肩袖損傷患者肌腱和骨組織中氧化應(yīng)激狀態(tài)及Beclin1、mTOR的表達(dá)分析

劉治軍，劉少津，鄭維蓬，魏合偉*，廖志浩，陳勝

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510240；2.廣東省中醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510115)

肩袖損傷是人體常見的運(yùn)動系統(tǒng)疾病，可由外傷、退行性等因素導(dǎo)致。在美國，每年大約有450萬人因肩痛就診，其中約25萬人接受了肩袖手術(shù)的治療[1]。在中國，隨著人口老齡化趨勢和全民健身普及，肩袖損傷的發(fā)病率和就醫(yī)率也在逐步上升。氧化應(yīng)激是機(jī)體促氧化與抗氧化失衡，產(chǎn)生自由基增多、組織器官抗氧化能力下降的一種病理狀態(tài)，它可導(dǎo)致創(chuàng)面損害，不利于愈合[2]。自噬是一種動態(tài)的分解代謝過程，與細(xì)胞損傷、修復(fù)、增殖等密切相關(guān)，在細(xì)胞應(yīng)激和環(huán)境適應(yīng)中起重要作用[3]。自噬在一定程度上具有抵抗細(xì)胞凋亡的作用，但是也并非都是積極保護(hù)作用，過度或不足的自噬都能損傷細(xì)胞，甚至可致細(xì)胞死亡[4]。在臨床中發(fā)現(xiàn)損傷后的肩袖往往無法自行愈合，甚至撕裂嚴(yán)重導(dǎo)致其他結(jié)構(gòu)損傷。即使通過關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療，修復(fù)后的肩袖也往往因腱骨愈合不良容易再發(fā)撕裂。因此，本研究通過觀察肩袖損傷發(fā)生時肌腱和肩袖止點(diǎn)足印區(qū)骨組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)及Beclin1、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)差異表達(dá)情況，來探討氧化應(yīng)激和自噬對腱-骨愈合的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 選擇2019年7月至2020年12月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院符合肩袖損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]的20例患者，男10例，女10例；年齡30～75歲，平均(61.52±7.32)歲。全部患者均行肩關(guān)節(jié)鏡下肩袖錨釘修補(bǔ)術(shù)，術(shù)中提取患者損傷的肌腱組織和肩袖止點(diǎn)足印區(qū)骨組織樣本為損傷組，取正常的肌腱組織和足印區(qū)旁骨組織樣本為對照組。獲得肌腱和骨組織樣本的方案已得到廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院研究倫理委員會的批準(zhǔn)(中國廣州)，并簽署知情同意書。本試驗研究經(jīng)中國臨床試驗注冊中心注冊，注冊號為ChiCTR-2000033948。各組患者臨床特征之間沒有差異，包括年齡、體重指數(shù)、性別、糖尿病、高血壓和外周動脈疾病。所有處理過的肌腱和骨組織標(biāo)本均使用液氮冷凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

TRIzol試劑(批號：DP424，北京天根生化)，0.25%胰蛋白酶(批號：15050065，Gibco)，Dulbecco氏培養(yǎng)基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)(批號：11965092，Gibco)，cDNA合成試劑盒(批號：KR118，北京天根生化)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(批號：QP002，廣州復(fù)能基因)，組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(批號：BB-470532，貝博生物)，超氧化物檢測試劑盒(批號：S0060，碧云天)，Beclin-1(D40C5)Rabbit mAb(批號：3495T，CST)，mTOR(7C10)Rabbit mAb(批號：2983T，CST)，P-mTOR(Ser2448)(D9C2)Rabbit(批號：5536T，CST)，聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012，碧云天)，電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi luminescence，ECL)液(批號：P0018S，碧云天)。離心機(jī)(型號：ST16，Thermo Fisher公司)，RT-PCR儀(型號：7500，ABI)，核酸微量分析儀，多功能酶標(biāo)儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 ROS檢測 從液氮中取出保存的各組肌腱和骨組織臨床標(biāo)本，解凍后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗凈，準(zhǔn)確稱取50 mg組織，加入1 mL勻漿緩沖液A，用玻璃勻漿器充分勻漿；1 000轉(zhuǎn)/min 4 ℃離心10 min，棄沉淀，取上清。采用ROS檢測試劑盒(貝博，BB-470532)檢測組織中ROS水平，用2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法檢測肌腱和骨組織樣本中的總ROS水平。主要方法為：在96孔板中加入190 μL勻漿上清液、10 μL O12探針，用移液器吹打，使之重復(fù)混勻；在37 ℃避光孵育15～30 min；置于酶標(biāo)儀中，后于激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長526 nm檢測熒光強(qiáng)度；活性氧水平計算公式：相對熒光強(qiáng)度=(熒光強(qiáng)度樣品1-熒光強(qiáng)度空白對照)/(熒光強(qiáng)度樣品n-熒光強(qiáng)度空白對照)×100%。

1.2.2 組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測 準(zhǔn)確稱取50 mg組織，放進(jìn)15 mL錐形離心管。加3 mL GENMED清理液(Reagent A)清洗1次。切碎組織，放進(jìn)預(yù)冷的15 mL錐形離心管。加入250 μL預(yù)冷的GENMED裂解液(Reagent B)。震蕩5 s，充分混勻。放進(jìn)預(yù)冷的dounce勻漿器。勻漿棒勻化組織，勻漿物移入1.5 mL離心管，移取10 μL進(jìn)行蛋白定量檢測。另取10 μL上清勻漿液，用PBS大約稀釋5倍，取20 μL進(jìn)行蛋白定量。采用組織超氧陰離子檢測試劑盒(GENME，GMS10096.2 v.A)，用二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)法檢測SOD含量。按照說明檢測組織中超氧陰離子水平：96孔板每孔加入100 μL組織上清和100 μL超氧化物檢測工作液，37 ℃孵育3 min。加入可以誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物的刺激物，如丙二酸甲醚醋酸酯等，刺激30 min。在450 nm測定吸光度。移取50 μL GENMED緩沖液(Reagent C)到空白對照孔，移取50 μL上述準(zhǔn)備的待測樣品到待測樣品孔里。分別加入50μL GENMED染色液(Reagent D)?；靹?，37 ℃培養(yǎng)箱里孵育30 min，離心，抽去上清液，分別加入100 μL GENMED溶解液(Reagent E)，混勻。孵育5 min，放進(jìn)酶標(biāo)儀里測讀：獲得吸光讀數(shù)(OD)。構(gòu)建生成曲線：縱座標(biāo)(Y軸)為吸光值(OD)；橫坐標(biāo)(X軸)為組織量、時間點(diǎn)或藥物處理濃度等。計算樣本濃度：[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))×0.1 mL(體系容量)×樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05 mL(樣品容量)×20 μmol(吸光系數(shù))× 0.6 cm(光徑距離)]=μmol/mL÷(樣品蛋白濃度) mg/mL=μmol/mg。

1.2.3 RT-PCR檢測Beclin1和mTOR mRNA的表達(dá) 取出液氮保存的各組臨床標(biāo)本，解凍后用PBS洗凈。準(zhǔn)確稱取50 mg組織，加入1 mL TRIzol，根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA。于PCR儀上70℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻。依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)，1 μL RNA inhibitor和1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，混勻。于PCR儀上42 ℃保溫30 min，結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，RT-PCR反應(yīng)，10 μL體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s GOTO 39(40個循環(huán))，72 ℃ 35 s。循環(huán)結(jié)束后從55 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。用其系統(tǒng)軟件進(jìn)行實驗結(jié)果分析：2-ΔΔCt法A=Ct(目的基因，待測樣本)-Ct(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)；B=Ct(目的基因，對照樣本)-Ct(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)K=A-B；表達(dá)倍數(shù)=2-K。 各基因引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 免疫蛋白印跡(western blot，WB)檢測Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白 取出液氮保存的各組臨床標(biāo)本，解凍，PBS洗凈。準(zhǔn)確稱取100 mg組織，加入0.1 mL裂解液，勻漿。4 ℃，12 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。用PBS完全溶解標(biāo)準(zhǔn)品，使終濃度為0.5 mg/mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品蛋白濃度。上樣電泳，轉(zhuǎn)膜。室溫下用5%的脫脂牛奶[0.5% TBST(TBS+Tween)配]，封閉1 h；稀釋一抗[TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)]，4 ℃過夜；稀釋二抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶)，室溫下孵育30 min后，用TBST洗3次，每次5 min。將A和B兩種試劑等體積混合，將膜蛋白面朝上與此混合液充分接觸，包好，暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影；根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。將膠片進(jìn)行掃描存檔，ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2 實驗結(jié)果

2.1 肌腱和骨組織ROS水平比較 與對照組比較，損傷組的肌腱和骨組織中ROS水平顯著升高(P<0.05)。表明肩袖損傷時肌腱和骨組織中活性氧含量增加(見圖1)。

圖1 兩組肌腱和骨組織ROS水平比較

2.2 肌腱和骨組織SOD含量比較 與對照組比較，損傷組的肌腱組織中SOD水平顯著降低(P<0.05)，而足印區(qū)骨組織中SOD水平顯著升高(P<0.05)。表明肩袖損傷時肩袖組織中SOD含量降低，而骨組織中含量升高(見圖2)。

圖2 兩組肌腱和骨組織中SOD含量比較

2.3 肌腱和骨組織中Beclin1、mTOR mRNA水平比較 PT-PCR檢測肩袖損傷患者肌腱和骨組織中Beclin1、mTOR mRNA水平，與對照組比較，損傷組的肌腱和骨組織中Beclin1mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，mTOR mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05，見圖3)。

圖3 兩組肌腱和骨組織中Beclin1、mTOR mRNA水平比較

2.4 肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平比較 WB檢測肩袖損傷患者肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平，與對照組比較，損傷組的肌腱和骨組織中Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，mTOR蛋白表達(dá)升高不明顯(見圖4～5)。

圖4 兩組肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平

圖5 兩組肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白電泳圖

3 討 論

肩袖的肌肉在維持正常盂肱運(yùn)動和穩(wěn)定性中起著重要作用。岡上肌用于啟動外展，岡下肌和小圓肌負(fù)責(zé)外旋，而肩胛下肌是肩部的主要內(nèi)旋肌[6-7]。肩袖撕裂代表了一種常見的肩部病變，是肩部疼痛、活動受限的常見原因，不同年齡段人群其臨床癥狀表現(xiàn)不一。通常情況下，肩袖撕裂在老年人中比在年輕患者中更常見，其具有慢性或急性-慢性病程，并且通常繼發(fā)于肌腱變性[8]。肌腱是將肌肉與骨骼連接起來的纖維結(jié)締組織，它們的主要功能是在運(yùn)動過程中將力從相應(yīng)的肌肉傳遞到骨骼，因此，它們經(jīng)常承受機(jī)械載荷。過度使用造成的肌腱損傷會導(dǎo)致疼痛和運(yùn)動障礙，并可能發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎和殘疾[9]。肩袖修復(fù)術(shù)是治療肩袖損傷常用的手段，能有效緩解肩部疼痛、活動受限，但術(shù)后康復(fù)時間較長、且肩袖發(fā)生再撕裂的概率很高，其主要原因在于術(shù)后肩袖止點(diǎn)處腱-骨愈合較差，難以恢復(fù)原有的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特性和生物力學(xué)性能[10-11]。因此，如何有效提高肩袖止點(diǎn)處的腱-骨愈合是解決此類問題的關(guān)鍵。

肩袖損傷是一種比較常見的肌腱病，也是一種慢性活動受限綜合征，其特征是與活動相關(guān)的疼痛、腫脹或功能障礙。過度使用或衰老導(dǎo)致的肌腱損傷是目前臨床治療上的巨大挑戰(zhàn)，因為受損肌腱組織的自我修復(fù)非常緩慢且不完全。肌腱分化的分子機(jī)制很大程度上是不確定的，從而阻礙了肌腱修復(fù)新療法的發(fā)展[11]。在生理條件下，機(jī)體不斷產(chǎn)生活性氧，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)不斷清除活性氧，處于動態(tài)平衡狀態(tài)，不會對機(jī)體造成傷害[12]。然而，當(dāng)有害刺激發(fā)生時，會產(chǎn)生大量活性氧，而抗氧化系統(tǒng)去除這些活性氧的能力有限，最終導(dǎo)致氧化損傷[13]。眾所周知，機(jī)械性超負(fù)荷會在肌腱細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激，例如氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而導(dǎo)致肌腱炎和肌腱變性[14]。在肌腱的退行性改變過程中，線粒體的功能障礙將導(dǎo)致ROS的過度增加，而ROS的過度產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激將在肌腱的退變過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，造成持續(xù)的肌腱功能喪失[15]。自噬是一種自然的破壞性機(jī)制，可以使功能異常的細(xì)胞組分有序降解和再循環(huán)。自噬被各種內(nèi)在和外在的細(xì)胞應(yīng)激激活，例如饑餓、ROS積累和缺氧，并且在這些應(yīng)激條件下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用[16-17]。mTOR和Beclin1都有介導(dǎo)自噬發(fā)生的作用，是自噬調(diào)控的重要因子，并形成Beclin1-mTOR交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在Beclin1調(diào)節(jié)自噬的網(wǎng)絡(luò)功能中，與mTOR細(xì)胞信號傳導(dǎo)通道之間存在的相互反饋調(diào)控機(jī)制[18-20]。本研究檢測了在臨床中收集的正常肩袖和受損肩袖組織、足印區(qū)和非足印區(qū)骨組織中的ROS、SOD水平，發(fā)現(xiàn)受損肩袖組織中ROS水平升高、SOD降低，而足印區(qū)骨組織中ROS、SOD表達(dá)水平都升高，表明受損的肌腱和足印區(qū)壞死的骨組織受到有害刺激后，影響了ROS、SOD的含量，激發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)而檢測了Beclin1、mTOR的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)受損肩袖組織和足印區(qū)骨組織中Beclin1表達(dá)含量較高，而mTOR表達(dá)含量較低，說明Beclin1在調(diào)節(jié)自噬過程中與mTOR細(xì)胞信號傳導(dǎo)之間存在相互反饋調(diào)控機(jī)制；也表明由于ROS、SOD的過度積累，在氧化應(yīng)激的條件下，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬促進(jìn)腱-骨愈合，以免受氧化應(yīng)激造成的損害。

綜上所述，損傷的肌腱和足印區(qū)壞死的骨組織受到有害刺激后，導(dǎo)致ROS、SOD過度積累的微環(huán)境使細(xì)胞遭受強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激。與此同時，出于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用，在氧化應(yīng)激的條件下，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬促進(jìn)腱-骨愈合，以免受氧化應(yīng)激造成的損害。其氧化應(yīng)激和自噬具體通過何種途徑、機(jī)制來影響腱-骨愈合，仍需要進(jìn)一步深入探討。