MSMEG_0372基因敲除、回補及過表達恥垢分枝桿菌的構建與鑒定

劉儀，牛宏紅，楊賽麗，曹旭東，袁俐

(石河子大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室，新疆 石河子 832000)

結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)引起的嚴重危害人類健康的慢性傳染病。根據世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)的報告，2020年全球新發(fā)TB患者987萬，其中我國新發(fā)TB病例為84.2萬，在30個TB高負擔國家中排第2位，僅次于印度(259萬)[1]。而耐藥TB一直是TB臨床診斷和治療的重點和難點[2]。

M.tuberculosis細胞壁中的脂質成分可占細胞壁干重的60%以上，其中分枝菌酸與M.tuberculosis的存活、致病性、毒力、免疫逃避和生物膜形成密切相關，在抗TB研究中有著極其重要的地位[3]。M.tuberculosis的脂肪酸合成 (fatty acid synthesis, FAS) 途徑有兩種形式：Ⅰ 型脂肪酸合成 (FAS-Ⅰ)途徑和 Ⅱ 型脂肪酸合成(FAS-Ⅱ)途徑。FAS-Ⅰ是一個多功能且高效的催化酶，可以完成脂肪酸碳鏈延伸的所有步驟，而FAS-Ⅱ 主要由FabG1 (MabA，Rv1483), HadAB/HadBC (Rv0635-0637)、InhA (Rv1484) 和KasA/KasB (Rv2245/Rv2246)4個酶組成，他們在碳鏈延伸的過程中發(fā)揮著不同的催化作用，也是抗結核藥物常見的靶標[3]。FabG4(Rv0242c)是FabG1的同源蛋白蛋白之一，在所有分枝桿菌中保守[4]，其功能可能與FabG1相似[4]。FabG4與FabG1的輔酶分別是NADH和NADPH，而NADH相比NADPH是一種低能量分子[4]。FabG4對在羅辛甘油基本培養(yǎng)基(Roisin’s glycerol minimal media)上的分枝桿菌的存活至關重要[4]。FabG4在亞抑菌濃度鏈霉素脅迫下表達增高[4]，也在M.tuberculosis的氣-液界面的生物膜中特異表達[4]。所以，人們推測FabG4在營養(yǎng)受限或抗生素壓力下會參與一些與膜代謝相關的低能耗途徑[4]。同時，F(xiàn)abG4具有抗原特性[4]，對MHC-I和MHC-II分子具有高親和力[5]，有望成為分枝桿菌生物膜的特異標記物[4]。

生物膜由細菌及其分泌的細胞外聚合物組成。生物膜形成可以導致M.tuberculosis表型耐藥[6]，所以深入研究FabG4的作用對于耐藥TB的診斷和治療具有重要的意義。非致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis)是一種常見的能夠替代M.tuberculosis的模式菌[7]。M.tuberculosisRv0242c在M.smegmatis中的直系同源基因是MSMEG_0372，二者具有78.9%的基因同源性。目前尚無有關MSMEG_0372基因功能的研究報道。為了研究該基因的功能，我們構建了MSMEG_0372基因敲除、回補及過表達M.smegmatis。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與引物

野生型M.smegmatismc2155，大腸桿菌(E.coli) DH5α和HB101，及pMV361，p0004s和phAE159質粒均購買自上海晶諾生物科技有限公司。引物見表1，表中加粗、斜體并下劃線的序列為限制性內切酶Van91I的酶切位點。

表1 引物

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司，氯化鈉和甘油購自上海生工生物工程股份有限公司，Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10和ADC購自美國BD公司，潮霉素B和吐溫80購自美國Sigma公司，高純度低電滲瓊脂糖購自北京擎科生物科技有限公司，Trans2K Plus II DNA Marker和Trans15K DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司，F(xiàn)ast Digest Van91I、限制性內切酶PacI、Fast DigestHind III、Fast DigestEcoRI、T4 DNA連接酶和Phusion High Fidelity DNA Polymerase購自美國賽默飛世爾科技公司，氨芐青霉素鈉和氯霉素購自美國Amresco，硫酸卡那霉素購自青島MDBIO，包裝試劑盒購自美國EPICENTRE Biotechnologies，質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，膠回收試劑盒和細菌基因組提取試劑盒購自美國Omega公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

按說明書配置7H9液體培養(yǎng)基、7H10平板、LB液體和固體培養(yǎng)基。其中，7H9液體培養(yǎng)基、7H10平板用于M.smegmatis的培養(yǎng)，LB液體和固體培養(yǎng)基用于E.coli的培養(yǎng)。頂層瓊脂(Top Agar)：Middlebrook 7H9 粉末0.47 g、瓊脂粉0.75 g，加雙蒸水補充至100 mL，121 ℃高溫滅菌15 min。MP緩沖液：50 mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1MgSO4、2 mmol·L-1CaCl2，用稀HCl調至pH 7.5或7.8，用0.22 μm濾菌器除菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器

生物安全柜(BSC-1304ⅡA2)購于蘇州安泰空氣技術有限公司，恒溫培養(yǎng)箱(GSP-70)購于天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司，凝膠成像儀(WD-9413B)和電泳儀(DYY-6C)購于北京六一生物科技有限公司，電子天平(PL1502E)和酸度計(FE28)購于瑞士梅特勒-托利多公司，PCR 儀(S1000)和電穿孔儀(Gene Pulser MXcell)購于美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 構建p0004s-AES質粒及鑒定

根據MSMEG_0372基因及其上下游的DNA序列，設計該基因的左臂引物(LFP/LRP)和右臂引物(RFP/RRP)，左、右臂是等位基因同源重組的底物(allele exchange substrates，AES)(圖1)。以M.smegmatis的基因組DNA為模板(2 μL)，分別以LFP/LRP引物對和RFP/RRP引物對為引物(F和R各2.5 μL)，加入高保真聚合酶Phusion High Fidelity DNA Polymerase(0.5 μL)，5×Phusion HF Buffer(10 μL)，DMSO(1.5 μL)，10 mmol·L-1dNTP(1 μL)，補充無核酸酶水制備50 μL反應體系。PCR條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行鑒定。用限制性內切酶 Van91I酶切MSMEG_0372基因的左、右臂(AES)并用膠回收試劑盒回收酶切產物。用天根質粒提取試劑盒提取p0004s質粒，用限制性內切酶 Van91I對其酶切并回收其中的兩個大片段(約3.6k bp和1.6k bp)產物。將左、右臂(AES)及p0004s質粒的兩個大片段用T4 DNA 連接酶連接起來，構建p0004s-AES質粒，轉化其到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，在含75 μg·mL-1潮霉素B的LB平板上篩選陽性菌落。挑取陽性菌落，搖菌，收集菌體，提取p0004s-AES質粒并通過DNA測序鑒定。

圖1 MSMEG_0372基因敲除菌株引物示意圖

1.2.2 構建phAE159-AES噬菌粒

用Omega 質粒提取試劑盒提取phAE159質粒以及p0004s-AES質粒，分別用PacI酶切并回收產物。將回收片段用T4 DNA 連接酶連接起來，用包裝試劑盒輔助轉化到E.coliHB101感受態(tài)細胞中，并在含75 μg·mL-1潮霉素B的LB平板上篩選陽性菌落。挑取陽性菌落，搖菌，收集菌體，提取phAE159-AES噬菌粒。

1.2.3 制備M.smegmatis感受態(tài)細胞

挑取新鮮的M.smegmatis單克隆菌落接種于5 mL 7H9液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600約0.6)。以1∶100的比例將該菌液接種于100 mL 7H9培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6。將菌液冰浴1 h，然后于4 ℃，5 000 r·min-1離心10 min。收集菌體，用預先冰浴的10%無菌甘油將菌體洗滌2次，最后用10 mL預冷的10%的甘油重懸，每管200 μL分裝并凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 制備高滴度重組噬菌體

將phAE159-AES噬菌粒與M.smegmatis感受態(tài)細胞混勻，在BIO-RAD電轉儀上用2 mm電轉杯電擊轉化(電擊參數(shù)：電壓2.5 kV，電阻1 000 Ω，電容25 μF)。加入7H9培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將此液體與頂層瓊脂混勻并在7H10平板上鋪板，30 ℃培養(yǎng)3 d，篩選噬菌體空斑。挑取平板上含有噬菌體的空斑到MP buffer中，4 ℃孵育過夜。將此含有噬菌體的液體與適量新鮮培養(yǎng)的M.smegmatismc2155混合，然后與適量頂層瓊脂混勻，鋪板，30 ℃培養(yǎng)3 d。將MP buffer加到含有噬菌體空斑的平板上，置于4 ℃過夜。用注射器收集平板上的液體，并用0.22 μm無菌濾菌器過濾除菌，獲取高滴度的噬菌體，放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5MSMEG_0372基因敲除菌株的構建及鑒定

將高滴度的噬菌體與預先用MP buffer洗滌的對數(shù)期野生型M.smegmatis混勻，37 ℃孵育過夜。離心棄上清，補加適量7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃孵育過夜。離心后收集細菌，并在含75 μg·mL-1潮霉素B的7H10平板上37 ℃培養(yǎng)3 d，篩選陽性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體，提取細菌基因組DNA并用PCR鑒定。MSMEG_0372基因敲除菌株的驗證引物見圖1，左臂驗證引物對的正向引物(LYZFP)位于在LFP引物匹配序列的上游，反向引物(LYZRP)位于sacB基因上；右臂驗證引物對的正向引物(RYZFP)位于hyg基因上，反向引物(RYZRP)位于RRP引物匹配序列的下游。

1.2.6 構建pMV361-MSMEG_0372質粒及鑒定

以M.smegmatis的基因組DNA為模板(2 μL)，以MSMEG_0372FP/MSMEG_0372RP為引物(F和R各0.5 μL)，加入2×Taq Master mix(10 μL)，補充無核酸酶水制備20 μL反應體系。PCR條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 105 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行鑒定，回收MSMEG_0372基因片段。用限制性內切酶EcoRI和Hind III酶切MSMEG_0372基因片段和pMV361質粒，再用T4 DNA 連接酶連接起來，轉化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，并在含25 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上篩選陽性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體，提取質粒并通過DNA測序鑒定。MSMEG_0372基因片段被插入到pMV361 載體的多克隆位點上，pMV361-MSMEG_0372質粒的驗證引物(JDFP/JDRP)位于該位點的上下游 100～200 bp處。

1.2.7MSMEG_0372基因回補菌株的構建與鑒定

制備MSMEG_0372基因敲除菌株感受態(tài)細胞(同野生型M.smegmatis感受態(tài)細胞的制備)。取適量pMV361-MSMEG_0372質粒電轉化到MSMEG_0372基因敲除菌株感受態(tài)細胞中，并在含25 μg·mL-1卡那霉素和75 μg·mL-1潮霉素B的7H10平板篩選陽性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體并煮沸裂解。以裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進行PCR鑒定。

1.2.8MSMEG_0372基因過表達菌株的構建與鑒定

取適量pMV361-MSMEG_0372質粒電轉化到野生型M.smegmatis感受態(tài)細胞中，并在含25 μg·mL-1卡那霉素的 7H10平板上篩選陽性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體并煮沸裂解。以裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進行PCR鑒定。

2 結果

2.1 成功構建p0004s-AES質粒

MSMEG_0372基因左、右臂擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳顯示：左臂約為764 bp和右臂約為709 bp，與預期DNA片段大小一致(圖2)。因為p0004s質粒含有4個限制性內切酶 Van91I酶切位點，酶切后產生了4個片段，回收其中的3.6 kbp和1.6 kbp片段。連接左、右臂(AES)以及p0004s質粒的兩個大片段，構建的p0004s-AES質粒經測序顯示：結果與預期一致，無突變。

Lane 1：左臂; Lane 2：右臂；Lane M：DNA marker。圖2 MSMEG_0372基因的左臂和右臂(AES)

2.2 M. smegmatis MSMEG_0372基因敲除菌株構建與鑒定

連接p0004s-AES和phAE159質粒酶切產物構建了phAE159-AES噬菌粒。將此噬菌粒轉化到M.smegmatis感受態(tài)細胞中，篩選得到噬菌體空斑(含重組噬菌體)。用重組噬菌體侵染野生型M.smegmatis，得到高滴度的重組噬菌體。將高滴度的噬菌體與野生型M.smegmatis混合孵育，在37 ℃培養(yǎng)時，其自身DNA(phAE159-AES)與野生型M.smegmatis基因組DNA在AES處發(fā)生等位基因同源重組，完成MSMEG_0372基因的敲除。

2.2.1 “兩片段法”PCR鑒定MSMEG_0372基因敲除菌株

“兩片段法”PCR：分別使用左臂驗證引物對(LYZFP/LYZRP)和右臂驗證引物對(RYZFP/RYZRP)進行PCR。當以MSMEG_0372基因敲除菌株基因組DNA為模板時，能夠擴增出約1 187 bp和1 128 bp大小的DNA片段，而當以野生型M.smegmatis基因組DNA為模板時則沒有擴增產物。結果符合預期(圖3)。

Lane 1：引物為LYZFP/LYZRP，模板為野生型M. smegmatis基因組DNA；Lane 2：引物為LYZFP/LYZRP，模板為MSMEG_0372 基因敲除菌株基因組DNA；Lane3: 引物為RYZFP/RYZRP，模板為野生型M. smegmatis基因組DNA；Lane 4：引物為RYZFP/RYZRP，模板為MSMEG_0372 基因敲除菌株基因組DNA；Lane M：DNA Marker。圖3 “兩片段法”PCR 鑒定 MSMEG_0372 基因敲除菌株

2.2.2 “全長法”PCR鑒定MSMEG_0372基因敲除菌株

“全長法”PCR：組合使用左臂驗證正向引物和右臂驗證反向引物(LYZFP/RYZRP)進行PCR。當以MSMEG_0372基因敲除菌株基因組DNA為模板時，能夠擴增出約5 616 bp大小的DNA片段，而當以野生型M.smegmatis基因組DNA為模板時，能夠擴增得到約2 772 bp大小的DNA片段。結果符合預期(圖4)。兩種PCR的鑒定結果表明：MSMEG_0372基因敲除菌株 (mc2155 ΔMSMEG_0372) 構建成功。

Lane 1：引物為LYZFP/RYZRP，模板為野生型M. smegmatis基因組DNA；Lane2-3：引物為LYZFP/RYZRP，模板為MSMEG_0372基因敲除菌株基因組DNA；Lane M：DNA Marker。圖4 “全長法”PCR 鑒定 MSMEG_0372 基因敲除菌株

2.3 MSMEG_0372基因回補菌株的構建與鑒定結果

將pMV361-MSMEG_0372質粒導入MSMEG_0372基因敲除菌株，得到MSMEG_0372基因回補菌株的陽性菌落。以細菌裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進行PCR，電泳結果顯示：片段大小約1 651 bp，符合預期，MSMEG_0372基因回補菌株(mc2155 ΔMSMEG_0372:pMV361-MSMEG_0372)構建成功(圖5)。

Lane1：引物為JDFP/JDRP，模板為野生型M. smegmatis裂解液；Lane 2-4：引物為JDFP/JDRP，模板為MSMEG_0372 基因回補菌株裂解液；Lane M：DNA Marker。圖5 PCR 鑒定 MSMEG_0372 基因回補表達菌株

2.4 M. smegmatis MSMEG_0372基因過表達菌株的鑒定結果

M.smegmatisMSMEG_0372基因過表達菌株的鑒定結果見圖6。

Lane 1：引物為JDFP/JDRP，模板為野生型M. smegmatis裂解液；Lane 2-3：引物為JDFP/JDRP，模板為MSMEG_0372 基因過表達菌株裂解液；Lane M：DNA Marker圖6 PCR 鑒定 MSMEG_0372 基因過表達菌株

將pMV361-MSMEG_0372質粒導入野生型M.smegmatis，得到MSMEG_0372基因過表達菌株的陽性菌落。以細菌裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進行PCR，電泳結果顯示：片段大小約1 651 bp，符合預期，MSMEG_0372基因過表達菌株(mc2155:pMV361-MSMEG_0372)構建成功(圖6)。

3 討論

近年來，耐藥TB已經成為TB防控領域的一大挑戰(zhàn)[8]。隨著M.tuberculosis基因組測序的完成，人們開始更深入地研究基因的功能[9]，從而篩選靶點蛋白并研發(fā)抗結核新藥[10]。通過構建基因敲除、回補與過表達菌株，比較分析菌株間的差異，我們可以精確地研究目的基因的功能。M.smegmatis是一種從梅毒患者的硬下疳中分離得到的腐生菌，生長迅速且為非致病菌，在生物安全一級標準(Biosafety Level 1，BSL-1)的實驗室即可操作。同時，M.smegmatis與M.tuberculosis細胞結構相似，同源性高，是一種理想的M.tuberculosis模式菌[11]。

與其他細菌相比，分枝桿菌細胞壁厚，脂質含量高，生長緩慢，且基因組同源重組率低，這使得分枝桿菌基因敲除菌株的構建仍然是細菌遺傳操作中的一大難點[12]。目前，M.tuberculosis基因敲除的方法主要有：基于噬菌體的特異性轉導法、線性DNA片段法、反選擇標記法、成簇規(guī)律性間隔短回文重復(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)法以及 Bxb1整合酶靶向寡核苷酸介導的基因重組(oligonucleotide-mediated recombineering followed by Bxb1 integrase targeting, ORBIT)[13]。特異性轉導法轉化率和敲除效率都很高。線性DNA片段基因敲除法提高了重組率，但錯配率升高[13]。反選擇標記基因敲除法依賴于特定基因，失活率高[13]。CRISPR/Cas是細菌免疫系統(tǒng)的重要成分[14]，能夠精確識別及剪切特異性DNA序列[15]。CRISPR基因敲除法操作簡單，突變率高，特別適于探索功能未知的基因[13]。ORBIT法則結合了Che9-RecT和 Bxb1噬菌體整合酶系統(tǒng)，可以同時創(chuàng)建缺失、插入或融合的文庫，應用前景廣闊[13]。

在本實驗中，我們采用特異性噬菌體轉導法構建了MSMEG_0372基因敲除菌株。我們構建了由分枝桿菌噬菌體DNA(phAE159)和MSMEG_0372基因的左右臂(含hyg基因盒)組成的噬菌粒—phAE159-AES。這種噬菌粒在分枝桿菌中以噬菌體的方式進行復制，而在E.coli中則以質粒的方式進行復制，當其在分枝桿菌和E.coli進行穿梭時可以促進其攜帶的DNA發(fā)生轉移[13]。phAE159是一種溫敏型噬菌體，在30 ℃ 裂解生長，在37 ℃ 溶原生長[16]。所以，在30 ℃ 培養(yǎng)phAE159-AES重組噬菌體時，其可以在M.smegmatis中擴增釋放，而在37 ℃培養(yǎng)時，其可以將重組噬菌體的DNA(噬菌粒phAE159-AES)整合到M.smegmatis基因組DNA中，噬菌粒的AES (MSMEG_0372基因左、右 臂)與野生型M.smegmatis基因組DNA中的等位基因發(fā)生同源重組，位于AES中間的MSMEG_0372基因也被重組噬菌粒上含hyg基因盒的DNA片段所替換，從而完成基因敲除。經過潮霉素B抗性平板的篩選，得到MSMEG_0372基因敲除菌株的陽性菌落。通過上、下游驗證引物對的不同組合，我們用“兩片段法”和“全長法”PCR，更加全面、準確地鑒定了該菌株。與另一常用噬菌體phAE87相比，phAE159容量更大，克隆能力更強，DNA的傳遞效率也更高[17]。同時，由于本實驗主要在E.coli和快速生長分枝桿菌M.smegmatis中進行，所以本實驗還具有周期短的特點。特異性轉導法廣泛適用于各種分枝桿菌[13]，其不足之處在于噬菌粒的構建相對復雜[17]。

在本實驗中，我們將pMV361-MSMEG_0372質粒分別導入MSMEG_0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis，構建了MSMEG_0372基因回補和過表達菌株。pMV361是一種含有M.tuberculosis熱休克蛋白60(hsp60)基因啟動子的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭整合質粒，可以促進插入基因的表達?；蚯贸梢苑聪蝌炞CMSMEG_0372基因的功能，基因過表達可以正向驗證該基因功能，而基因回補在理論上可以回復基因敲除的改變?？傊?，MSMEG_0372基因敲除、回補與過表達菌株的成功構建，為研究該基因在M.smegmatis中的功能奠定了良好的基礎。未來可以進一步研究FabG4在分枝桿菌 Ⅱ 型脂肪酸合成(FAS-Ⅱ)途徑中的作用、參與生物膜形成的機制，評價其作為分枝桿菌生物膜標記物的可行性和抗結核藥物作用靶點的價值，這對 TB 的診斷、治療和預防具有重要意義。