苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠的制備及釋藥機制研究

朱泠音，鄭觀濤，周昌妮，申延利，韓志芳，賈永艷

河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠的制備及釋藥機制研究

朱泠音，鄭觀濤，周昌妮，申延利，韓志芳，賈永艷

河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

目的 優(yōu)化苦參總生物堿脂質(zhì)體的處方與工藝，制備苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠并研究其釋放機制。方法 運用薄膜分散法制備苦參總生物堿脂質(zhì)體，以包封率和載藥量為考察指標，采用酸性染料比色法測定脂質(zhì)體中苦參堿含量。采用正交試驗設(shè)計對處方工藝進行優(yōu)化，選出最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體。以泊洛沙姆-407為基質(zhì)，制備苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠?？疾焖幬锬z與藥物脂質(zhì)體凝膠的透皮速率。結(jié)果 通過優(yōu)化處方與工藝所得的脂質(zhì)體形態(tài)均勻，粒徑范圍為100～400 nm，包封率達74%，載藥量達26%。所制備的脂質(zhì)體凝膠呈透明狀半固體。體外釋放結(jié)果顯示，苦參堿凝膠48 h內(nèi)累積釋藥量為6.34 mg/cm2，苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠48 h內(nèi)累積釋藥量為6.97 mg/cm2，后者的累積透皮量、穩(wěn)態(tài)透皮速率及48 h后在皮膚中的蓄積量均較前者顯著提高。結(jié)論 優(yōu)化的制備工藝穩(wěn)定可行，制得的苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠質(zhì)量較好，可有效延緩藥物的釋放速率，提高藥物在體內(nèi)的蓄積量。

苦參總生物堿；脂質(zhì)體；凝膠

苦參總生物堿是苦參、山豆根的主要活性成分，因其具有抗菌消炎、抗病毒殺蟲等藥理活性，制成凝膠涂于黏膜能夠用于各種炎癥性婦科疾病的治療[1]。脂質(zhì)體凝膠是由磷脂、膽固醇及泊洛沙姆-407組成的載藥量大、包封率高的藥物載體，可增加藥物在皮膚滯留時間，有效地將藥物通過角質(zhì)層運送至皮膚更深層或血液循環(huán)，適合作為外用給藥和經(jīng)皮給藥的載體。為進一步提高藥物的治療效果，充分發(fā)揮藥效，本研究運用薄膜分散法制備苦參總生物堿脂質(zhì)體，采用正交試驗設(shè)計對處方工藝進行優(yōu)化。通過綜合考察指標，選出制備苦參總生物堿脂質(zhì)體的最優(yōu)處方。以泊洛沙姆-407為凝膠基質(zhì)[2]，制備苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠。通過酸性染料比色法測定脂質(zhì)體及凝膠中苦參總生物堿含量，運用Franz擴散池對其不同釋藥基質(zhì)的透皮速率進行研究。

1 儀器、試藥與動物

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-500DV超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），J2-MC高速低溫離心機（美國Beckman），T6新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），BSA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠），渦旋混合儀（美國Scientific Industries），NanoZS90型粒徑儀（馬爾文儀器），YB-P6智能透皮試驗儀（天津市弗蘭斯電子科貿(mào)有限公司）。

苦參堿對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號120519，純度≥98%），卵磷脂（天津市光復(fù)精細化工研究所），膽固醇（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠），泊洛沙姆-407（P407，美國BASF公司，批號50011254），無水乙醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），溴麝香草酚藍（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，稱取0.025 g，溶于pH 7.6緩沖液200 mL中，制成溴麝香草酚藍緩沖液[3]）；苦參（河南中原正信藥材有限公司，產(chǎn)地河南，批號20110115）；氯仿（天津市四友精細化學(xué)品有限公司），甲醇（天津市四友精細化學(xué)品有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，3周齡，河南省實驗動物中心，合格證號41003100001652。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參總生物堿的制備

取苦參飲片，用8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，減壓濃縮，過濾，過SP825大孔吸附樹脂柱，用水洗滌，水洗液棄去，50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏，減壓干燥，即得苦參總生物堿提取物，備用。

2.2 苦參總生物堿脂質(zhì)體的制備

運用薄膜分散法制備苦參總生物堿脂質(zhì)體。稱取卵磷脂和膽固醇適量，加入15 mL無水乙醇，超聲溶解后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45 ℃、轉(zhuǎn)速5級，除去乙醇溶劑，使卵磷脂和膽固醇的混合物在瓶壁上形成透明均勻的薄膜層。另取適量苦參總生物堿，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液30 mL，超聲溶解后倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，40 ℃攪拌水化一定時間，功率100 W水浴超聲10 min，即得乳白色偏黃的苦參總生物堿脂質(zhì)體混懸液。

2.3 包封率、載藥量的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密量取苦參堿對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.3.2 檢測波長的確定 取對照品溶液20 μL，置20 mL具塞試管中，用酸性染料比色法（加氯仿6 mL、溴麝香草酚藍緩沖液6 mL，劇烈振搖2 min后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置1 h，分取下層氯仿層）萃取，將氯仿溶液進行全波長掃描。取苦參總生物堿樣品及氯仿適量，同法操作。結(jié)果表明，溴代麝香草酚藍和苦參堿形成的離子對復(fù)合物在413 nm波長處有最大的吸收峰，空白處則無吸收，故選擇413 nm為苦參總生物堿的測定波長。

2.3.3 標準曲線與線性范圍 取“2.3.1”項下對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，可得濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的苦參堿對照品溶液，分別量取0.5 mL上述溶液置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染色法測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y＝2.907 5X＋0.068 1（r2＝0.999 6）。表明苦參堿在0.04～0.20 mg/mL范圍內(nèi)與其吸光度線性關(guān)系良好?？鄥⒖偵飰A含量以苦參堿含量計。

2.3.4 樣品測定 通過高速離心方法分離游離的苦參總生物堿與苦參總生物堿脂質(zhì)體。吸取苦參總生物堿脂質(zhì)體混懸液3 mL，置于超濾離心管中，7500 r/min[4]高速離心30 min，精密量取濾液1 mL置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度，代入標準曲線計算游離藥物量（W）。精密吸取0.15 mL脂質(zhì)體混懸液置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，放置1 d破乳后，精密量取上層清液1 mL置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度。代入標準曲線計算脂質(zhì)體混懸液中總藥物量（M）。按下列公式計算包封率和載藥量。

2.3.5 精密度考察 精密吸取同一破乳后的苦參總生物堿脂質(zhì)體溶液5份，每份1 mL，置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度，計算樣品含量，RSD＝1.98%，表明精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取破乳后苦參總生物堿脂質(zhì)體溶液1 mL，置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法分別在制備后0、10、20、30 min測定吸光度，結(jié)果RSD＝2.04%，表明苦參總生物堿脂質(zhì)體溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密吸取6份破乳后的苦參總生物堿脂質(zhì)體溶液0.5 mL，加入苦參堿對照品溶液0.5 mL（濃度32.5 μg/mL），置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度，計算平均回收率為105.91%，RSD＝3.07%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.4 脂質(zhì)體的處方與工藝優(yōu)化

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果及相關(guān)參考文獻[4]，以脂質(zhì)體載藥量、包封率兩者綜合作為指標，將對脂質(zhì)體載藥量和包封率有顯著影響的磷脂與膽固醇摩爾比（A）、磷脂與藥物的質(zhì)量比（B）、水化時間（C）作為考察因素，設(shè)計三因素四水平正交試驗，對脂質(zhì)體的制備工藝進行優(yōu)化[5]，因素水平見表2，試驗結(jié)果見表3、表4，方差分析見表5。由試驗結(jié)果可知，影響脂質(zhì)體包封率和載藥量綜合考察因素順序為：磷脂與膽固醇摩爾比（A）＞水化時間（C）＞磷脂與藥物的質(zhì)量比（B），而影響脂質(zhì)體包封率和載藥量綜合考察因素中，A的影響最大，其次是C，因此優(yōu)化的處方和工藝為A2B3C2?？梢缘贸隽字c膽固醇的摩爾比為2∶1，水化時間為2 h，磷脂與藥物質(zhì)量比為12∶1，此時苦參堿脂質(zhì)體的包封率和載藥量綜合評分最高。在此工藝條件下，制得的脂質(zhì)體粒徑分布范圍窄，粒徑均勻。

表2 正交試驗因素水平表

表3 苦參總生物堿脂質(zhì)體的包封率及載藥量（%）

表4 正交試驗安排與結(jié)果

表5 正交試驗結(jié)果方差分析

2.5 苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠與苦參總生物堿凝膠的制備

稱取10 mL苦參總生物堿脂質(zhì)體混懸液，加入2.5 g泊洛沙姆-407，放置于4 ℃冰箱內(nèi)24 h，使其充分溶脹，制得苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠劑[6]。稱取22.7 mg苦參總生物堿，同法制備苦參總生物堿凝膠劑。

2.6 苦參總生物堿2種釋藥基質(zhì)研究

2.6.1 離體鼠皮的制備 斷頸法處死小鼠，剔除腹部毛后剝?nèi)∑淦つw，除去皮下組織和脂肪，生理鹽水漂洗干凈，泡于生理鹽水中，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)使用。

2.6.2 擴散池條件 Franz擴散池透皮面積為2.8 cm2，接收池體積為18 mL，磁力攪拌速度為400 r/min，（37±1）℃恒溫水浴，接收液為磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，稱取磷酸氫二鈉4.369 3 g和磷酸二氫鈉1.216 9 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻，即得）。

2.6.3 體外透皮試驗 將預(yù)處理好的小鼠皮膚固定在擴散池與接收池之間，角質(zhì)層朝向供給池，接收液液面恰好與皮膚的下層接觸，要求接收液與皮膚之間沒有氣泡。平行做2份，每份給藥分別為0.5 g苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠、0.5 g苦參堿凝膠。開動電磁攪拌器和恒溫水浴，并保持速度為400 r/min、溫度37 ℃，分別于0.5、1、2、3、4、6、10.5、20、24、48 h將接收液全部取出（同時補充同溫、新鮮接收液）[7]。以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染色法測定吸光度，代入標準曲線，計算得苦參總生物堿的濃度（Ci），擴散池透皮面積為S，可求得其單位面積的累積釋放量（Q）。Q＝∑Qi?S－1（i＝0.5、1、2、3、4、6、10.5、20、24、48 h）。

將透皮吸收0.5～48 h所得累積釋放量Q、待釋放量對數(shù)Ln（100－Q）及累積釋放量對數(shù)LnQ與時間t、t1/2、Lnt分別按零級、一級、Higuchi和Ritger-Peppas方程處理，初步研究藥物的體外釋藥類型[8]。

結(jié)果表明，將數(shù)據(jù)進行模型擬合，苦參堿2種凝膠釋放擬合Ritger-Peppas模型較其他模型優(yōu)勢明顯?？鄥A脂質(zhì)體凝膠劑：LnQ＝0.667Lnt＋0.074，r2＝0.902，k＝1.95；苦參堿凝膠劑：LnQ＝0.553Lnt＋0.197，r2＝0.937，k＝1.74。說明苦參總生物堿2種凝膠在體內(nèi)的釋藥均遵循Ritger-Peppas釋放?？鄥⒖偵飰A脂質(zhì)體凝膠劑與苦參堿凝膠劑相比，在促進藥物透過皮膚角質(zhì)層及皮膚蓄積方面具有顯著效果[9]?？鄥⒖偵飰A凝膠平均累積蓄積量為0.96 mg，苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠平均累積蓄積量為1.95 mg，透皮釋放曲線見圖1。

圖1 苦參總生物堿2種凝膠的透皮釋放曲線

3 討論

本研究通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化苦參總生物堿脂質(zhì)體的處方和工藝為：磷脂與膽固醇摩爾比為2∶1，水化時間為2 h，磷脂與藥物質(zhì)量比為12∶1。優(yōu)化工藝條件下制備的苦參總生物堿脂質(zhì)體大小均勻，包封率和載藥量均較高。

在預(yù)試驗中，測量發(fā)現(xiàn)苦參堿在198 nm波長處也有最大吸收，但其溶劑磷酸鹽緩沖液在此波長附近有一定吸收，測量時會產(chǎn)生很大程度的干擾，且測量區(qū)域位于遠紫外區(qū)，對紫外測定條件非常不利[10]。運用液相進樣測定苦參堿耗時較長，經(jīng)查閱文獻，可用酸性染料比色法測定苦參堿的含量[3]，確定413 nm為測定波長，結(jié)果令人滿意。試驗過程中，樣品加入氯仿及pH 7.6溴麝香草酚藍緩沖液后，需要充分振搖，使萃取完全，從而使苦參堿和染色劑形成的離子對轉(zhuǎn)移到有機溶劑中。結(jié)果表明，選用酸性染料比色法簡便、準確、專屬性強，具有良好的線性關(guān)系，本方法可用于苦參總生物堿脂質(zhì)體的處方優(yōu)化、含量測定、質(zhì)量控制[11]。

在正交試驗前，對因素A、B、C進行了單因素考查，結(jié)果表明B中因素12∶1與15∶1無明顯差異，且相對于其他因素，對苦參總生物堿脂質(zhì)體處方與工藝優(yōu)化的結(jié)果不具有明顯的意義。因此，雖然12∶1已達到該因素的水平上限，為節(jié)約成本，提高載藥量，仍決定選用12∶1作為最優(yōu)方案。

結(jié)果表明，脂質(zhì)體能促進苦參總生物堿透過皮膚，與普通凝膠相比，其累積透皮量、穩(wěn)態(tài)透皮速率及48 h后在皮膚中的蓄積量都有顯著提高。這種優(yōu)勢可以使苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠應(yīng)用于臨床時，既避免了口服制劑的全身不良反應(yīng)，提高局部藥物濃度，透皮效果又高于普通凝膠。本試驗為苦參總生物堿脂質(zhì)體的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

粒徑小于200 nm的脂質(zhì)體較容易透過皮膚[12]，本試驗制得的脂質(zhì)體粒徑為158.6 nm，不影響苦參總生物堿脂質(zhì)體凝膠的透皮效果?？鄥⒖偵飰A脂質(zhì)體凝膠是一個值得研究且用途廣泛的藥物。

[1] 曾昭武,王小麗.苦參堿醇質(zhì)體的制備[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(41)：8107-8110.

[2] 郭咸希,何楊虎,何文,等.尼美舒利脂質(zhì)體凝膠的研制及體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)考察[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(1)：35-39.

[3] 楊毅恒,翟所迪.酸性染料比色法測定鞣苦膠囊中苦參總生物堿的含量[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2004,27(6)：63-65.

[4] 郭海燕,莫穗林.脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性和包封率的影響因素[J].中國新藥雜志,2004,13(6)：498-501.

[5] 趙玉美,高鵬飛,劉光明,等.苦參堿制劑的研究進展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2011,32(9)：72-74.

[6] 郭咸希,何楊虎,何文,等.尼美舒利脂質(zhì)體凝膠的研制及體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)考察[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(1)：35-39.

[7] 陳志明,宋金春.酮洛芬脂質(zhì)體凝膠的研制及體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)考察[J].中國藥師,2009,12(2)：159-162.

[8] 謝吉福.改良輔料Ⅱ及其緩釋性能的研究[D].廣州：廣東藥學(xué)院,2014.

[9] 袁玉霞.復(fù)方消痔納米乳原位凝膠的制備及其質(zhì)量標準研究[D].鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院,2014.

[10] 仵文英,劉碩,張抗懷,等.酸性染料比色法測定苦參堿脂質(zhì)體中苦參堿的含量[J].中國藥房,2005,16(22)：1734-1735.

[11] 李俐,馬穎哲,閆曉凱,等.超氧化物歧化酶脂質(zhì)體制備方法包封率的比較[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003,29(4)：535-536.

[12] 趙玉美,高鵬飛,劉光明,等.苦參堿制劑的研究進展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2011,32(9)：72-74.

Release Mechanism and Preparation of Liposome Gel of Total Alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix

ZHU Ling-yin, ZHENG Guan-tao, ZHOU Chang-ni, SHEN Yan-li, HAN Zhi-fang,

JIA Yong-yan (College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

Objective To optimize the formulation and process of liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix; To prepare the liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix and study its release mechanism. Methods Matrine liposomes was prepared by using film dispersion method; With entrapment efficiency and medicine loading as indexes, acid dye colorimetric method was used for the determination of matrine content in liposomes. Orthogonal design was used to optimize the formulation and the optimal formulation of liposomes was selected. Poloxamer-407 was set as the substrate preparation of matrine liposome gel. The transdermal rate of medicine gel and medicine liposome gel was investigated. Results Obtained through formulation and technology optimization of liposomes formation uniform, particle size was in the range of 100 nm to 400 nm, entrapment 74%, loading 26%. Preparation of liposome gel was transparent semisolid. In vitro results showed, cumulative release dose of matrine hydrogel was 6.34 mg/cm2within 48 h; cumulative release doses of liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix was 6.97 mg/cm2within 48 h; cumulative volume, steady-state penetration rate through skin and 48 h volume in the skin of the latter were significantly improved compared with that of the former. Conclusion Optimum preparation is reliable and practical. Liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix made by the preparation is with high quality, which can effectively delay the medicine release rate, increase the volume of medicine in human body.

total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix; liposomes; gel

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.019

R283.5

A

1005-5304(2017)01-0077-05

2015-12-16）

（

2016-03-21；編輯：陳靜）

河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習項目[YXCX（2014）23]

賈永艷，E-mail：hnzyjyy@126.com