脂聯(lián)素對骨質(zhì)疏松大鼠椎體磷酸鈣骨水泥強(qiáng)化后骨質(zhì)量及生物力學(xué)的影響及機(jī)制

張鑫，馬朋朋，劉肅，李偉，張麥粒，趙立春，張春玲

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075000)

骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折是骨質(zhì)疏松癥的常見并發(fā)癥之一，臨床常用經(jīng)皮椎體成形術(shù)及后凸成形術(shù)進(jìn)行治療[1]。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)是近些年用于經(jīng)皮椎體成形術(shù)及后凸成形術(shù)的新型骨水泥，具有生物相容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性良好及固化過程中放熱慢、升溫小、不易產(chǎn)生熱損傷的優(yōu)勢，但也存在機(jī)械強(qiáng)度不足、黏結(jié)性較弱的缺點(diǎn)，進(jìn)而限制了該材料的臨床應(yīng)用[2-3]。因此，增強(qiáng)CPC強(qiáng)化椎體的骨質(zhì)量及生物力學(xué)強(qiáng)度具有重要意義。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，骨代謝相關(guān)的研究證實APN具有加速成骨、抑制破骨的作用，在骨折愈合過程中能夠促進(jìn)骨痂形成、骨微結(jié)構(gòu)重建[4]。本研究將使用APN增強(qiáng)CPC強(qiáng)化椎體的骨質(zhì)量和生物力學(xué)強(qiáng)度，具體觀察APN對骨質(zhì)疏松大鼠椎體CPC強(qiáng)化后骨質(zhì)量及生物力學(xué)的影響及分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 12周齡雌性SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，操作過程遵循3R原則。

APN購自美國Sigma公司，動物組織RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)特異性一抗購自Abcam公司，磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38MPAK，p-p38 MAPK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2)特異性一抗購自CST公司。

雙能X線骨密度儀(XR-46型)購自美國Norland公司，小動物高分辨顯微CT(VENUS型)購自上海平生醫(yī)療科技公司，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購自美國Bio-rad公司。

神經(jīng)元受炎癥刺激會出現(xiàn)持續(xù)性遺傳放電現(xiàn)象或者自發(fā)放電現(xiàn)象，周敏化由此產(chǎn)生；一方面，周圍炎癥因子作用下會產(chǎn)生該效應(yīng)，神經(jīng)元自身離子通道改變是主要原因，比如，外周神經(jīng)元損傷后，背根神經(jīng)節(jié)的鈉離子通道電流強(qiáng)度會增高，而鈣離子與鉀離子電流強(qiáng)度卻會降低甚至消失，這些變化都會降低神經(jīng)元膜電位，提升細(xì)胞興奮度，并會向脊髓背角傳導(dǎo)，將突觸傳遞反應(yīng)增加，使得一系列的痛覺敏化反應(yīng)增強(qiáng)。另一方面，受炎癥因子刺激，激活了P2X3受體、NMDA受體磷酸化，引起一系列的病理反應(yīng)在受體活性與表達(dá)上，神經(jīng)元本身會出現(xiàn)變性與壞死現(xiàn)象，這些都作為病理基礎(chǔ)促使外周與中樞痛敏形成[1]。

1.2 方法

2.3 APN對CPC強(qiáng)化椎體中成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響 采用熒光定量PCR檢測CPC強(qiáng)化椎體中成骨標(biāo)志基因ALP、OCN、OPN的mRNA相對表達(dá)量，1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組CPC強(qiáng)化椎體中ALP、OCN、OPN的mRNA相對表達(dá)量及蛋白表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

1.2.5 蛋白相對表達(dá)水平的檢測 另取CPC強(qiáng)化的椎體組織約20 mg，加入裂解液并在冰上研磨組織、提取組織蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度，根據(jù)檢測結(jié)果將30 μg蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳，使不同分子量的蛋白質(zhì)分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1 h，1∶1000稀釋的ALP、OCN、OPN、p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2特異性一抗或1∶5 000稀釋的β-actin特異性一抗4℃孵育NC膜過夜。次日室溫孵育1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗1h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，得到ALP、OCN、OPN、p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2、β-actin的條帶，根據(jù)蛋白條帶灰度值，以βactin為內(nèi)參計算ALP、OCN、OPN、p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2的蛋白相對表達(dá)水平。

用于骨質(zhì)疏松造模的剩余30只大鼠進(jìn)行分組，分為對照組、1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組，均進(jìn)行CPC強(qiáng)化，方法如下：以兩側(cè)髂后上棘連線與后正中線交點(diǎn)為中心、做長度2 cm的縱形切口，顯露第4腰椎的側(cè)壁，用3 mm直徑的鉆頭垂直打孔5 mm，經(jīng)打孔隧道注射CPC 0.1 mL，縫合切口。7 d后1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組分別給予1 mg/kg、2 mg/kg APN局部注射，對照組給予等劑量生理鹽水局部注射，經(jīng)打孔隧道部位進(jìn)針，在注射CPC周圍椎體進(jìn)行局部注射，每日1次，連續(xù)8周。

乍一聽“頭腦”的名稱，我還以為是用“筋頭巴腦”為主要食材做的燉菜，結(jié)果親口品嘗時才發(fā)現(xiàn)，“頭腦”是一道沒有半點(diǎn)筋頭巴腦的滋補(bǔ)湯！——我犯了典型的“顧名思義”錯誤！太原古城擁有燦爛的飲食文化，而“頭腦”便是古城久負(fù)盛名的一道獨(dú)特美食。

法團(tuán)主義路徑的核心觀點(diǎn)認(rèn)為，社區(qū)治理是城市社會治理體系的一部分，社區(qū)建設(shè)是國家政權(quán)建設(shè)的一部分，社區(qū)治理是以國家為主、社會為輔，國家吸納社會構(gòu)成的一種治理體系。在社區(qū)治理改革過程中，國家其實從未(也不可能)退場，只是改變了控制社會的策略——從單位社會時期的一統(tǒng)控制轉(zhuǎn)向國家的“擇機(jī)介入”。②當(dāng)前，國家通過社區(qū)建設(shè)將權(quán)力下沉到基層社會和社區(qū)，將作為社會自治組織的居委會吸納入政府體制，通過體制內(nèi)部的權(quán)力優(yōu)化重組來推進(jìn)社會治理和發(fā)展。

1.2.3 強(qiáng)化椎體骨生物力學(xué)強(qiáng)度的檢測 完成骨質(zhì)量檢測后將第4腰椎進(jìn)行去除附件、兩端椎間盤組織、打磨椎體上下兩個底面的操作，使底面與椎體縱軸垂直，而后將椎體放置在萬能材料試驗機(jī)中進(jìn)行壓縮實驗，與椎體縱軸平行的方向加載應(yīng)力、加載速度為2 mm/min，記錄壓縮中心的荷載和變形情況，計算最大符合及剛度。

2.1 APN對CPC強(qiáng)化椎體骨質(zhì)量的影響 采用雙能X線骨密度儀測量CPC強(qiáng)化椎體的骨密度水平，1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組CPC強(qiáng)化椎體的骨密度水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

10月19日，廣西民族音樂博物館在南寧正式開館，這是廣西首個專題性的音樂博物館。該館設(shè)立于廣西藝術(shù)學(xué)院南湖校區(qū)，是廣西壯族自治區(qū)政府立項建設(shè)項目，旨在弘揚(yáng)廣西民族音樂文化、探尋中國南方少數(shù)民族與東南亞民族音樂文化的共源性、推動中國與東南亞國家音樂文化深度交流。

如圖3所示，在小車移動過程中，1號點(diǎn)至6號點(diǎn)作為第一層停留點(diǎn)，7號點(diǎn)到18號點(diǎn)作為第二層停留點(diǎn)，以此類推.其中，標(biāo)號為p的停留點(diǎn)(p=1,2,…,M)，由3k2+3k+1≥p>3k2-3k+1知，其所處層數(shù)

1.2.2 CPC強(qiáng)化椎體骨質(zhì)量的檢測 處死大鼠后解剖第4腰椎，剝離周圍軟組織后放置在雙能X線骨密度中，按照掃描寬度20 nm、掃描速度7 mm/s對骨密度水平進(jìn)行測量。然后將第4腰椎放入小動物高分辨顯微CT中，按照15 μm的分辨率進(jìn)行掃描，得到圖像后測量骨小梁體積分?jǐn)?shù)(bone volume to total volume，BV/TV)、平均骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、平均骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)。

2 結(jié) 果

1.2.4 mRNA相對表達(dá)水平的檢測 完成壓縮實驗后，取CPC強(qiáng)化的椎體組織約20 mg，采用組織RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將組織中提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的ALP、OCN、OPN進(jìn)行熒光定量PCR檢測，PCR的體系為：cDNA 1 μL、莫洛尼氏鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒(moloney murine leukemia retrovirus，MMLV)反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL；PCR的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 15 s、特異性退火溫度25 s、72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)的熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計算ALP、OCN、OPN的mRNA相對表達(dá)水平。

采用顯微CT掃描觀察骨微觀結(jié)構(gòu)，1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組CPC強(qiáng)化椎體的BV/TV、Tb.N、Tb.Th水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1，見圖1)。

表1 三組間CPC強(qiáng)化椎體骨密度及骨微觀結(jié)構(gòu)CT參數(shù)的比較

圖1 三組CPC強(qiáng)化椎體的CT圖像

2.2 APN對CPC強(qiáng)化椎體生物力學(xué)的影響 采用椎體壓縮實驗評價CPC強(qiáng)化椎體的生物力學(xué)特征，1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組CPC強(qiáng)化椎體的最大負(fù)荷、剛度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 三組間CPC強(qiáng)化椎體生物力學(xué)參數(shù)最大負(fù)荷、剛度的比較

1.2.1 動物造模及給藥 隨機(jī)選擇10只大鼠，處死后解剖第4腰椎、測量骨密度。剩余40只大鼠均進(jìn)行骨質(zhì)疏松造模，方法如下：異氟烷麻醉后擺放仰臥位，做腹正中切口，打開腹腔后顯露兩側(cè)卵巢，在子宮與卵巢之間用1號絲線結(jié)扎，切下卵巢，縫合切口，四周后選擇其中10只大鼠處死并解剖第4腰椎、測量骨密度。未去卵巢大鼠第4腰椎的骨密度平均值(0.221±0.019) g/mm2、去卵巢大鼠第4腰椎的骨密度平均值(0.152±0.017) g/mm2，說明骨質(zhì)疏松模型制備成功。

圖2 三組間CPC強(qiáng)化椎體中成骨標(biāo)志基因mRNA相對表達(dá)量的比較

采用Western blot檢測CPC強(qiáng)化椎體中成骨標(biāo)志基因ALP、OCN、OPN的蛋白相對表達(dá)量，1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組CPC強(qiáng)化椎體中ALP、OCN、OPN的蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

圖3 三組間CPC強(qiáng)化椎體中成骨標(biāo)志基因蛋白相對表達(dá)量的比較

2.4 APN對CPC強(qiáng)化椎體中MAPK信號通路的影響 采用Western blot檢測CPC強(qiáng)化椎體中MAPK信號通路分子磷酸化水平，1 mg/kg APN組、2 mg/kg APN組CPC強(qiáng)化椎體中p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2的蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

式中：Green、NIR(near infrared)、MIR(middle infrared)分別為綠波段、近紅外波段、短波紅外波段，在Landsat 8 OLI數(shù)據(jù)中，對應(yīng)的波段數(shù)分別為第3、5和6波段像元的灰度值。

圖4 三組間CPC強(qiáng)化椎體中p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)量的比較

3 討 論

骨質(zhì)疏松性壓縮性骨折會導(dǎo)致脊髓和神經(jīng)根壓迫，引起腰背疼痛、受壓迫階段神經(jīng)功能障礙等臨床表現(xiàn)，對患者的日常生活及身心健康均造成不利影響。經(jīng)皮椎體成形術(shù)及后凸成形術(shù)能夠快速減輕疼痛、增強(qiáng)受累椎體強(qiáng)度、防止椎體進(jìn)一步塌陷。CPC是近些年用于經(jīng)皮椎體成形術(shù)及后凸成形術(shù)的新型骨水泥，與傳統(tǒng)的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥比較，CPC骨水泥的優(yōu)勢為可降解、生成的終產(chǎn)物羥基磷灰石與人體骨組織中的無機(jī)成分相似，因而生物相容性較好；此外，CPC固化過程中放熱慢、升溫小，不會對周圍組織產(chǎn)生明顯熱損傷[5-6]。

雖然CPC骨水泥的臨床應(yīng)用較傳統(tǒng)骨水泥具有一定優(yōu)勢，但該材料也存在一定不足，主要的不足是機(jī)械強(qiáng)度不足、CPC強(qiáng)化后的椎體抗壓縮強(qiáng)度不足，這一不足也限制了CPC的臨床應(yīng)用[7-9]。因此，在CPC強(qiáng)化椎體后進(jìn)行藥物干預(yù)以增強(qiáng)椎體的強(qiáng)度能夠彌補(bǔ)CPC的不足之處，進(jìn)而增強(qiáng)CPC的臨床應(yīng)用價值[10-12]。CPC強(qiáng)化椎體局部成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成有助于增強(qiáng)骨骼的機(jī)械強(qiáng)度，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化是增強(qiáng)CPC強(qiáng)化椎體機(jī)械強(qiáng)度的重要思路[13]。APN是一種具有改善骨代謝作用的細(xì)胞因子，對干細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)作用[14-15]，對骨折愈合過程中的骨痂形成、骨微結(jié)構(gòu)重建也有促進(jìn)作用[4，16]。

國內(nèi)王洋等[4]的動物實驗使用1 mg/kg和2 mg/kg APN對脛骨骨折大鼠進(jìn)行干預(yù)，本研究將1 mg/kg和2 mg/kg APN用于骨質(zhì)疏松大鼠CPC強(qiáng)化椎體的干預(yù)，通過卵巢切除術(shù)得到骨質(zhì)疏松大鼠，對第4腰椎進(jìn)行CPC強(qiáng)化后1周開始給予APN干預(yù)。為了證實APN干預(yù)的價值，本研究使用雙能X線檢測骨密度、顯微CT檢測骨微結(jié)構(gòu)等手段反映第4腰椎的骨質(zhì)量，通過椎體壓縮實驗檢測骨骼的生物力學(xué)強(qiáng)度，結(jié)果顯示APN干預(yù)后CPC強(qiáng)化椎體的各項骨質(zhì)量指標(biāo)及生物力學(xué)指標(biāo)均得到改善，表明APN顯著增強(qiáng)骨質(zhì)疏松大鼠椎體CPC強(qiáng)化后的骨質(zhì)量和生物力學(xué)強(qiáng)度。

APN具有促進(jìn)成骨分化的作用，而成骨分化又對增強(qiáng)CPC強(qiáng)化椎體的機(jī)械強(qiáng)度具有重要意義，基于此推測APN在CPC強(qiáng)化椎體中發(fā)揮的作用與促進(jìn)成骨分化有關(guān)。ALP、OCN、OPN是經(jīng)典的成骨標(biāo)志基因，通過檢測基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平可知APN干預(yù)后CPC強(qiáng)化椎體中三種成骨標(biāo)志基因的表達(dá)水平均明顯增加，表明APN對骨質(zhì)疏松大鼠椎體CPC強(qiáng)化后的成骨分化具有促進(jìn)作用。目前研究認(rèn)為APN的生物學(xué)作用與激活MAPK家族中的p38MPAK、JNK、ERK1/2有關(guān)[17-19]，本研究進(jìn)一步檢測上述三種信號分子的磷酸化水平，結(jié)果APN干預(yù)后CPC強(qiáng)化椎體中三種信號分子的磷酸化表達(dá)水平均明顯增加。由此進(jìn)一步明確APN對骨質(zhì)疏松大鼠椎體CPC強(qiáng)化后成骨分化的促進(jìn)作用，且這一作用與激活p38MPAK、JNK、ERK1/2通路有關(guān)。

綜上所述，APN增強(qiáng)骨質(zhì)疏松大鼠椎體CPC強(qiáng)化后的骨質(zhì)量和生物力學(xué)強(qiáng)度，激活p38MPAK、JNK、ERK1/2通路是相關(guān)的分子機(jī)制，這為今后臨床上使用CPC進(jìn)行經(jīng)皮椎體成形術(shù)及后凸成形術(shù)增強(qiáng)椎體強(qiáng)度提供了新的治療思路。