烏拉爾甘草化感自毒活性的研究

趙智龍，馬淼

(新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實驗室，石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

化感作用(Allelopathy)是指植物通過根系分泌[1]、殘體和凋落物的降解[2]、體外揮發(fā)[3]以及雨水淋溶[4]等途徑向外界環(huán)境釋放某些化學(xué)物質(zhì)，從而對其他植物或自身產(chǎn)生直接或間接影響的生態(tài)學(xué)效應(yīng)[5]，此類化學(xué)物質(zhì)被稱為化感物質(zhì)。當(dāng)化感物質(zhì)的供體和受體是同一種植物并且對該植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生抑制作用時，這種現(xiàn)象稱為自毒作用(Autotoxicity)，自毒作用是化感作用的一種特殊形式[6-7]。在同一農(nóng)田中連續(xù)多年栽培同種或同科作物后，會導(dǎo)致作物根系附近的土壤中累積多種自毒物質(zhì)，并形成高濃度的微環(huán)境[8-9]，即使處于正常的栽培管理模式，也會使作物出現(xiàn)長勢變?nèi)酢a(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、病害增加等現(xiàn)象[10]。因此，作物的自毒作用被認(rèn)為是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)連作障礙的重要誘因之一[11-12]。

烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生草本植物，其干燥的根與根狀莖是我國的傳統(tǒng)大宗中藥材[13]，具有消炎[14]、止咳[15]、抗氧化[16]、清除自由基[17]和抑制腫瘤細(xì)胞增殖[18]等多種功效。過去由于過度利用致使野生甘草資源瀕臨枯竭，因此，栽培甘草正在成為該藥材供應(yīng)的主要來源[19]。但是在同一農(nóng)田中連續(xù)種植多年后，甘草種子的萌發(fā)率、幼苗的生長狀態(tài)以及藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)均明顯下降，已經(jīng)成為制約甘草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的限制因素，并且目前對其原因卻知之甚少。植物體的各個器官幾乎都存在化感物質(zhì)，其中以根、莖和葉所含化感物質(zhì)最多[20]。

綜上所述，本文利用烏拉爾甘草根與根狀莖以及莖和葉的水浸提液模擬根系分泌和雨水淋溶物，通過在盆土中添加上述器官的粉末以模擬烏拉爾甘草的殘茬和凋落物，研究其對自身種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在為揭示烏拉爾甘草的化感自毒活性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

烏拉爾甘草的營養(yǎng)器官及種子均來自新疆聯(lián)強(qiáng)公司昌吉農(nóng)場的3年生栽培甘草。隨機(jī)選取5個1 m×1 m的樣方，收獲地上及地下的所有營養(yǎng)器官，并計算每個樣方土壤里根與根狀莖的質(zhì)量，以及每個樣方上莖和葉的質(zhì)量。將其根、莖、葉和根狀莖置于室內(nèi)通風(fēng)條件下陰干，粉碎，過50目篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 水浸提液的制備

分別稱取200 g根、莖、葉和根狀莖的粉末放入玻璃燒杯中，加入2 L蒸餾水，燒杯用保鮮膜封口，防止水分流失，將其置于4 ℃冰箱中24 h，然后過濾得到濃度為0.1 g/mL的各器官水浸提液。取部分浸提液，用蒸餾水稀釋到0.025 g/mL的濃度。

1.2.2 種子萌發(fā)試驗

挑選健康飽滿、大小一致的烏拉爾甘草種子，用濃度為98%的H2SO4溶液浸泡30 min，自來水沖洗干凈，在直徑為9 cm培養(yǎng)皿中墊入2層濾紙，分別加入2 mL 0.025、0.1 g/mL濃度的根、莖、葉和根狀莖水浸提液，以添加2 mL蒸餾水作為對照，將30粒種子均勻擺放在濾紙上，蓋上玻璃蓋，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱(光暗周期為12/12 h，光照強(qiáng)度為4 000 lx)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每天及時補(bǔ)充水浸提液和蒸餾水，使濾紙保持濕潤。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。以胚根露出種皮至少1 mm作為種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，每24 h觀察一次并記錄萌發(fā)種子的個數(shù)，持續(xù)記錄7 d，計算種子萌發(fā)指數(shù)、累積萌發(fā)率和化感效應(yīng)指數(shù)，計算公式分別如下：

萌發(fā)指數(shù)=∑(Gt/Dt),Gt為t天種子萌發(fā)數(shù)，Dt為萌發(fā)天數(shù)。

萌發(fā)率=(種子數(shù)萌發(fā)/供試種子總數(shù))×100%。

化感效應(yīng)指數(shù)RI=1-C/T(T≥C)，或者RI=T/C-1(T

1.2.3 盆栽試驗

2019年5月1日在直徑20 cm、高25 cm的花盆中添加河沙作為培養(yǎng)基質(zhì)，按照農(nóng)田中每平方米土壤中所統(tǒng)計的殘茬與凋落物的質(zhì)量，在盆土中分別添加66、61.2、16、63.1 g的根、莖、葉和根狀莖粉末充分混合，以不添加甘草器官粉末的盆土作為對照，每個處理設(shè)置10個重復(fù)，每個花盆中均勻播種10粒烏拉爾甘草種子，播種深度為1 cm，并一次性施加尿素1 g、過磷酸鈣1.6 g和硫酸鉀0.5 g作為底肥。盆栽試驗采用完全隨機(jī)排列方式，將所有花盆隨機(jī)擺放在石河子大學(xué)校園的開闊地，每周隨機(jī)調(diào)換一次花盆的位置，以確保其所接受的光照條件一致。利用稱重法每天補(bǔ)充水分，使土壤相對濕度維持在70%，待幼苗出土后，拔除多余的幼苗，每盆中只保留3株長勢一致的個體，培養(yǎng)90天后收獲。

(1)根系形態(tài)學(xué)參數(shù)與根瘤數(shù)量的測定。將植株地下部分小心清洗，清除表面浮土，利用Expression 1100 XL(Epson company，Japan)掃描儀對幼苗根系進(jìn)行掃描，采用根系分析系統(tǒng)軟件(WinRHIZO Pro 2013)測量總根長、根總表面積和根總體積，并統(tǒng)計每株個體的根瘤數(shù)量。

(2)地上與地下生物量的測定。將植株的地上部分與地下部分置于75 ℃的烘箱中烘干至恒重，用分析天平稱量其干重。

(3)地下器官甘草酸含量的測定。參照文獻(xiàn)[22]中方法用Agilent 1100液相色譜儀(Agilent 1100泵系統(tǒng)，二極管陣列檢測器DAD)檢測甘草酸的含量。分離柱采用ODS-C18柱(250 mm×2.1 mm，5 μm)，檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流動相為甲醇∶水∶36%冰乙酸=71∶28∶1，流速1 mL/min。

精確稱取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品3 mg，加入3 mL甲醇充分溶解，作為標(biāo)準(zhǔn)品原液，分別取0、25、50、100、200 μL原液，用流動相定容至1 mL，于254 nm波長下測定出峰時間和峰面積大小，每個樣品測定3次求平均值。根據(jù)峰面積獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=4.745 8X-8.002，R2=0.999 1。

將烘干的根及根狀莖粉碎后過50目篩，精確稱取0.05 g粉末，加入3 mL流動相，于室溫下超聲提取1 h，取上清液，并用0.45 μm微膜過濾。用HPLC法測定其中甘草酸的峰面積，每個樣品測定3次，求平均值，計算甘草酸含量。

(4)總黃酮含量的測定。參照文獻(xiàn)[23]中方法精確稱取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品3 mg，加入3 mL甲醇充分溶解，作為標(biāo)準(zhǔn)品原液，然后分別取0、50、100、200、400 μL甘草苷原液，加入250 μL 10%氫氧化鉀顯色5 min，用甲醇定容至5 mL，搖勻，用紫外可見分光光度儀(島津UV-2600，日本)于334 nm波長下測定吸光度，每個樣品測定3次，計算平均值。以相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.057 4X+0.046 9，R2=0.999 6。

精確稱取根及根狀莖粉末0.5 g于試管中，加入甲醇5 mL，于室溫下超聲提取70 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液100 μL，加入1 mL 10%氫氧化鉀顯色劑，顯色5 min，然后用甲醇定容至5 mL，搖勻，用紫外可見分光光度儀于334 nm波長處測定吸光度。每個處理重復(fù)測定3次，計算平均值。

1.3 統(tǒng)計方法

選用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，利用Duncan多重比較檢測不同處理間的差異顯著性，并利用Origin9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同器官水浸提液對烏拉爾甘草種子萌發(fā)的影響

不同濃度的各器官水浸提液對烏拉爾甘草種子萌發(fā)指數(shù)影響的結(jié)果(圖1)顯示：對照組的萌發(fā)指數(shù)最高，所有器官的水浸提液均顯著地降低了甘草種子的萌發(fā)指數(shù)，并且表現(xiàn)出了顯著的濃度依賴效應(yīng)，即隨著水浸提液濃度的升高，水浸提液對甘草種子萌發(fā)指數(shù)的抑制效應(yīng)就愈加強(qiáng)烈。其中，根、莖、葉和根狀莖低濃度水浸提液(0.025 g/mL)處理組的種子萌發(fā)指數(shù)分別為對照的82.7%、77.4%、76.5%和77.3%(P=0.023、P=0.006、P=0.005、P=0.006)，高濃度水浸提液(0.1 g/mL)處理組的種子萌發(fā)指數(shù)分別為對照的74%、59.5%、61.4%和72.7%(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 烏拉爾甘草各器官水浸提液對其種子的萌發(fā)指數(shù)的影響

不同濃度的各器官水浸提液對烏拉爾甘草種子累積萌發(fā)率影響的結(jié)果(圖2)顯示可見：對照組種子的萌發(fā)速度最快，其第2天的萌發(fā)率就達(dá)到了35%，并于第4天達(dá)到了最終萌發(fā)率。而各器官水浸提液處理組中均存在不同程度的萌發(fā)延遲現(xiàn)象，其中在莖的高濃度水浸提液(0.1 g/mL)的處理下，甘草種子萌發(fā)的遲滯現(xiàn)象最為明顯，在處理后的第3天才開始萌發(fā)。莖、葉和根狀莖的高濃度水浸提液(0.1 g/mL)處理組的種子最終萌發(fā)率均顯著低于對照組，較對照組分別降低了11.1%、17.3%和11.1%(P=0.019、P=0.003、P=0.019)，根和根狀莖低濃度水浸提液(0.025 g/mL)處理組的種子最終萌發(fā)率較對照組分別降低了9.9%和12.3%(P=0.022、P=0.015)。其中莖和葉水浸提液處理組中種子的最終萌發(fā)率均表現(xiàn)出顯著的濃度依賴效應(yīng)，即種子的最終萌發(fā)率隨著水浸提液濃度的升高而顯著下降。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2 烏拉爾甘草各器官水浸提液對其種子累積萌發(fā)率的影響

不同濃度的各器官水浸提液對烏拉爾甘草種子萌發(fā)的化感效應(yīng)指數(shù)影響的結(jié)果(圖3)顯示：各器官的水浸提液對烏拉爾甘草種子萌發(fā)的化感作用在處理2天后均達(dá)到最強(qiáng)抑制效應(yīng)，且根、莖、葉和根狀莖的高濃度水浸提液(0.1 g/mL)對甘草種子萌發(fā)的化感抑制效應(yīng)顯著高于低濃度水浸提液(0.025 g/mL)(P<0.001、P=0.036、P=0.046、P=0.046)。隨著時間的延續(xù)各處理的化感抑制作用均呈逐漸減弱趨勢，在第7天時各組處理對烏拉爾甘草種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)已經(jīng)完全消失。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 烏拉爾甘草各器官水浸提液對其種子的化感效應(yīng)指數(shù)隨時間的變化

2.2 土壤中不同器官粉末的添加對烏拉爾甘草幼苗生長和藥用成分含量的影響

土壤中不同器官粉末的添加對烏拉爾甘草幼苗生長影響的結(jié)果(表1)表明：添加根與根狀莖粉末的處理在所有幼苗生長指標(biāo)上均顯著低于對照組，上述兩種處理與對照組相比，地上生物量分別降低了74.9%和54.6%(P<0.001、P<0.001)，根干重分別降低了88.5%和83.8%(P<0.001、P<0.001)，根瘤數(shù)量分別降低了85.1%和42.1%(P<0.001、P<0.001)。添加根粉末處理的甘草幼苗的總根長、根總體積和根總表面積分別僅為對照組的15.6%、20.3%和19.7%(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，添加根狀莖粉末處理的甘草幼苗的總根長、根總體積和根總表面積分別僅為對照組的39.2%、31.2%和30.3%(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，添加莖粉末處理的甘草幼苗的根總體積和根總表面積顯著低于對照組，分別降低了33.2%和17%(P<0.001、P=0.001)，而添加葉粉末處理的甘草幼苗僅在總根長和根瘤數(shù)量指標(biāo)上顯著低于對照組，分別降低了29.1%和34.5%(P=0.001、P<0.001)，說明添加根、莖和根狀莖粉末的處理完全抑制了幼苗根狀莖的發(fā)育。因此，添加根與根狀莖粉末的處理對烏拉爾甘草幼苗生長的抑制效應(yīng)最為強(qiáng)烈，且其余各處理對甘草幼苗生長指標(biāo)的抑制強(qiáng)度各不相同。

表1 土壤中不同器官粉末的添加對烏拉爾甘草幼苗生長的影響

土壤中不同器官粉末的添加對幼苗根系甘草酸和總黃酮含量影響的結(jié)果(圖4)表明：各處理均在不同程度上顯著抑制了烏拉爾甘草幼苗地下器官甘草酸和總黃酮含量的累積。與對照組相比，添加根、莖、葉和根狀莖粉末處理的幼苗地下器官甘草酸含量分別降低了70.9%、21.5%、49.3%和62.5%(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)，總黃酮含量分別降低了46.4%、34.9%、30.7%和35.1%(P<0.001、P<0.001、P=0.001、P<0.001)?？梢姡寥乐刑砑恿烁透鶢钋o粉末的處理對甘草酸及黃酮類物質(zhì)的形成與累積的抑制效應(yīng)最強(qiáng)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4 土壤中不同器官粉末的添加對幼苗根系甘草酸和總黃酮含量的影響

3 討論

3.1 各器官水浸提液對甘草種子萌發(fā)過程的化感自毒效應(yīng)

種子萌發(fā)對植物后期生長繁育極為重要，種子成功萌發(fā)是種群建立的前提和基礎(chǔ)，因此，揭示連茬后甘草地中甘草種子萌發(fā)受抑制的原因具有十分重要的意義。本研究表明，經(jīng)過不同器官的水浸提液處理的甘草種子萌發(fā)指數(shù)均顯著地低于對照組，并表現(xiàn)出明顯的濃度依賴效應(yīng)(圖1)；累積萌發(fā)率和化感效應(yīng)指數(shù)RI統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組相比，所有處理組中甘草種子的萌發(fā)時間都存在遲滯現(xiàn)象，并且延遲萌發(fā)現(xiàn)象和化感抑制效應(yīng)均會隨著水浸提液濃度的提高而更為明顯(圖2、圖3)。這與前人的研究結(jié)果基本一致，如楊廣超等研究表明，西瓜的根、莖和葉的水浸提液處理顯著降低了其種子的發(fā)芽率、根長、胚軸長和根系活力，并且具有明顯的濃度效應(yīng)，抑制作用的強(qiáng)度與水浸提液的濃度呈正比[24]；黃閩敏等研究認(rèn)為天山云杉的水浸提液對自身的種子萌發(fā)具有濃度依賴性的自毒效應(yīng)，即隨著水浸提液濃度的升高，對其種子萌發(fā)的抑制效果隨之增強(qiáng)，而在較低的水浸提液濃度時抑制效應(yīng)相對較弱[25]；李金鑫等研究發(fā)現(xiàn)隨著巴茅草水浸提液濃度的升高，白菜、生菜和水稻種子的萌發(fā)速度隨之減慢[26]。本研究表明甘草種子受自毒作用影響的程度因水浸提液的濃度而異，水浸提液濃度越高，化感抑制效應(yīng)越強(qiáng)，并且烏拉爾甘草的自毒作用在種子萌發(fā)階段主要體現(xiàn)在推遲種子的萌發(fā)時間。發(fā)芽時間延長、出苗延后將嚴(yán)重影響出土后的幼苗對地上和地下資源的競爭能力[27]；另外，春天播種時土壤濕度高、溫度低、種子萌發(fā)時間的推遲很容易造成種子霉?fàn)€，勢必會造成種子活力的下降和病害的發(fā)生[28]。

3.2 添加各器官粉末對甘草幼苗生長的化感自毒效應(yīng)

不同植物及其不同發(fā)育時期對化感作用的敏感性不同，通常認(rèn)為幼苗生長期比種子萌發(fā)期更敏感[29]。本研究發(fā)現(xiàn)添加根或根狀莖粉末的處理對幼苗的自毒作用最為強(qiáng)烈，強(qiáng)烈抑制了營養(yǎng)器官生物量的累積、根系發(fā)育、根瘤數(shù)量以及藥用成分的累積(表1、圖4)，其中添加根、莖和根狀莖粉末的處理完全抑制了幼苗根狀莖的發(fā)育，而根狀莖具有克隆繁殖的能力，根狀莖的生長受到抑制無疑會極大的削弱了其自身的無性繁殖能力，但添加莖粉末的處理在地上生物量、根干重、總根長和根瘤數(shù)量的指標(biāo)上相比于對照組無顯著差異，添加葉粉末處理的地下生物量、根總體積和根總表面積與對照無顯著差異，這說明同一植株不同器官之間的化感作用存在一定差異，這可能與不同器官中次生代謝產(chǎn)物的種類和含量存在差異有關(guān)。周凱等研究表明菊花不同器官所表現(xiàn)出的化感作用強(qiáng)度各不相同，其中莖和葉的水浸提液強(qiáng)烈的抑制了菊花的幼苗生長，而根的水浸提液對幼苗生長的影響相對較小[30]；鮑紅春等研究了沙芥不同部位的水浸提液對白菜幼苗的化感作用，其中沙芥葉片的化感效應(yīng)最強(qiáng)而沙芥枝條對白菜幼苗則有輕微的促進(jìn)效應(yīng)[31]。

由此可見，不同種類植物或者同一植物不同器官的水浸液對其幼苗生長的化感作用的強(qiáng)度效應(yīng)是不同的，并且可以確定農(nóng)田中甘草種植達(dá)到一定年限后土壤中所累積的化感物質(zhì)確實會對自身的種子和幼苗產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

4 結(jié)論

種子萌發(fā)實驗中，所有器官的水浸提液均致使甘草種子的萌發(fā)指數(shù)和最終萌發(fā)率降低，并且隨著浸提液濃度的提高，種子延遲萌發(fā)的現(xiàn)象越明顯。盆栽實驗中，各器官粉末的添加均抑制了甘草幼苗的生長和藥用成分的累積，其中以添加根和根狀莖粉末的處理抑制效應(yīng)最強(qiáng)烈。因此，每年入冬之前應(yīng)及時收獲烏拉爾甘草正枯死的莖和葉，并及時運(yùn)走以防其掉落到農(nóng)田中；在采挖根及根狀莖時務(wù)必要收獲徹底，以免殘茬遺留在土壤中而對下一輪的甘草種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生化感自毒效應(yīng)，并在甘草播種前增加一次灌溉，使得土壤中的自毒物質(zhì)能夠隨水下滲到深層，從而減輕其對甘草種子和幼苗的抑制效應(yīng)。