當(dāng)歸抽薹開花過(guò)程中赤霉素代謝水平及其關(guān)鍵酶基因克隆與表達(dá)分析

劉 迪，崔秀文，黃天苗，李美玲，栗孟飛*，魏建和

? 藥材與資源?

當(dāng)歸抽薹開花過(guò)程中赤霉素代謝水平及其關(guān)鍵酶基因克隆與表達(dá)分析

劉 迪1，崔秀文1，黃天苗1，李美玲1，栗孟飛1*，魏建和2*

1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193

對(duì)當(dāng)歸16個(gè)赤霉素（gibberellins，GAs）進(jìn)行含量測(cè)定、GAs代謝酶基因篩選并進(jìn)行生物信息學(xué)分析、關(guān)鍵基因克隆及表達(dá)驗(yàn)證，以期為調(diào)控當(dāng)歸抽薹開花提供理論依據(jù)。利用HPLC-MS/MS對(duì)不同材料中GAs含量進(jìn)行測(cè)定與分析，基于當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組篩選直接參與GAs代謝酶基因，利用在線工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)關(guān)鍵酶基因和表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。在所測(cè)定的16個(gè)GAs中，8個(gè)GAs含量在早薹植株中高于非早薹植株，13個(gè)GAs含量隨植株發(fā)育時(shí)期延長(zhǎng)逐漸增加。當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中含有9個(gè)直接參與GAs代謝的酶基因，可分為6個(gè)亞家族，共含有6個(gè)保守基序，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。和基因克隆片段由于插入序列與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序片段存在長(zhǎng)度差異?；蛟诔檗分仓辍㈦S種苗春化作用和植株發(fā)育時(shí)期延長(zhǎng)呈現(xiàn)低表達(dá)，而在冷凍規(guī)避春化作用種苗中呈現(xiàn)高表達(dá)，基因則相反；和基因在葉和莖中相對(duì)于根均呈現(xiàn)高表達(dá)。當(dāng)歸含有9個(gè)直接參與GAs代謝的酶基因，各成員理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)存在一定的差異，和基因表達(dá)水平與當(dāng)歸抽薹開花生理調(diào)控一致。

當(dāng)歸；赤霉素；赤霉素代謝基因；生物信息學(xué)；基因克??；抽薹開花

當(dāng)歸(Oliv.) Diels為我國(guó)大宗中藥材，不僅具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便等傳統(tǒng)功效[1]，還具有消炎、抗癌和治療心腦血管疾病等現(xiàn)代藥理學(xué)作用[2]。目前，當(dāng)歸年種植面積達(dá)4.35萬(wàn)hm2[3-4]；然而，栽培生產(chǎn)過(guò)程中高達(dá)50%的植株早薹開花，使得肉質(zhì)根木質(zhì)化，不能入藥[5-6]。

赤霉素（gibberellins，GAs）是一類二萜類化合物，其合成和降解在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要調(diào)節(jié)作用[7-8]。目前，在已鑒定出的136種GAs中，GA1、GA3、GA4、GA5、GA6和GA7等具有生物活性[7]；比如，GA4通過(guò)調(diào)控基因誘導(dǎo)花發(fā)育[9]，GA5和GA6參與花器官分生組織分化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，GAs生物合成主要分為3個(gè)階段，在第1階段，牻牛兒牻牛兒焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）先后通過(guò)內(nèi)根-古巴焦磷酸合成酶（-copalyl-diphosphate synthase，CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（-kaurene synthase，KS）環(huán)化為內(nèi)根-貝殼杉烯（-kaurene）。在第2階段，內(nèi)根-貝殼杉烯先后通過(guò)內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（-kaurene oxidase，KO）和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（-kaurenoic acid oxidase，KAO）形成GA12-7-醛（GA12-7-aldehyde）。在第3階段，以GA12-7-醛為中心主要由2條途徑合成其他GAs；在第1條途徑中，GA12-7-醛首先被氧化成GA12，其在GA20ox酶的作用下依次形成GA15、GA24和GA9，在GA13ox和GA20ox酶的作用下先后形成GA53、GA44、GA19和GA20；然后，GA9和GA20在GA3ox酶的作用下分別形成具有生物學(xué)活性的GA4和GA1，繼而在GA2ox酶的作用下分別形成非活性的GA34和GA8；另外，GA9在GA3ox酶的作用下也可形成GA7，GA20在GA2ox酶的作用下也可形成GA29、或在GA3ox酶的作用下形成GA5；在第2條途徑中，GA12-7-醛先后在GA7ox酶的作用下形成GA14-7-醛和GA14，后者也可形成有活性的GA4[7, 11-12]（圖1）。以上途徑表明，作為GA生物合成的限速步驟，GA2ox和GA20ox酶分別為失活和活性的關(guān)鍵酶，GA2ox6酶可以抑制-基因的表達(dá)延遲開花[13]；GA20ox1酶可以催化GA12轉(zhuǎn)變?yōu)镚A9，繼而促進(jìn)活性GA4和GA7的生物合成促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)[14]。

圖1 GAs生物合成途徑及其相關(guān)酶

前人研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施GA3或抽薹開花過(guò)程中，當(dāng)歸植株GA3含量存在顯著變化[15-16]。對(duì)當(dāng)歸抽薹開花分子調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，約70個(gè)基因通過(guò)5條途徑參與抽薹開花，包括春化作用、光周期、自主、年齡、以及GA途徑[17-21]。到目前為止，對(duì)當(dāng)歸抽薹開花過(guò)程中多個(gè)GAs代謝水平和酶基因生物信息學(xué)分析、關(guān)鍵酶基因克隆與表達(dá)等方面的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究基于前期當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，開展了16個(gè)GAs代謝水平測(cè)定、直接參與GAs代謝酶基因生物信息學(xué)分析、關(guān)鍵酶基因（和）克隆及表達(dá)驗(yàn)證，旨在深入揭示GAs代謝的生物學(xué)功能，為有效抑制抽薹開花提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

樣品取自本實(shí)驗(yàn)室?80 ℃保存的岷歸1號(hào)兩年生早薹（EB）與非早薹（Un-EB）植株、三年生不同時(shí)期［營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（S1）、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)過(guò)渡期（S2）、抽薹初期（S3）和抽薹伸長(zhǎng)期（S4）］植株的葉片和側(cè)根，樣品原植物均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)栗孟飛教授鑒定為當(dāng)歸(Oliv.) Diels，植株生長(zhǎng)環(huán)境及樣品信息詳見課題組前期實(shí)驗(yàn)[18-19]。GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA7、GA8、GA9、GA14、GA15、GA19、GA20、GA24、GA44、GA51、GA53對(duì)照品購(gòu)自Sigma公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，色譜甲醇購(gòu)自Tedia公司。

1.2 儀器

Aglient 1290型高效液相色譜儀，美國(guó)Aglient公司；QTRAP 6500型質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司；UYC-200型全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造公司；氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)SORVAL公司；ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司；超微量分光光度計(jì)，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 GAs含量的測(cè)定

2.1.1 赤霉素對(duì)照品溶液制備 分別稱取GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA7、GA8、GA9、GA14、GA15、GA19、GA20、GA24、GA44、GA51、GA53對(duì)照品，以甲醇為溶劑配制梯度為0.1、0.2、0.5、2、5、20、50和200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)質(zhì)量濃度2次重復(fù)。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取新鮮樣品1.0 g，研磨后加入10 mL乙腈溶液4 ℃震蕩8 h，4 ℃、13 000 r/min離心5 min取上清，沉淀再次加入10 mL乙腈溶液，重復(fù)上述操作取上清，合并2次上清液，避光，以氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)相，400 μL甲醇溶解。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 HPLC-MS/MS條件 使用高效液相色譜儀（Aglient 1290）-質(zhì)譜儀（QTRAP 6500，AB SCIEX）。（1）HPLC條件：色譜柱為Poroshell 120 SB-C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相為甲醇/0.1%甲酸（A）-水/0.1%甲酸（B）；梯度洗脫（0～1 min，20%A；1～9 min，20%～80% A；9～10 min，80% A；10～10.1 min， 80%～20% A，10.1～15 min，20% A）；體積流量1 mL/min。（2）MS條件：采用電噴霧（electron spray ionization，ESI）離子源負(fù)離子電離模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，霧化器壓力447.85 kPa，輔助氣壓力482.30 kPa，霧化溫度400 ℃，氣簾氣103.35 kPa，毛細(xì)管電壓4500 V。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測(cè)定 將“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品溶液用0.22 μm濾膜濾過(guò)，利用HPLC-MS/MS分別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液的峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（），GAs質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸計(jì)算。根據(jù)16個(gè)GAs線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，表明對(duì)照品在0.1～200 ng/mL內(nèi)線性良好（表1）。

表1 16個(gè)GAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照公式計(jì)算赤霉素含量（）。

＝×/

為GAs的質(zhì)量濃度，為樣品最終溶解時(shí)所用的溶液體積，為稱取的樣品質(zhì)量

2.1.5 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用SPSS軟件（檢驗(yàn)）進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析（＜0.05）；使用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2.2 GAs關(guān)鍵酶基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因序列來(lái)源 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于不同品種（岷歸1號(hào)和岷歸2號(hào)）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組（NCBI access：PRJNA782300）[22]；岷歸1號(hào)種苗春化作用過(guò)程中[T1（0 ℃，14 d；未通過(guò)春化）、T2（0 ℃，60 d；通過(guò)春化）和T3（?3 ℃，125 d；低溫規(guī)避春化)]全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組（NCBI access：PRJNA789039）[17]。利用關(guān)鍵詞“gibberellins”和“GA”直接檢索，初步篩選GA代謝相關(guān)基因，去除重復(fù)；然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能鑒定，去除非相關(guān)基因。

2.2.2 直接參與GAs代謝相關(guān)蛋白質(zhì)序列鑒定及理化性質(zhì)分析 蛋白質(zhì)序列（包括氨基酸長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)）分析利用ExPASy在線工具；亞細(xì)胞定位利用Cell-PLoc在線工具；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用PRABI-Gerland在線工具；蛋白質(zhì)3D建模利用Phyre 2在線工具。

2.2.3 直接參與GAs代謝相關(guān)蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)選擇10個(gè)物種（擬南芥(L.) Heynh.黃胡蘿卜Hoffm.、藍(lán)果樹Oliv.、可可L.、芝麻L(zhǎng).、陸地棉L.、茶樹(L.) O. Kuntze、葡萄L.、煙草L、番茄L）中置信度較高的82個(gè)蛋白，利用MEGA11.0軟件鄰接法（neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（重復(fù)次數(shù)1000次，其他參數(shù)為默認(rèn)值）。蛋白質(zhì)保守基序分析利用MEME軟件，并利用TBtools進(jìn)行可視化。利用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)（深藍(lán)色表示相似度100%、粉色＞75%、淺藍(lán)色＞50%）。

2.3 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1基因克隆

以岷歸1號(hào)溫室栽培植株功能葉片為材料（T2期，移栽生長(zhǎng)40 d）[21]?？俁NA提取利用Plant RNA Kit R6827試劑盒，其純度和濃度檢測(cè)使用超微量分光光度計(jì)；RNA反轉(zhuǎn)錄使用First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒得到cDNA；利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物（表2）。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%TAE瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；膠回收使用瓊脂糖凝膠純化試劑盒TIANgel Midi Purification Kit試劑盒。基因克隆使用平末端克隆試劑盒pHANDY?-Blunt Cloning Kit試劑盒；引物合成及陽(yáng)性克隆測(cè)序由蘭州天啟基因生物科技有限公司完成。

表2 GA2ox6和GA20ox1 PCR擴(kuò)增和qRT-PCR驗(yàn)證的引物序列

2.4 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1基因表達(dá)分析

樣品取自岷歸1號(hào)兩年生大田EB和Un-EB植株、三年生不同時(shí)期（S1～S4）植株、不同春化期（T1～T3）根莖頂端分生組織[17-19]、以及不同器官（根、莖和葉）。利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)和基因qRT-PCR表達(dá)引物（表2），以作為內(nèi)參基因[24]。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。利用2–??Ct法計(jì)算和基因的相對(duì)表達(dá)水平[25]。

3 結(jié)果與分析

3.1 當(dāng)歸兩年生EB和Un-EB植株中GAs含量的變化

通過(guò)對(duì)兩年生EB和Un-EB植株中16個(gè)GAs進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定（圖2），以及含量變化進(jìn)行分析（圖3），結(jié)果顯示，除GA1、GA4、GA7和GA24外，12個(gè)GAs含量存在顯著差異。EB植株中4個(gè)GAs（GA6、GA9、GA14、GA20）含量顯著高于Un-EB植株，增加1.32（GA7）～22.4（GA14）倍；其他8個(gè)GAs（GA3、GA5、GA8、GA15、GA19、GA44、GA51和GA53）含量顯著降低，降低0.23 （GA44）～0.67倍（GA8）。

圖2 當(dāng)歸EB和Un-EB植株提取液HPLC-MS/MS色譜圖

*表示同一GAs在EB與Un-EB植株之間 P＜0.05水平下達(dá)到顯著性差異

3.2 當(dāng)歸三年生不同生長(zhǎng)期植株中GAs含量的變化

通過(guò)對(duì)三年生不同生長(zhǎng)期（S1、S2、S3和S4）植株中16個(gè)GAs進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定（圖4），以及含量變化進(jìn)行分析（圖5），結(jié)果顯示，16個(gè)GAs含量也存在較大差異，在S1～S4時(shí)期，GA19含量最高（9.34 ng/g），依次為GA6（3.78 ng/g）和GA24（3.45 ng/g）。S4相對(duì)于S1，14個(gè)GAs（GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA8、GA9、GA15、GA19、GA20、GA24、GA44、GA51和GA53）增加1.35（GA4）～7.18（GA9）倍，而GA14和GA7分別下降0.36和0.96倍。除GA3、GA7和GA14外，13個(gè)GAs含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加且在S4時(shí)期達(dá)到最大，而GA3、GA7和GA14分別在S2、S3和S2時(shí)期達(dá)到最大（圖5）。

3.3 參與當(dāng)歸GAs代謝的關(guān)鍵酶基因生物信息學(xué)

3.3.1 當(dāng)歸GAs代謝相關(guān)基因鑒定及理化性質(zhì) 通過(guò)對(duì)當(dāng)歸不同品種葉片和葉柄、種苗春化作用過(guò)程中根莖頂端分生組織的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因直接參與和18個(gè)基因間接參與GAs代謝（表3）。進(jìn)一步對(duì)直接參與GAs代謝基因所編碼的蛋白質(zhì)序列和亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，9個(gè)蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度為189（GA2ox1-2）～552（GA2ox8）、相對(duì)分子質(zhì)量為21 550～63 400、等電點(diǎn)為5.47（GA3ox2）～8.68（GA2ox8），亞細(xì)胞均定位于細(xì)胞質(zhì)（表4）。

圖4 當(dāng)歸三年生不同生長(zhǎng)期植株提取液HPLC-MS/MS色譜圖

*表示同一GAs在S1和S4之間P＜0.05水平下達(dá)到顯著性差異

表3 當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中直接和間接參與GAs代謝的基因

表4 直接參與當(dāng)歸GAs代謝蛋白質(zhì)的特征及亞細(xì)胞定位

3.3.2 直接參與當(dāng)歸GAs代謝蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)對(duì)9個(gè)直接參與GAs代謝基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及3D建模，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成（表5），無(wú)規(guī)則卷曲是構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分，占比30.25%（GA2ox8）～45.56%（GA2ox1-1），其次是α螺旋和延伸鏈，分別占比27.76%（GA2ox7）～41.12%（GA2ox8）和15.20%（GA3ox2）～22.22%（GA2ox1-2）；有些蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似（如GA20ox1和GA20ox3），但有些空間結(jié)構(gòu)差異較大（如GA2ox1-2、GA2ox6和GA20ox1等）（圖6）。

表5 直接參與當(dāng)歸GAs代謝9個(gè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖6 直接參與當(dāng)歸GAs代謝9個(gè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

3.3.3 直接參與當(dāng)歸GAs代謝蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹構(gòu)建 通過(guò)對(duì)9個(gè)直接參與當(dāng)歸GAs代謝蛋白質(zhì)、以及模式植物擬南芥等10個(gè)物種的82個(gè)GAs代謝蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，基于蛋白質(zhì)序列相似性，這91個(gè)蛋白質(zhì)被分成6個(gè)亞族Group I～VI，其中GA2ox6和GA20ox1分別位于GroupI和GroupIII亞族（圖7）。

3.3.4 直接參與當(dāng)歸GAs代謝的蛋白質(zhì)基序 通過(guò)對(duì)以上91個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和基序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這91個(gè)蛋白質(zhì)分為6個(gè)亞族，與系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)系一致（圖7），序列含有6個(gè)保守基序（表6）；直接參與當(dāng)歸GAs代謝的同一亞家族蛋白質(zhì)基序具有高度相似性，其中，GA2ox6亞族均含有Motif 1～Motif 4和Motif 6；GA20ox1亞族均含有Motif 1～Motif 6；而不同亞族蛋白質(zhì)基序存在較大差異，比如，Motif 5只存在于Group III亞族（圖8）。

圖7 當(dāng)歸和擬南芥等11個(gè)物種GAs代謝蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表6 直接參與GAs代謝蛋白質(zhì)6個(gè)保守基序及其序列

3.3.5 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1蛋白質(zhì)多序列比對(duì) 通過(guò)將當(dāng)歸AsGA2ox6和AsGA20ox1與NCBI中擬南芥和黃胡蘿卜等物種中同源性較高的5個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，GA2ox6與同科黃胡蘿卜同源性最高，相似性達(dá)到89.74%（XP_017243791.1），依次為藍(lán)果樹71.55%（KAA8532306.1）、茶樹68.84%（AVZ45857.1）、煙草66.57%（XP_019242512.1）和番茄65.98% （XP_004237179.2）（圖9-A）；GA20ox1也與黃胡蘿卜同源性最高，達(dá)到82.95%（XP_017239190.1），依次為番茄69.13%（NP_001234070.1）、芝麻67.94%（XP_011076268.1）、藍(lán)果樹67.09%（KAA8539854.1）和煙草66.33%（XP_019225201.1）（圖9-B）。

圖8 當(dāng)歸和擬南芥等11個(gè)物種GAs代謝蛋白質(zhì)的保守基序

3.4 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1基因克隆

為了保證全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中當(dāng)歸和基因堿基序列的準(zhǔn)確性，基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中和基因堿基序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以岷歸1號(hào)功能葉片中RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，進(jìn)行和基因克隆。瓊脂糖凝膠電泳顯示，和基因擴(kuò)增片段大小為1000～2000 bp（圖10）；產(chǎn)物回收與堿基測(cè)序顯示，基因克隆長(zhǎng)度為1477 bp（458 bp和777 bp處插入了95 bp和370 bp）；基因克隆長(zhǎng)度為1455 bp（558 bp和880 bp處插入了108 bp和199 bp）；通過(guò)與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的和進(jìn)行序列比對(duì)，除了插入2個(gè)片段外，其他相似度為100%（圖11）。

圖9 當(dāng)歸GA2ox6（A）和GA20ox1（B）蛋白質(zhì)與5個(gè)其他物種蛋白質(zhì)的多序列比對(duì)

圖10 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

3.5 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和基因的生物學(xué)功能，對(duì)當(dāng)歸不同材料中和基因的表達(dá)水平進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)與分析，結(jié)果（圖12）顯示，EB相對(duì)于Un-EB，呈現(xiàn)低表達(dá)，而呈現(xiàn)高表達(dá)；不同生長(zhǎng)期植株中，表達(dá)水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低，而呈現(xiàn)逐漸增加；不同春化期種苗根莖頂端分生組織中，T2相對(duì)T1，表達(dá)水平降低，而T3相對(duì)T1表達(dá)增加，而則相反；不同器官中，和在莖和葉相對(duì)于根均呈現(xiàn)高表達(dá)。

圖11 當(dāng)歸GA2ox6(A)和GA20ox1 (B) 基因克隆與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的序列比對(duì)

圖12 當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1基因在不同材料中的相對(duì)表達(dá)水平

4 討論

目前，EB開花導(dǎo)致根木質(zhì)化不能入藥仍是困擾當(dāng)歸生產(chǎn)、質(zhì)量和效益提升的重大難題[4]。大量研究表明，GA調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程——種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)、花的發(fā)育、果實(shí)的形成和種子的發(fā)育，其含量的變化受到特定環(huán)境因素和生物合成酶基因的影響[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，16個(gè)GAs含量在當(dāng)歸EB相對(duì)于Un-EB植株、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期植株中存在顯著差異；基于當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因直接參與GAs代謝；另外，克隆獲得的關(guān)鍵酶基因和表達(dá)水平與相應(yīng)的GAs代謝水平一致。

大量研究表明，GA最顯著的作用是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂進(jìn)而誘發(fā)植物莖的伸長(zhǎng)[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施GA3可顯著促進(jìn)當(dāng)歸提前抽薹開花[15]；在抽薹分化前期植株中含量較高[16]；在種苗春化作用過(guò)程中顯著升高，而冷凍回避春化作用顯著降低[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，GA3含量在EB植株低于Un-EB植株，生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中S1～S4時(shí)期呈“上升-下降-上升”趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果存在一定差異。可能原因是：S1～S2時(shí)期植株處于生長(zhǎng)旺盛階段，植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)積累有利于GA3的生物合成，進(jìn)而誘發(fā)抽薹，當(dāng)植株開始抽薹，較多的GA3轉(zhuǎn)運(yùn)至莖，促進(jìn)花器官形成和果實(shí)發(fā)育[26]。另外，研究證實(shí)在菠菜中噴施赤霉素抑制劑BX-112，導(dǎo)致了GA1和GA8水平降低從而積累了GA20，抑制菠菜莖的伸長(zhǎng)。這與本研究結(jié)果一致，在當(dāng)歸發(fā)育過(guò)程中GA1、GA4和GA20逐漸升高。較高的GA1通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂來(lái)增加頂端分生組織的生命活力使節(jié)間數(shù)增多，同時(shí)促進(jìn)微管組織和葉片發(fā)育，從而加速植物生長(zhǎng)速率促進(jìn)抽薹[27]。然而，GA4在調(diào)控抽薹開花過(guò)程中，集中在花器官中，調(diào)控雄蕊的發(fā)育等，因此葉片和側(cè)根GA4含量可能低于其它GAs[9]。此外，活性GAs（如GA1、GA4、GA6和GA7）在EB植株中顯著高于Un-EB植株，而非活性GAs相反；在不同生長(zhǎng)期16個(gè)GAs中，除GA3、GA7和GA14外，13個(gè)GAs隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)含量逐漸增加。

為了進(jìn)一步了解GAs參與當(dāng)歸抽薹開花的機(jī)制，本研究對(duì)9個(gè)直接參與GAs代謝基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和關(guān)鍵基因克隆及表達(dá)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥含有16個(gè)GA氧化酶基因（和）[28]；蘋果含有41個(gè)GA氧化酶基因（，和）[29]；葡萄含有24個(gè)GA氧化酶基因（、和）[30]。本研究基于當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)GA氧化酶基因（、、、和-3）。本課題組獲得的9個(gè)GA氧化酶與擬南芥、蘋果和葡萄等[28-30]氧化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致；蘋果、葡萄和黃瓜等[29-31]其他物種亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，本研究中的有9個(gè)GA氧化酶均定位于細(xì)胞質(zhì)。

通過(guò)對(duì)擬南芥、蘋果和葡萄等[28-30]物種研究發(fā)現(xiàn)，GA2ox、GA3ox和GA20ox基因家族根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異分布在不同的亞族中，表明植物GA氧化酶基因進(jìn)化關(guān)系相近的保守結(jié)構(gòu)相似，同一亞族在進(jìn)化上具有一定的保守性，且進(jìn)化關(guān)系越近的亞族，其保守基序的同源性越高。本研究基于系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，GA20ox1和GA20ox3位于GroupⅢ亞族，而GA2ox1-1、GA2ox7和GA3ox2位于GroupⅣ亞族，其中，GA20ox1和GA20ox3含有相同的保守基序（Motif 1～6），而GA2ox1-1、GA2ox7和GA3ox2含有相同的保守基序（Motif 1～3，Motif 6）。同時(shí)，本研究中當(dāng)歸GA2ox6和GA20ox1蛋白質(zhì)序列與同科植物胡蘿卜的相似度最高，親緣關(guān)系最近。另外，基因克隆獲得的和序列與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果存在一定差異，表明本研究所獲得的序列可能尚不完整。

在當(dāng)歸EB相對(duì)Un-EB植株研究中發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量較高，而基因表達(dá)量沒(méi)有顯著變化[21]；本研究發(fā)現(xiàn)，基因在EB植株中低表達(dá)，這與GA8在EB植株中含量低于Un-EB植株的結(jié)果一致；基因在EB植株中高表達(dá)，這與GA1、GA4、GA9和GA20在EB植株中含量低于高于Un-EB植株的結(jié)果一致。在植物不同器官研究中發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜中基因主要在根和葉中表達(dá)[32]，擬南芥中基因在葉中表達(dá)量顯著高于根[33]，枳橙中主要在節(jié)間、葉片和種子中表達(dá)[34]，黃瓜中基因在葉中表達(dá)量顯著高于根和莖[31]，這與本研究中當(dāng)歸和基因表達(dá)量在葉＞莖＞根的結(jié)果一致。同時(shí)，在本研究不同生長(zhǎng)期發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量隨植株生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期延長(zhǎng)和在種苗春化作用中顯著降低，在冷凍回避春化作用種苗中顯著升高，而基因表達(dá)量相反。大量研究表明，GA2ox6通過(guò)催化GA20、GA4和GA1分別形成非活性的GA29、GA34和GA8調(diào)節(jié)植株抽薹開花[32]；因此，本研究不同材料中參與GAs酶基因表達(dá)量的變化，會(huì)直接引起相應(yīng)GAs含量水平的變化，最終呈現(xiàn)出抽薹開花的生理差異。

綜合以上研究表明，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)當(dāng)歸抽薹開花過(guò)程中16個(gè)GAs含量進(jìn)行了測(cè)定、對(duì)篩選的9個(gè)直接參與GAs代謝的酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、并對(duì)關(guān)鍵酶基因（和）進(jìn)行了克隆及表達(dá)驗(yàn)證。但對(duì)關(guān)鍵酶基因（和）片段的完整性、以及其它GAs生物合成相關(guān)基因（如、和）的生物學(xué)特性等還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on gibberellins metabolic level, key enzyme genes clone and expression pattern during bolting and flowering plants in

LIU Di1, CUI Xiu-wen1, HUANG Tian-miao1, LI Mei-ling1, LI Meng-fei1, WEI Jian-he2

1. College of Life Science and Technology/Key Laboratory of Aridland Crop Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To determine the contents of 16 gibberellins (GAs), screen the genes involved in GAs metabolism and analyze their bioinformatics, as well as clone the key genes and validate their expression level, so as to provide theoretical basis for regulating bolting and flowering of.The GAs contents in different materials were determined by HPLC-MS/MS. The genes directly involved in GAs metabolism were screened based on the full-length transcriptomes of, the bioinformatics was analyzed using the online tools, and the expression levels of theandgenes were validated by qRT-PCR.Among of the 16 GAs, the contents of eight GAs were higher in bolted plants than unbolted plants, and the contents of 13 GAs were increased with the extension of plant development. A total of nine genes directly involved in GAs metabolism were identified from, with six subfamily classified, six motifs included, and the sub-cellular located in the cytoplasm. There was a certain difference in the base sequences between the cloned fragment ofandwith the full-length transcriptomes, due to the inserted fragments in the sequence ofand. The expression levels ofgene were down-regulated in the bolted plants compared to unbolted plants, and with the extension of seedlings vernalization and plants development, while up-regulated in the seedlings with frozen-avoided vernalization; but thegene showed opposite results; and the expression levels ofandgenes in leaves and stems were higher than roots.There are nine genes directly involved in GAs metabolism in, and certain differences in physical and chemical properties and structure among the nine members; the expression levels of theandgenes are in accordance with the physiological regulation of bolting and flowering of.

(Oliv.) Diels; gibberellins; gibberellins metabolic gene; bioinformatics; gene clone; bolting and flowering

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0222 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.024

2022-05-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160083）；干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)）基金項(xiàng)目（GSCS-2021-Z03）；道地藥材生態(tài)種植與質(zhì)量保障項(xiàng)目（202103003）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）

劉 迪（1997—），女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，主要從事當(dāng)歸抽薹開花調(diào)控方面研究。E-mail: liudi9728@163.com

通信作者：栗孟飛（1980—），男，河南駐馬店人，博士，教授，主要從事藥用植物學(xué)研究。E-mail: lmf@gsau.edu.cn

魏建和（1970—），男，福建建陽(yáng)人，博士，教授，主要從事藥用植物栽培、分子育種和次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究。E-mail: jhwei@implad.ac.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]