鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)技術(shù)研究

郭國業(yè)，徐夢琴，張乃群，林青松

（南陽師范學院生命科學與農(nóng)業(yè)工程學院，河南省生物科學與技術(shù)實驗教學示范中心，河南 南陽 473061）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是一種蘭科（Orchiidaceae）石斛屬（Dendrobium）草本植物。通俗地稱為“鐵皮楓斗”，因其莖外皮為黑色，故又稱黑節(jié)草。石斛是一種名貴中藥材，應(yīng)用歷史悠久[1-3]。有關(guān)石斛的藥理很早就被《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，其莖能夠入藥，具有益胃生津等功效[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學證明，石斛能改善人類的免疫，預防和治療心血管和腦血管性疾病，改善睡眠質(zhì)量，預防和治療腫瘤，屬于上乘的中草藥[6-7]。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高，滋補養(yǎng)生話題逐漸被大眾所熟知和關(guān)注，人們對于滋補上乘中藥石斛的需求也日益增加。

石斛為附生植物，野生石斛生長條件苛刻，對氣候的要求較為嚴格。石斛喜溫濕環(huán)境，在自然條件下主要以自然分蘗進行營養(yǎng)繁殖和通過種子進行有性繁殖[8-9]。但野生石斛種子細，種胚發(fā)育不完整，自然萌發(fā)率和繁殖率均較低，且對于病蟲害無抵抗能力[10-11]。此外，人為的過度開采和挖掘?qū)е乱吧氖Y源日益枯竭，我國已經(jīng)把石斛列為重點保護野生藥材[12]。因此，利用組織培養(yǎng)和離體快繁技術(shù)是解決當前市場上對藥用植物鐵皮石斛大量需求的一個重要途徑。我國在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)技術(shù)研究方面有了一定的進展，琚淑明等[13]以鐵皮石斛莖段為外植體，研究了鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)一次成苗技術(shù)；鄧成華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA對誘導鐵皮石斛的芽增殖具有非常重要的作用；劉太林等[15]通過添加不同濃度的激素和香蕉泥來篩選最佳培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)香蕉泥對鐵皮石斛的生根作用非常顯著；包英華等[16]采用10種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)‘丹霞’鐵皮石斛種子，比較分析其種子萌發(fā)、原球莖形成和組培苗生長發(fā)育情況，優(yōu)化出適合的組培苗培養(yǎng)基。外源激素在離體組織培養(yǎng)中的具體作用常與添加的濃度有關(guān)。該研究基于不同植物生長調(diào)節(jié)劑的含量和組合的培養(yǎng)基配方體系，探究適于鐵皮石斛芽增殖和生根誘導的最佳培養(yǎng)基配方，為鐵皮石斛的離體快速繁殖、種質(zhì)資源保護和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以南陽師范學院生命科學與農(nóng)業(yè)工程學院完成90 d初代培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗為試驗材料，選擇株型、株高一致、生長良好的植株苗，切割為具節(jié)莖段作為接種外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 不定芽增殖誘導。以MS為基本培養(yǎng)基，共設(shè)計5種不同激素組合配方并配制用于鐵皮石斛的不定芽誘導增殖的培養(yǎng)基，分別為CK：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖；A1：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA+1.000 mg/L 6-BA；A2：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.300 mg/L NAA+1.000 mg/L 6-BA；A3：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA+1.500 mg/L 6-BA；A4：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.300 mg/L NAA+1.500 mg/L 6-BA。

選取生長良好的鐵皮石斛無菌苗，剪切成2 cm具節(jié)莖段，接種于不定芽增殖培養(yǎng)基中。每個處理的培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種2個外植體，3次重復。置于無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室的溫度25℃，日均光照時間為12 h，光照強度為2 500 lx。15 d后出現(xiàn)新芽點增殖，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計污染率、芽長、增殖系數(shù)（增殖系數(shù)＝誘導增殖的不定芽數(shù)/接種芽數(shù)）、芽生長情況。

1.2.2 生根誘導培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計并配制7種不同植物激素組合的培養(yǎng)基，用于鐵皮石斛無根芽苗的生根誘導，CK：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖；B1：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA；B2：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.500 mg/L NAA；B3：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.100 mg/L IBA；B4：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.500 mg/L IBA；B5：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.500 mg/L NAA+0.500 mg/L IBA；B6：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+1.000 mg/L NAA+1.000 mg/L IBA。

選取生長健壯、株莖一致、1.5 cm長的不定芽單芽苗，由外植體切下轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中。每個處理的培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種2個外植體，3次重復。培養(yǎng)條件為：先在黑暗條件下培養(yǎng)3 d，每日光照10 h，光照強度2 000 lx。6周后，觀察鐵皮石斛苗的生根誘導情況，統(tǒng)計無菌苗的苗高、生根率、生根數(shù)和根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對鐵皮石斛莖段不定芽誘導的影響

從表1可以看出，與CK相比，不同濃度、不同組合的植物生長調(diào)節(jié)劑均能促進鐵皮石斛的不定芽增殖發(fā)生。當6-BA的濃度為1.000 mg/L時，增殖系數(shù)最大為2.330，且芽健壯，葉呈嫩綠色，說明NAA濃度為0.100 mg/L的處理效果大于NAA濃度為0.300 mg/L的處理效果。由A3和A4培養(yǎng)基誘導的數(shù)據(jù)可知，當6-BA的濃度為1.500 mg/L時，增殖系數(shù)最大為2.050、平均芽高的最大值為0.610，說明濃度為0.100 mg/L的NAA處理效果大于濃度為0.300 mg/L的處理效果。綜上表明，當6-BA濃度一定時，較高濃度的NAA會抑制芽的增殖。由A1和A3培養(yǎng)基誘導的數(shù)據(jù)可知，當NAA濃度為0.100 mg/L、6-BA濃度較小時，不定芽增殖系數(shù)和平均芽高較大。由A2和A4培養(yǎng)基誘導的數(shù)據(jù)可知，當NAA濃度為0.300 mg/L時，6-BA的濃度越小，增殖系數(shù)和平均芽高反而越大，表明較高濃度的6-BA呈現(xiàn)出對不定芽芽增殖的抑制。正交實驗方差分析顯示，6-BA和NAA對芽的增殖效果均未達到顯著差異水平。綜上，鐵皮石斛芽增殖的最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA+1.000 mg/L 6-BA，此配方條件下的培養(yǎng)基芽誘導增殖系數(shù)最大，芽色嫩綠，芽體健壯。

表1 不同激素濃度對鐵皮石斛莖段不定芽誘導的影響

2.2 不同激素對鐵皮石斛生根誘導的影響

從表2可以看出，不同質(zhì)量含量、不同種類組合的植物生長素均會影響鐵皮石斛的生根誘導培養(yǎng)。由B1和B2培養(yǎng)基誘導結(jié)果可知，在培養(yǎng)基中只有NAA且含量為0.500 mg/L時，生根率、平均根長、平均根數(shù)和平均高度的值較大，說明B2配方比B1配方對鐵皮石斛的生根誘導較好。由B3和B4培養(yǎng)基誘導結(jié)果顯示，在只添加IBA且濃度為0.500 mg/L的情況下，鐵皮石斛的生根率、平均根長、平均根數(shù)以及平均株高的值均大于IBA濃度為0.100 mg/L時的數(shù)值，說明B4配方比B3配方對鐵皮石斛的生根誘導作用好。對照B1和B3培養(yǎng)基配方的誘導數(shù)據(jù)顯示，當植物激素含量為0.100 mg/L時，NAA的誘導效果相對好；當植物激素含量為0.500 mg/L時，NAA的誘導效果不如IBA。由B5和B6培養(yǎng)基配方的誘導數(shù)據(jù)可知，當同時添加NAA和IBA時，植物生長調(diào)節(jié)劑濃度較低時的配方對鐵皮石斛生根誘導效果較好。從生根培養(yǎng)基誘導的數(shù)據(jù)還可以看出，在B4培養(yǎng)基配方中，當IBA濃度為0.500 mg/L、NAA濃度為0時，鐵皮石斛的生根率最高為100%，推測NAA對鐵皮石斛生根誘導有一定抑制作用。不同生長素對鐵皮石斛根長誘導影響的方差分析顯示（表3），IBA和NAA的P值均小于0.05，表明IBA和NAA對鐵皮石斛的根長誘導具有顯著性作用，并且IBA的F值（87.650）大于NAA的F值（21.408），說明IBA對鐵皮石斛根長誘導的影響明顯大于NAA。綜上，適宜鐵皮石斛生根誘導的培養(yǎng)基配方為：MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.500 mg/L IBA，其誘導生根率高達100%，平均根長1.040 cm，平均根數(shù)為3.700個，平均株高為1.610 cm。

表2 不同激素組合對鐵皮石斛生根誘導的影響

3 討論

不同植物生長調(diào)節(jié)劑間有拮抗、反饋和協(xié)同作用，植物的生長發(fā)育活動多受到幾種激素的調(diào)控[17]。該研究通過添加NAA和6-BA 2種植物生長調(diào)節(jié)劑來探究鐵皮石斛的芽增殖培養(yǎng)，由結(jié)果數(shù)據(jù)可知，不同濃度、不同組合的6-BA和NAA都能促進鐵皮石斛芽的增殖培養(yǎng)，但存在一定的差異。研究發(fā)現(xiàn)，當芽增殖培養(yǎng)基中6-BA的含量為1.000 mg/L時，隨著NAA含量的升高，增殖系數(shù)與平均芽高降低，芽的生長情況由原來的健壯、葉呈新鮮的綠色轉(zhuǎn)化為芽較短、葉色變?yōu)榫G色。當培養(yǎng)基中6-BA的含量為1.500 mg/L時，隨著NAA濃度增大，芽的增殖系數(shù)、平均芽高也都減小，芽的生長情況由原來的葉呈綠色轉(zhuǎn)化為葉呈黃綠色。配方編號A1、A2和A3和A4的結(jié)果變化趨勢相似的原因可能是高濃度的NAA抑制了芽的增殖。當NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度的升高，芽的增殖系數(shù)、平均芽高均減小，芽的長勢也降低，表明6-BA濃度的升高抑制不定芽的增殖。適當添加一定量的活性炭，能夠提高芽生長系數(shù)。在添加不同濃度的活性炭的培養(yǎng)基中，芽的分化率提高，葉變得濃綠，增殖系數(shù)也有明顯的提高。

從生根誘導培養(yǎng)的結(jié)果來看，當添加IBA的濃度為0.500 mg/L時鐵皮石斛的生根率達到100%，根的誘導數(shù)量最多且根的長度最長，誘導效果最佳。當同時使用NAA和IBA 2種生長調(diào)節(jié)劑時，生根率卻有所下降，根的數(shù)量和根的長度都減少，推測培養(yǎng)基中較高含量的植物生長素物質(zhì)將抑制鐵皮石斛根系的誘導發(fā)生[18]。