瓜類白粉病菌生理小種鑒定及抗白粉病甜瓜品種篩選

徐兵劃， 汪國蓮， 仲秀娟， 黃大躍， 顧 妍， 張朝陽， 程 瑞， 孫玉東

(1.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安 223001； 2.淮安市設(shè)施蔬菜重點實驗室，江蘇淮安 223001)

瓜類白粉病是一種在甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜等瓜類作物上廣泛發(fā)生的重要病害。在發(fā)病期，白粉病病菌呈指數(shù)增長，且迅速傳播，植株葉片大面積枯死，導(dǎo)致產(chǎn)量減產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。江蘇地區(qū)甜瓜多為大棚設(shè)施栽培，加之高溫高濕氣候條件，成為白粉病的高發(fā)區(qū)[2]。

在我國致使葫蘆科作物發(fā)病的主要是單囊殼白粉菌[Sphaerothecafuliginea(syn.Podosphaeraxanthii)]與二孢白粉菌[Erysiphecichoraeearum(syn.Golovinomycescichoracearum)]。單囊殼白粉菌(Px)分化出0、1、2F、2US等11個生理小種，二孢白粉菌(Gc)分化出0號、1號2個生理小種[3]。白粉病生理小種眾多，分化演替快，研究各地區(qū)白粉病生理小種的演變對葫蘆科白粉病的防治與白粉病抗性育種具有重要意義[4]。

通過采集江蘇淮安、南京、常熟、連云港，浙江杭州，上海青浦區(qū)、金山區(qū)等地區(qū)的甜瓜、南瓜、黃瓜等感染白粉病的葉片，利用13份甜瓜白粉病鑒別寄主鑒定這些地區(qū)白粉病生理小種類型，并對8個甜瓜品種進(jìn)行苗期白粉病接種鑒定，以篩選出抗白粉病的甜瓜品種，并對接種后不同時間不同抗性品種植株中超氧化物歧物酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)等的變化進(jìn)行跟蹤測定，研究不同抗性甜瓜材料生理生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 白粉病菌生理小種鑒定材料 采用國際通用的13份甜瓜白粉病菌生理小種鑒定的鑒別寄主(表1)，分別為Iran-H、Topmark、Vedrantais、PMR 45、PMR 6、Edisto 47、PI 124112、PI 414723、PMR 5、MR-1、Nantais Oblong、WMR 29、PI 124111，由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。

1.1.2 抗白粉病甜瓜品種篩選 甜瓜品種玉姑(T1)、西州密25(T2)由市場購入，蘇甜2號(T3)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，蘇乾4號(T4)、蘇乾5號(T5)、1911ME133(T7)、1911ME134(T8)、蘇乾1號(T9)由江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

表1 甜瓜白粉病菌生理小種的鑒別寄主及其抗感反應(yīng)

1.2 試驗方法

1.2.1 白粉病菌的生理小種鑒定 2020年9月20日，甜瓜白粉病菌鑒別寄主在淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研創(chuàng)新基地育苗，播種于50孔穴盤。10月10—12日從江蘇淮安、南京、常熟、連云港，浙江杭州，上海青浦區(qū)、金山區(qū)等地區(qū)分別采集甜瓜、南瓜、黃瓜等感染白粉病的葉片(表2)，分別用毛筆刷下葉片上白粉病菌孢子至無菌蒸餾水中，高速旋轉(zhuǎn)，打散孢子團(tuán)[5]。在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，在血球計數(shù)板上計算分生孢子數(shù)，測算濃度，調(diào)整孢子濃度值為105個/mL，加入 Tween-20，攪拌均勻。10月13日，采用噴霧接種，每個處理接種10株，3次重復(fù)。接種后，放入人工氣候箱，黑暗24 h，之后光照12 h/黑暗12 h，溫度為28 ℃，濕度為80%。接種后第12 天觀察發(fā)病情況，計算病情指數(shù)(DI)。

表2 感染白粉病葉片的采集詳情

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)及分子鑒定 分別取7個地區(qū)的白粉病病原菌無性世代分生孢子于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)，有纖維狀體的為單囊殼白粉菌，無纖維狀體的為二孢白粉菌[6]。

將葉片表面的菌絲與孢子混合物刷到1.5 mL 離心管中，用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取白粉病菌DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品，合格后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)試劑是SanTaqPlus PCR Master Mix(Sangon Biotech：B532081)，引物采用通用引物ITS4。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將測序序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行比對分析。

1.2.3 抗白粉病甜瓜品種篩選 2021年3月20日，8個甜瓜品種在淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研創(chuàng)新基地玻璃溫室育苗，播種于50孔穴盤。4月12日，3葉至4葉1心時接種，病原菌為純化的2France，每個材料接種50株，2次重復(fù)。接種后5、7、10 d觀察發(fā)病情況，第12天時統(tǒng)計病情指數(shù)。

1.2.4 生化指標(biāo)的測定 于接種0 h和接種后24、72、120、168 h取植株的從上到下第3張完全展開的葉片，測定其丙二醛含量，超氧化物歧化酶和過氧化物酶等抗氧化酶活性的變化，每個材料3次生物學(xué)重復(fù)。MDA含量采用硫代巴比妥酸法[7]測定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑法[7]測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[7]測定。

1.2.5 白粉病病情分級 接種 12 d時待植株充分發(fā)病后，調(diào)查發(fā)病情況。病情分級標(biāo)準(zhǔn)參考耿麗華等的方法[8]并加以改進(jìn)，共分6級：0級，整株無病斑；1級，僅子葉上有很少量病斑或莖上有少量病斑，白粉模糊，占整株的比例在10%以下；2 級，僅葉片上有較多白粉或子葉上有白粉，莖上有很少量白粉，白粉明顯，占整株的比例為10%～20%；3 級，葉片上有很多白粉，莖上有少量白粉，白粉厚，連片，占整株的比例為21%～50%；4 級，葉片和莖上布滿白粉，白粉濃厚，占整株的比例為51%～80%；5 級，植株死亡。依據(jù)上述分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情，并計算病情指數(shù)。按病情指數(shù)進(jìn)行抗、感分級，分級標(biāo)準(zhǔn)：抗病(R)為DI<20%；中抗(MR)為20%≤DI<40%；中感(SR)為40%≤DI<60%；感病(S)為60%≤DI<80%；高感(HS)為DI≥80%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel及SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鏡下白粉病菌形態(tài)

在顯微鏡下觀察白粉病菌分生孢子均為橢圓形(圖1-A)，應(yīng)為單囊殼白粉病菌，分生孢子產(chǎn)生的菌絲有發(fā)達(dá)的纖維狀體(圖1-B)，而二孢白粉菌分生孢子為細(xì)細(xì)長長的圓柱形狀，因此可確定7份白粉病菌均為單囊殼白粉病菌。

2.2 白粉病菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列

利用通用引物ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的片段以及基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后測序，測序獲得長度為514 bp的堿基序列(圖2)，與單囊殼白粉病菌序列進(jìn)行比對，相似度達(dá)到98.83%(508/514)，空白序列(Gap)為5.51%(30/544)。

2.3 白粉病菌生理小種鑒定

接種后5 d，Iran-H、Topmark、PMR 45的葉片即出現(xiàn)白粉病病斑，接種后7 d Vedrantais、Nantais Oblong的葉片開始出現(xiàn)白粉病病斑。第12 天統(tǒng)計的結(jié)果(圖3、表3)顯示，PMR6、Edisto 47、PI 124112、PI 414723、PMR 5、MR-1、WMR 29、PI 124111的葉片和莖部均無白粉病病斑，表現(xiàn)為抗病，Iran-H、Topmark、Vedrantais、PMR 45、Nantais Oblong的葉片均布滿白粉，個別單株莖部有白粉，均表現(xiàn)為感白粉病。Iran-H、Topmark、Vedrantais、PMR 45、Nantais Oblong表現(xiàn)為感病，PMR6、Edisto 47、PI 124112、PI 414723、PMR 5、MR-1、WMR 29、PI 124111的發(fā)病指數(shù)為0，表現(xiàn)為抗病，根據(jù)表1中13個鑒別寄主對白粉病不同生理小種的抗、感反應(yīng)對比，即可確定優(yōu)勢生理小種為單囊殼白粉菌Race2中的2France(表4)。

2.4 抗白粉病甜瓜品種的篩選

接種后5 d，玉姑、蘇甜2號的葉片即出現(xiàn)白粉病病斑；接種后7 d，西州密25葉片開始出現(xiàn)白粉病病斑，蘇乾1號葉片也出現(xiàn)點狀病斑。第12天時調(diào)查統(tǒng)計的發(fā)病情況及病情指數(shù)(圖4，表5)顯示，玉姑、西州密25、蘇甜2號的病情級別處于1～4級，病情指數(shù)分別為56.37、49.04、58.54，表現(xiàn)為感白粉病(SR)；T9(蘇乾1號)發(fā)病級別為1～2級，病情指數(shù)為23.67，表現(xiàn)為中抗白粉病(MR)，蘇乾4號(T4)、蘇乾5號(T5)、1911ME133(T7)、1911ME134(T8)等4個品種的葉片、莖部均未發(fā)現(xiàn)白粉病病斑，表現(xiàn)為抗白粉病(R)。

2.5 白粉病菌對不同抗性甜瓜材料生理生化指標(biāo)的影響

2.5.1 丙二醛含量的動態(tài)變化 由圖5可知，接種白粉病菌后，MDA含量均表現(xiàn)出先升后降的趨勢，在72～120 h達(dá)到峰值， 且在168 h植株中MDA含量均高于接種前的水平，4個抗病品種(蘇乾4號、蘇乾5號、1911ME133、1911ME134)較0 h平均增加33.33%，中抗品種蘇乾1號增加37.5%，3個感病品種(玉姑、蘇甜2號、西州密25)平均增加60.96%；不同抗性材料的MDA含量表現(xiàn)為抗病品種(蘇乾4號、蘇乾5號、1911ME133、1911ME134)<中抗品種(蘇乾1號)<感病品種(玉姑、蘇甜2號、西州密25)。說明抗白粉病品種抗膜脂過氧化作用的能力要強(qiáng)于感病品種，且在168 h后細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)恢復(fù)接近正常水平。

表3 甜瓜白粉病菌鑒別寄主病情指數(shù)及抗感表型

2.5.2 白粉病菌對超氧化物歧化酶活性的影響 由圖6可知，接種白粉菌前感病品種(玉姑、蘇甜2號、西州密25)的SOD活性低于抗病品種(蘇乾4號、蘇乾5號、1911ME133、1911ME134)，接種后，不同抗性品種中的SOD活性均升高，在72 h時達(dá)到高峰，之后逐漸降低；在72 h時，4個抗病品種的SOD活性平均值是感病品種(玉姑、蘇甜2號、西州密25)的1.34倍，是中抗品種蘇乾1號的1.19倍；抗病品種的SOD活性上升幅度較大，在72 h時，4個抗病品種的SOD活性平均值較接種前增加了33.84%，而感病品種接種后其SOD活性的上升和下降趨勢均較平緩，在72 h時，3個感病品種的SOD活性平均值較接種前增加了20.98%。表明接種白粉菌后，為盡快減少病菌對植株造成的損害，抗病品種植株中的SOD活性被迅速激活，直至168 h時仍處于較活躍的狀態(tài)以保護(hù)植株。

表4 瓜類白粉病優(yōu)勢生理小種類型的判定結(jié)果

2.5.3 白粉病菌對過氧化物酶活性的影響 由圖7可知，接種后，不同抗性品種POD活性均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。在72 h時達(dá)到最高峰，此時4個抗病品種(蘇乾4號、蘇乾5號、1911ME133、1911ME134)的POD活性平均值是感病材料的1.38倍，是中抗品種蘇乾1號的1.18倍；感病品種(玉姑、蘇甜2號、西州密25)的POD活性下降趨勢>中抗品種>抗病品種，在168 h時，抗病品種POD活性平均值較72 h高峰期下降36.41%，感病品種下降50.38%。在接種0～24 h，抗病品種(蘇乾4號、蘇乾5號、1911ME133、1911ME134)的POD活性略高于感病品種(玉姑、蘇甜2號、西州密25)，而在接種后72～168 h，兩者的POD活性數(shù)值差距明顯增大，表明在受到白粉病菌侵染后，細(xì)胞組織受到損傷，為修復(fù)細(xì)胞壁損傷，POD活性迅速升高，以促進(jìn)細(xì)胞愈合；抗病品種的POD反應(yīng)更強(qiáng)且更持久，因此抵抗力更強(qiáng)。

表5 不同甜瓜品種接種白粉病菌的發(fā)病指數(shù)及病情鑒定

3 討論

3.1 白粉病菌生理小種的鑒定

本試驗對采集自江蘇及杭州、上海等地區(qū)的甜瓜、南瓜、黃瓜等不同瓜類作物上的白粉病菌進(jìn)行生理小種鑒定，首先利用顯微鏡觀察及ITS核酸序列比對，結(jié)果證實這些地區(qū)不同瓜類作物上的白粉病菌為單囊殼白粉菌。采用國際通用的白粉病菌鑒定體系進(jìn)行苗期接種鑒定，結(jié)果為P.xanthiiRace2 2France，未發(fā)現(xiàn)其他生理小種類型。

發(fā)達(dá)國家對瓜類白粉病菌的種類與生理小種有較長時間和較大范圍的監(jiān)控，蘇丹中心地區(qū)夏季發(fā)現(xiàn)了單囊殼白粉菌的生理小種 1，冬季則發(fā)現(xiàn)了生理小種 2，并認(rèn)為在同一地區(qū)白粉病流行的生理小種的轉(zhuǎn)變可能受環(huán)境條件影響[9]。在美國東南部香瓜上單囊殼白粉菌族群由生理小種 2 向生理小種 1 演替[10]。我國地域遼闊，各地白粉菌生理小種類型和優(yōu)勢小種不盡相同，隨著環(huán)境和種植作物的變化，不斷出現(xiàn)新的生理小種類型，且優(yōu)勢小種也會隨之不斷地發(fā)生變化。李蘋芳從江浙滬地區(qū)甜瓜植株上采集了9份白粉病菌進(jìn)行鑒定，確認(rèn)這9個地區(qū)甜瓜白粉病菌為P.xanthiiRace1[11]。顧海峰等的研究表明，上海地區(qū)西瓜、甜瓜上存在2個生理小種，即P.xanthiiRace 1和Race 2 France，且Race 1是生產(chǎn)上的優(yōu)勢生理小種[12]。Xu等研究認(rèn)為，P.xanthii生理小種 2 是引起浙江地區(qū)甜瓜白粉病的主要小種[13]。本研究結(jié)果與之不盡相同，可能是這些地區(qū)白粉菌生理小種類型已逐漸發(fā)生變化，P.xanthiiRace 2 France目前已成為該地區(qū)的優(yōu)勢生理小種。因此，長期監(jiān)測瓜類蔬菜作物白粉病菌生理小種類型，擴(kuò)大采樣范圍及采樣作物種類，可以為瓜類抗白粉病育種及生產(chǎn)提供理論依據(jù)[14]。

3.2 不同甜瓜品種白粉病苗期抗性

不同甜瓜品種白粉病苗期抗性試驗結(jié)果表明，玉姑、蘇甜2號接種后第5天開始發(fā)病，第12天葉片布滿病斑，屬于感白粉病品種，在田間生產(chǎn)中要預(yù)防白粉病發(fā)生，并做好及時防控；西州密25、蘇乾1號接種第7天葉片出現(xiàn)白粉病病斑，第12天時，西州密25的發(fā)病指數(shù)為49.04%，表現(xiàn)為中感白粉病，蘇乾1號的發(fā)病指數(shù)為23.67%，屬于中抗白粉病品種，在設(shè)施栽培中均需做好白粉病預(yù)防和防治工作；蘇乾4號、蘇乾5號、1911ME133、1911ME134等4個品種的葉片、莖部均未發(fā)現(xiàn)白粉病病斑，屬于抗白粉病品種，可在設(shè)施條件下引種試種。

近年來，我國甜瓜保護(hù)地栽培面積日益擴(kuò)大，保護(hù)地高溫高濕的環(huán)境易造成病害流行，白粉病是危害甜瓜保護(hù)地栽培的重要病害之一，因此引進(jìn)和培育抗白粉病甜瓜品種具有重要意義[15]。

3.3 白粉病菌對抗感材料生理生化指標(biāo)的影響

植物受到病原菌侵染后，體內(nèi)會發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化變化，POD、SOD 等保護(hù)酶可以通過分解病原菌、溶解菌絲體、并通過清除自由基減輕膜脂過氧化引起的膜損傷來維持細(xì)胞膜的正常生理功能[16]，MDA的含量可反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的水平以及生物膜受損傷的程度，是判斷膜脂過氧化作用的一個重要指標(biāo)[17]。因此，植株體內(nèi)丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等防御酶活性的變化，可作為植物抗逆性強(qiáng)弱的一項重要指標(biāo)[18]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，接種白粉病菌后，不同抗性的甜瓜品種POD、SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，抗性品種植株中的SOD、POD活性和增幅均高于感病材料，且在72～168 h時差異顯著。與張慧君等對甜瓜、西葫蘆等作物接種白粉病菌后抗病品種的SOD、 POD活性及變化趨勢[18-19]相似。但與王迪對不同抗性甜瓜品種接種白粉病菌后POD活性的變化結(jié)果[20]不一致，其發(fā)現(xiàn)感病材料(DQ12)的POD酶活性一直高于抗病材料(DQ)；而SOD研究結(jié)果相似，均表現(xiàn)為接種后抗感材料中的SOD活性上升，且抗病材料中的SOD活性大于感病材料。楊瑞平研究表明接種白粉病菌后，抗白粉病材料Yuntian930中SOD、POD活性升高幅度大于感病材料0544，且均在48 h時達(dá)到高峰；而抗病材料Yuntian 930的MDA含量在接種后呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，24 h時達(dá)到峰值，而0544的變化趨勢是先降低再持續(xù)升高，48 h后持續(xù)高于Yuntian930[15]。王建明等發(fā)現(xiàn)，西瓜苗期感染枯萎病菌后，抗病品種克倫生根部的MDA含量在接種后1 d時高于感病品種早花，之后迅速下降，顯著低于感病品種早花，表明抗病品種克倫生對枯萎病菌的侵染較感病品種更加敏感，但其自我調(diào)節(jié)、恢復(fù)正常狀態(tài)及抗膜脂過氧化的能力較感病品種強(qiáng)[22]。

綜合前人的研究結(jié)果與本研究結(jié)果可知，不同植物應(yīng)對病原菌侵染時表現(xiàn)具有差異，其SOD、POD等防御酶活性及MDA含量等變化也不盡相同。本研究表明，接種白粉病菌后，抗性材料POD、SOD活性與植株的抗性呈正相關(guān)，MDA含量與抗性呈負(fù)相關(guān)。