一步構(gòu)建菊科屬級(jí)和屬內(nèi)種間物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供分子標(biāo)記。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于菊科（Asteraceae）管狀花亞科（Carduoideae）紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）葉綠體基因組數(shù)據(jù)（表1），同時(shí)以菊科（Asteraceae）舌狀花亞科（Cichorioideae）假還陽(yáng)參和蒲公英為外類群，利用phylosuite vl.2.1[26]軟件基于MAFFT[29]進(jìn)行多重比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育分析采用最大似然法（maximum Likelihood，ML），利用CIPRES Science Gateway服務(wù)器（http://www. phylo.org/）中RaxML-HPC2 8.2.12軟件[30]，采用GTR+GAMMA+I建樹(shù)模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用Bootstrap（BS）（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅花3種花色類型的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

橙紅色、淺黃色、白色這3種花色的紅花，花期一致，植株形態(tài)無(wú)明顯差異，隨花期的變化，其顏色一直保持穩(wěn)定，并且花色差異明顯（圖1）。測(cè)序結(jié)果去除接頭和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，組裝和注釋后得到橙紅色、淺黃色、白色紅花的葉綠體基因組。結(jié)果表明，紅花3種花色類型的葉綠體全基因組均為共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀分子（圖2），全長(zhǎng)均為153 114 bp，是一個(gè)典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)大單拷貝區(qū)（LSC）、1對(duì)反向重復(fù)區(qū)（IR）和1個(gè)短單拷貝區(qū)（SSC），紅花3種花色類型的4個(gè)區(qū)長(zhǎng)度均相等，序列長(zhǎng)度分別為84 128、25 194、18 598 bp。3種花色的紅花在LSC區(qū)域、SSC區(qū)域和IRs區(qū)中GC含量也完全一致，分別為36.0%、31.4%、43.2%。

圖1 紅花（3種花色）不同開(kāi)花時(shí)期的花瓣

3.2 紅花3種花色類型葉綠體基因組的組成和特點(diǎn)分析

紅花3種花色類型的葉綠體基因組完全一致，均包括130個(gè)基因，非重復(fù)基因115個(gè)，其中84個(gè)編碼蛋白基因（PCG）、8個(gè)rRNA基因與38個(gè)tRNA基因。其中，蛋白質(zhì)編碼基因中與自我復(fù)制相關(guān)基因除rRNA基因和tRNA基因外，還包括13個(gè)核糖體小亞基基因、11個(gè)核糖體大亞基基因和4個(gè)RNA聚合酶亞基基因；光合作用相關(guān)的基因有44個(gè)，包括12個(gè)NADH脫氫酶基因、5個(gè)光合系統(tǒng)I基因、14個(gè)光合系統(tǒng)II基因、6個(gè)細(xì)胞色素復(fù)合物編碼基因、6個(gè)ATP合酶基因、1個(gè)二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因；此外還有5個(gè)其他功能基因及7個(gè)未知功能基因（表2）。在tRNA中trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-、trnN-GUU、trnR-ACG和trnV-GAC各有2個(gè)拷貝，trnF-GAA有3個(gè)拷貝；4個(gè)核糖體RNA（rrn5 rRNA、rrn4.5 rRNA、rrn23 rRNA、rrn16 rRNA）均有2個(gè)拷貝，分別位于反向重復(fù)區(qū)IRA和IRB。核糖體蛋白大小亞基編碼的基因中，和這2個(gè)基因均有2個(gè)拷貝，其余為1個(gè)拷貝。NADH脫氫酶亞基中的基因及未知功能蛋白基因和的拷貝數(shù)均為2。紅花葉綠體基因組中有21個(gè)基因有內(nèi)含子。其中，trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC、rps16、rpl2、rpl16、rpl23、rpoC1、ndhA、ndhB、petB、petD和atpF各有1個(gè)內(nèi)含子，而rps12、clpP、ycf3具2個(gè)內(nèi)含子。matK基因位于tmK-UUU基因內(nèi)，整個(gè)編碼區(qū)為trnK-UUU內(nèi)含子的一部分，存在序列共用現(xiàn)象。

LSC和SSC：大單拷貝區(qū)域、小單拷貝區(qū)域；IRA和IRB：2個(gè)反向重復(fù)區(qū)域；內(nèi)圈深色部分：GC含量

表2 紅花葉綠體基因組編碼的基因

a和b分別表示含有1個(gè)和2個(gè)內(nèi)含子 c-含有2個(gè)拷貝基因 d-含有3個(gè)拷貝基因

a and b represent 1 and 2 introns respectively, c-contains 2 copy genes, d contains 3 copy genes

3.3 菊科部分物種葉綠體全基因組特征比較分析

菊科植物葉綠體基因組特征的比較分析見(jiàn)表3，紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）植物葉綠體基因組的序列長(zhǎng)度范圍為150 063～153 318 bp，其中下田菊的葉綠體全基因組長(zhǎng)度最短（150 063 bp），鉆葉紫菀的葉綠體基因組最長(zhǎng)（153 318 bp）。不同花色的紅花葉綠體基因組全長(zhǎng)完全相同，均為153 114 bp，介于菊科18個(gè)物種的葉綠體基因組長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。紅花及其17種近緣植物葉綠體基因組GC含量的范圍為37.0%～37.8%，鉆葉紫菀的GC含量最低（37.0%），不同花色的紅花GC值完全相同，且含量最高（37.8%）。

利用Geneious 11.0.3軟件獲取紅花及17種近緣菊科植物的IR區(qū)、LSC區(qū)和SSC區(qū)序列。結(jié)果表明，IR區(qū)的序列長(zhǎng)度范圍為23 776～25 238 bp，其中假臭草的IR區(qū)最短（23 776 bp），鋪散矢車菊的IR區(qū)最長(zhǎng)（25 238 bp），不同花色的紅花IR區(qū)的長(zhǎng)度完全一致均為25 194 bp，介于菊科21個(gè)樣品IR區(qū)長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。LSC區(qū)序列長(zhǎng)度范圍為82 017～94 697 bp，其中下田菊的LSC區(qū)長(zhǎng)度最短（82 017 bp），紫菀的LSC區(qū)長(zhǎng)度最長(zhǎng)（94 697 bp），不同花色的紅花LSC區(qū)的長(zhǎng)度完全一致均為84 128 bp，介于菊科18個(gè)物種LSC區(qū)長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。SSC區(qū)序列長(zhǎng)度范圍介于17 949～18 598 bp，其中豚草的SSC區(qū)最短（17 949 bp），不同花色的紅花SSC區(qū)的長(zhǎng)度完全一致且最長(zhǎng)（18 598 bp）。

表3 菊科植物18種（21個(gè)樣品）的葉綠體基因組特征

3.4 紅花及菊科11種植物的葉綠體全基因組邊界的特征

紅花及本研究選取的管狀花亞科11個(gè)屬共12種植物葉綠體基因組的IR-LSC和IR-SSC邊界比較顯示（圖3），不同花色的紅花，其邊界具有高度的保守性，各邊界側(cè)翼基因完全相同，擴(kuò)張程度也完全一致。紅花與其余11種菊科植物葉綠體全基因組相比，邊界處具有相同的基因，但是基因的長(zhǎng)度仍有差異，部分邊界基因也存在變化。LSC/IRb邊界（JLB）邊界擴(kuò)張范圍顯示，紅花與其余11種菊科植物相比，JLB邊界均位于rps19基因內(nèi)，但擴(kuò)張程度稍有差異，紅花rps19基因向LSC區(qū)域擴(kuò)張220 bp，向IRb擴(kuò)張59 bp。SSC/IRb（JSB）邊界擴(kuò)張范圍顯示，紅花與11種菊科植物JSB邊界側(cè)翼基因?yàn)閥cf1和ndhF基因。鋪散矢車菊和狹苞橐吾JSB邊界位于ycf1基因左翼，距離分別為0、1 bp，而紅花與其余9種菊科植物的JSB邊界均位于ycf1基因內(nèi)，但擴(kuò)張程度稍有差異。SSC/IRa（JSA）邊界擴(kuò)張范圍顯示，而紅花與紫菀、鋪散矢車菊、狹苞橐吾和假臭草這5種菊科植物的JSA邊界均位于基因內(nèi)，但擴(kuò)張程度稍有差異，而下田菊與向日葵JSA邊界位于基因左翼、藿香薊、豚草、菊花、闊苞菊和鉆葉紫菀的JSA邊界位于基因的右翼；LSC/IRa（JLA）邊界擴(kuò)張范圍顯示，JLA邊界，邊界處具有相同的基因，左翼為基因，右翼為基因，但擴(kuò)張程度稍有差異。此外，鋪散矢車菊的葉綠體基因組在IRb區(qū)域，顯示具有基因，IRa區(qū)域存在2基因序列，但是沒(méi)有注釋，因此LSC/IRa邊界（JLA）中，基因名稱沒(méi)有顯示。

圖3 紅花及菊科11種植物的葉綠體全基因組邊界圖

3.5 菊科葉綠體基因組基因間隔區(qū)信息位點(diǎn)分析

基于紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）的葉綠體基因組間隔區(qū)信息序列特征統(tǒng)計(jì)表明（表4），在21個(gè)葉綠體基因間隔區(qū)中，變異位點(diǎn)百分率變化范圍為5.8%～28.8%，最高的trnH-GUG-psbA基因間隔區(qū)，其變異位點(diǎn)百分率為28.8%。變異位點(diǎn)百分率超過(guò)15%的有6個(gè)，分別為ndhC-trnV-UAC、psbE-petL、psbM-trnD-GUC、rps18-rpl20、trnH- GUG-psbA、trnS-GCU-trnC-GCA。變異位點(diǎn)百分率介于10%～15%的有11個(gè)，分別為atpB-rbcL、atpH-atpF、atpI-atpH、cemA-petA、psaI-ycf4、psaJ-rpl33、psbK-psbI、rpoC2-rps2、rps18-rpl20、trnC-GCA-petN、trnT-GGU-psbD、ycf4-cemA。變異位點(diǎn)百分率低于10%的有4個(gè)，分別為psaA-ycf3、psaA-ycf3、rps2-atpI、trnP-UGG-psaJ。這些變異位點(diǎn)百分率較高的葉綠體基因間隔區(qū)，能提供足夠多的信息位點(diǎn)，為菊科屬間和種間物種進(jìn)化關(guān)系及分子鑒定提供較高的分辨率。

表4 菊科植物18種21個(gè)樣品葉綠體基因間隔區(qū)矩陣位點(diǎn)信息

3.6 菊科葉綠體全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

基于紅花及其近緣物種共18種（21個(gè)樣品）的葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示（圖4），菊科的管狀花亞科類群構(gòu)成一單系分支，具有100%支持率。同一族取樣的物種聚在一起，單系性得到100%支持。在系統(tǒng)樹(shù)上，取樣類群可以分為3個(gè)主要分支，A分支是菜薊族構(gòu)成的單系分支，具有100%支持率。紅花3種不同花色類型與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的紅花樣品（登錄號(hào)：KM207677）聚在一支，具有100%支持率，進(jìn)一步與鋪散矢車菊聚在一支，支持率均為100%。分支B包括2個(gè)族，紫菀族和千里光族均構(gòu)成單系分支具有100%的支持率。分支C包括4個(gè)族，澤蘭族、向日葵族、旋覆花族和看黃菊族構(gòu)成單系分支具有100%的支持率。

分支上部數(shù)值表示ML分析的BS分析對(duì)該分支的支持強(qiáng)度（＞50%）

4 討論

紅花作為我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材之一，具有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究完成了藥用植物紅花3種花色類型的葉綠體基因組的測(cè)序，組裝與注釋。結(jié)果表明，紅花3種花色的葉綠體基因組序列完全一致，具有典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)（圖2），包括1個(gè)LSC區(qū)、1對(duì)IR區(qū)和1個(gè)SSC區(qū)，長(zhǎng)度均為153 114 bp。葉綠體基因組數(shù)據(jù)支持紅花3種花色類型，來(lái)源為同一種紅花，準(zhǔn)確鑒定了紅花3種花色變異類型的基原物種來(lái)源，確保了紅花臨床用藥的安全。紅花花色變異可能與花青素生物合成途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分子調(diào)控機(jī)制有關(guān)[31]，淺黃色的紅花變異類型可能來(lái)源于橙紅色和白色的變異類型的自然雜交。

對(duì)比紅花與菊科其他物種的葉綠體基因組，結(jié)果表明紅花葉綠體基因組長(zhǎng)度、IR區(qū)和LSC區(qū)長(zhǎng)度，均位于菊科其他17個(gè)物種葉綠體基因組長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。但紅花葉綠體基因組GC值及SSC區(qū)序列長(zhǎng)度均高于菊科其他17個(gè)物種。紅花與菊科其他11個(gè)屬共12種植物的葉綠體基因組IR邊界分析（圖3）顯示，其LSC/IRb邊界（JLB），SSC/IRb邊界（JSB），SSC/IRa邊界（JSA）和LSC/IRa邊界（JLA）的側(cè)翼基因完全相同，各邊界基因序列的擴(kuò)張長(zhǎng)度略有差異。鋪散矢車菊的葉綠體基因組在IRb區(qū)域具有基因，同樣IRa區(qū)域也具有基因，但沒(méi)有注釋，因此LSC/IRa邊界（JLA）中，鋪散矢車菊基因名稱沒(méi)有顯示（圖3）。相對(duì)于葉綠體基因組編碼區(qū)基因具有較高的保守性，葉綠體基因組的基因間隔區(qū)往往具有豐富的變異位點(diǎn)，基于菊科管狀花亞科7個(gè)族18種植物（21個(gè)樣品）的葉綠體基因組間隔區(qū)信息序列特征統(tǒng)計(jì)表明（表4），變異位點(diǎn)百分率超過(guò)15%的基因間隔區(qū)有6個(gè)，分別為ndhC-trnV-UAC、psbE-petL、psbM-trnD- GUC、rps18-rpl20、trnH-GUG-psbA、trnS-GCU-trnC- GCA基因間隔區(qū)。其中trnH-GUG-psbA基因間隔區(qū)變異位點(diǎn)最高為28.8%。這些變異位點(diǎn)百分率較高的葉綠體基因間隔區(qū)，能提供足夠多的信息位點(diǎn)，為菊科屬下大范圍的物種鑒定，雜交起源，多倍體物種的形成和系統(tǒng)進(jìn)化分析提供可靠的分子標(biāo)記片段。

為進(jìn)一步界定藥用植物紅花在菊科的系統(tǒng)位置，探討紅花屬與其近緣屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。基于菊科18種（21個(gè)樣品）葉綠體基因組全長(zhǎng)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，取樣的管狀花亞科所有類群聚在一單系分支具有100%支持率，紅花不同花色類型的樣品聚在一起具有100%支持率，紅花（所在紅花屬）與鋪散矢車菊（所在矢車菊屬）聚在一支，構(gòu)成姐妹群（分支A）具有100%支持率。中國(guó)植物志記載[1]，菊科菜薊族的矢車菊亞族（Centaureinae）主要的特征在于它的瘦果有側(cè)生著生面，而藥用植物紅花（所在紅花屬）具有典型的瘦果有側(cè)生著生面的形態(tài)特征。本研究葉綠體基因組數(shù)據(jù)分子結(jié)果支持傳統(tǒng)分類研究結(jié)果[1]，再次驗(yàn)證藥用植物紅花（所在紅花屬）隸屬于菜薊族的矢車菊亞族。

菊科是被子植物中種類最多的一個(gè)科，包含大量的藥用植物。同時(shí)菊科植物也是分布最廣的一個(gè)類群，是雙子葉植物中進(jìn)化地位最高的一個(gè)科，物種形態(tài)變異多樣關(guān)[1]。本研究首次報(bào)道了藥用植物紅花不同花色變異類型的葉綠體全基因組，綜合分析菊科藥用植物如紅花、菊花、野菊花等的葉綠體基因組序列、結(jié)構(gòu)和特征，篩選出一批高變異的葉綠體基因組的間隔區(qū)。這為菊科藥用植物的分子鑒定，種質(zhì)資源保護(hù)，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Characterization and phylogenetic analysis of complete chloroplast genome of different color medicinal plant

DING Yi-ning, BI Guang-yao, HU Sai-wen, ZHOU Yan, ZHOU Yan, LI He-min, XIA Zhi

College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China

In order to provide foundation formolecular identification and population genetics studies, we sequenced and assembled the complete chloroplast genome of three flower color variants,and constructed the phylogenetic relationship between it and its relatives.Genome DNA library was constructed with the paired-end strategy, and MGISEQ-2000PE150 platform was used to sequence in Beijing Genomics Institute (China). The complete chloroplast genome was assembled using NOVOPlasty software, and sequence analysis was performed based on gene annotation results. Phylogenetic analyses were performed using Maximum-Likelihood (ML) methods.The complete chloroplast genome of three different colorshas same length 153 144 bp with a GC content of 37.8%. The chloroplast genome exhibited a typical quadripartite structure, including a large single copy region (LSC), a pair of inverted repeats (IR), and a small single copy (SSC), and the sequence lengths were 84 128 bp, 25 194 bp, and 18 598 bp. The chloroplast genome harbored 130 genes, including 84 protein-coding genes, 8 rRNA genes, and 38 tRNA genes. Phylogenetic analyses result indicates that the three flower color variantsform one clade, and this clade is sister towith bootstrap 100%.Our result supported the three flower color variants offrom the same species. The medicinal plant(genus) belongs to Centaureinae of Cynareae in Asteraceae.

L.; chloroplast genome; assembly; phylogenetic analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0262 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.028

2022-07-06

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102110137）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃（22A360010）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1404302）

丁怡寧（1997—），女，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源的分子鑒定。

通信作者：李賀敏，女，副教授，主要從事中藥資源的分類鑒定，E-mail: lihemin2002@henau.edu.cn

夏 至，教授，主要從事中藥資源的分子鑒定及分子生藥學(xué)研究。E-mail: xiazhiemail@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]