非生物誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)半夏懸浮細(xì)胞中生物堿代謝的影響

段永波，魯放，崔婷婷，趙豐蘭，滕井通，盛瑋，張愛民，薛建平

淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000

非生物誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)半夏懸浮細(xì)胞中生物堿代謝的影響

段永波，魯放，崔婷婷，趙豐蘭，滕井通，盛瑋，張愛民，薛建平

淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000

目的 研究非生物誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）對(duì)半夏懸浮細(xì)胞系生物堿含量及相關(guān)酶活性的影響。方法 以葉柄來源的愈傷組織建立半夏懸浮細(xì)胞系，調(diào)查不同培養(yǎng)時(shí)間、MeJA和SA濃度對(duì)細(xì)胞中生物堿含量的影響，并分析生物堿合成相關(guān)酶（IMP脫氫酶、sAMP合成酶）的活性。結(jié)果 懸浮培養(yǎng)21 d時(shí)，懸浮細(xì)胞干重（DW）為培養(yǎng)前9倍，且生物堿總量為培養(yǎng)前3倍。MeJA和SA處理均能顯著促進(jìn)生物堿在半夏懸浮細(xì)胞中累積。150 μmol/L MeJA處理組生物堿含量為對(duì)照組3.6倍，達(dá)4.7 mg/g DW；50 μmol/L SA處理使懸浮細(xì)胞生物堿含量達(dá)到對(duì)照組的2.5倍。100 μmol/L MeJA和50 μmol/L SA處理使IMP脫氫酶比活力分別為對(duì)照組3.0、3.7倍，150 μmol/L MeJA和100 μmol/L SA處理使sAMP合成酶比活力分別為對(duì)照組2.6、4.4倍。結(jié)論 添加適量外源誘導(dǎo)子MeJA和SA能促進(jìn)半夏懸浮細(xì)胞中生物堿的累積。

半夏；懸浮細(xì)胞；生物堿；茉莉酸甲酯；水楊酸

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.為天南星科多年生草本植物，其藥用功效最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。半夏以塊莖入藥，具有燥濕化痰、止咳鎮(zhèn)痛的作用，已成為我國(guó)最常用的十大中藥之一[1]。半夏富含生物堿、β-谷甾醇、多糖、揮發(fā)性油等，其中生物堿被視為其主要活性成分[2]。在半夏生物堿中，胡蘆巴堿含量常被作為半夏質(zhì)量控制指示，肌苷則用作半夏的鑒別性成分[3-4]。

作為大宗中藥材，半夏年需求量達(dá)500～600萬kg，而野生和人工栽培產(chǎn)量?jī)H能滿足1/3，市場(chǎng)缺口很大[5]。自然狀態(tài)下，半夏極少進(jìn)行有性生殖，主要通過珠芽或塊莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，繁殖系數(shù)低[6]。長(zhǎng)期過度采伐導(dǎo)致野生半夏資源瀕于枯竭，而人工栽培依然面臨高溫、干旱、病蟲害以及人工成本等多方面因素的影響，難以滿足半夏藥材的市場(chǎng)需求。

懸浮細(xì)胞可在人為控制條件下實(shí)現(xiàn)活性功能成分的生產(chǎn)，為解決藥用植物資源不足和成本控制提供了新途徑[7]。茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）為重要的信號(hào)分子[8]，常被用于植物次生代謝途徑研究。本研究以半夏懸浮細(xì)胞系為研究對(duì)象，考察外源MeJA和SA對(duì)生物堿合成和相關(guān)代謝酶活性的影響，以期為利用半夏懸浮細(xì)胞系生產(chǎn)生物堿提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.4）、氯仿及溴麝草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）及鹽酸麻黃堿等試劑均為Sigma-Aldrich產(chǎn)品。試驗(yàn)所用半夏植株采自淮北市龍脊山自然風(fēng)景區(qū)（E-116°23′，N-34°14′），經(jīng)薛建平教授鑒定為宿半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit。

2 方法與結(jié)果

2.1 半夏懸浮細(xì)胞體系構(gòu)建

半夏愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋3%蔗糖＋2.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L KT＋0.65%瓊脂，pH 5.8；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基為MS＋3%蔗糖＋0.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L 2,4-D，pH 5.8[9]。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為25 ℃黑暗培養(yǎng)；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件為（23±1）℃，光照周期為14 h/10 h光暗交替，光照強(qiáng)度為3000 lx。

取半夏葉柄置于0.1%氯化汞浸泡6 min，無菌水潤(rùn)洗5次后剪成約1.0 cm長(zhǎng)段，接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于25 ℃黑暗培養(yǎng)。3周后獲得愈傷組織，將所獲愈傷組織繼代培養(yǎng)3～5次。選取質(zhì)地松脆的顆粒狀愈傷接種至液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)（100 r/min），每15 d更換新培養(yǎng)基，直至獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。將所獲細(xì)胞系在8 ℃低溫處理24 h，然后于25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)36 h使細(xì)胞周期同步。之后在23 ℃培養(yǎng)9 d使同步化細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得半夏懸浮細(xì)胞系。

2.2 鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取10 mg鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶解于氯仿中，定容至50 mL，搖勻，得0.20 mg/mL鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液。精密吸取0、1、2、3、4、5 mL至分液漏斗內(nèi)，添加蒸餾水補(bǔ)至5 mL，分別精密加入5 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.4）、10 mL氯仿及1 mL溴麝草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振搖后靜置1 h，分取氯仿層，水層再用氯仿重復(fù)萃取2次，每次10 mL。合并氯仿層，60 ℃水浴回收至干，用氯仿溶解，定容至10 mL[10]。于414 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度。以鹽酸麻黃堿濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝0.062C－0.076 8，r2＝0.996 0（n＝5）。

2.3 生物堿含量測(cè)定

整個(gè)培養(yǎng)周期持續(xù)28 d，每隔7 d取樣，所獲樣品立即保存于-70 ℃冰箱供測(cè)試分析。將所收集懸浮細(xì)胞樣品于50 ℃干燥后研磨成粉。準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品粉末置于25 mL具塞試管中，加濃氨水0.5 mL潤(rùn)濕，加氯仿10 mL后于4 ℃冷浸3 h；冰浴超聲提取1 h后過濾，殘?jiān)?0 mL氯仿分3次（4、3、3 mL）洗滌；將濾液與洗液合并，回收氯仿至干，加入10 mL氯仿使其溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL分液漏斗中，精密加入5 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.4）和1 mL溴麝香草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振搖后，靜置1 h。分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次10 mL。合并氯仿層，回收至干，殘留物用氯仿溶解，置于10 mL容量瓶中，并用氯仿定容、搖勻，即得處理組溶液[11]。取待測(cè)溶液2.0 mL，用DU730 Beckman Coulter核酸蛋白分析儀測(cè)其吸光度，代入鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算生物堿的含量。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)懸浮細(xì)胞系生物量和生物堿含量的影響

2組患者干預(yù)前的步行功能狀況比較P>0.05,干預(yù)后,2組患者的步行功能狀況均得到改善,且實(shí)驗(yàn)組患者的步行功能狀況顯著優(yōu)于常規(guī)組患者,P<0.05。見表1:

以半夏葉柄為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，獲得半夏懸浮細(xì)胞系。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞干重總體呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在21 d時(shí)細(xì)胞干重為培養(yǎng)前9倍，之后有所下降（見圖1）；生物堿含量在培養(yǎng)7 d內(nèi)含量較低，到14 d時(shí)顯著增加，21 d時(shí)最高，達(dá)到1.56 mg/g DW，之后生物堿含量開始降低（見圖2）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過28 d后，懸浮細(xì)胞會(huì)逐漸變?yōu)楹稚?，開始?jí)乃馈８鶕?jù)細(xì)胞生物量和生物堿含量測(cè)定結(jié)果，選擇21 d作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)半夏懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)半夏懸浮細(xì)胞生物堿含量的影響

2.5 茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)生物堿含量的影響

試驗(yàn)用MeJA和SA濃度均為0、50、100、150、200 μmol/L。MeJA處理對(duì)半夏懸浮細(xì)胞系生物堿含量有顯著影響。除50 μmol/L處理外，所試其他MeJA濃度均顯著促進(jìn)半夏生物堿合成。以150 μmol/L MeJA處理組最高，達(dá)到4.7 mg/g DW。150 μmol/L MeJA處理組的生物堿含量為對(duì)照組的3.6倍。在SA處理中，50和100 μmol/L可顯著提高半夏懸浮細(xì)胞系中生物堿的合成，更高濃度的SA則能促進(jìn)生物堿的累積。50 μmol/L SA處理組生物堿含量最高，為對(duì)照組的2.5倍。結(jié)果見圖3。

圖3 MeJA和SA對(duì)半夏懸浮細(xì)胞生物堿含量的影響

2.6 茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)IMP脫氫酶和sAMP合成酶活性的影響

在添加不同濃度MeJA或SA培養(yǎng)21 d后，測(cè)定半夏懸浮細(xì)胞中IMP脫氫酶和sAMP合成酶活性。取不同濃度外源激素的半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞各1.0 g置于預(yù)冷的研缽中，加提取介質(zhì)在冰浴中研磨勻漿，4 ℃、1000 r/min離心15 min，上清液為酶粗提取液。將上述酶提取液加入相應(yīng)的酶反應(yīng)液，每隔30 s讀取吸光度值。酶活性以比活力表示，定義為1 min內(nèi)1 mg蛋白所能引起的吸光度值變化的1000倍[5]。

添加MeJA或SA均對(duì)IMP脫氫酶活性有顯著影響。50～150 μmol/L MeJA為對(duì)照組IMP脫氫酶活性2.6～3.1倍，當(dāng)MeJA濃度增加至200 μmol/L時(shí)，酶活性有所下降；50 μmol/L SA處理對(duì)IMP脫氫酶活性影響最大，酶活性為對(duì)照組3.7倍，隨濃度增加酶活性逐漸下降。結(jié)果見圖4。

圖4 MeJA和SA對(duì)半夏懸浮細(xì)胞IMP脫氫酶活性的影響

對(duì)于sAMP合成酶，50 μmol/L MeJA對(duì)酶活性無顯著影響（P＞0.05），而較高濃度的MeJA顯著提高酶活性（P＜0.05）。100、150、200 μmol/L MeJA分別為對(duì)照組sAMP合成酶活性2.2、2.6、1.9倍。在所測(cè)試SA濃度中，50～200 μmol/L SA均顯著促進(jìn)酶活性的升高，最高值出現(xiàn)在100 μmol/L SA處理組，酶活性為對(duì)照組4.4倍，之后隨著SA濃度增加，酶活性逐漸下降，但至200 μmol/L濃度時(shí)，sAMP合成酶活性依然顯著高于對(duì)照組。結(jié)果見圖5。

圖5 MeJA和SA對(duì)半夏懸浮細(xì)胞sAMP合成酶活性的影響

3 討論

生物堿為重要的次生代謝物，是許多藥用植物的主要活性成分。目前多種藥用植物細(xì)胞內(nèi)生物堿合成及代謝規(guī)律逐步得以揭示，對(duì)于研究這些植物的藥用成分意義重大[12]。在諸多研究模式中，懸浮細(xì)胞系的應(yīng)用極為廣泛[13-14]，因其可為藥用成分的生產(chǎn)提供另一途徑，有助于解決藥用植物產(chǎn)量的缺口，獲得更高質(zhì)量的產(chǎn)品，同時(shí)保護(hù)野生資源。

本研究以葉柄來源的愈傷組織建立半夏懸浮細(xì)胞系，考察不同培養(yǎng)時(shí)間、MeJA和SA濃度對(duì)細(xì)胞中生物堿含量的影響，并分析生物堿合成相關(guān)酶活性。

在懸浮培養(yǎng)21 d時(shí)，半夏懸浮細(xì)胞干重增加了9倍，懸浮細(xì)胞中生物堿總量為培養(yǎng)0 d時(shí)的3倍，與Zhao J等[15]報(bào)道長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)增殖結(jié)果接近。生物堿作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其合成通常在細(xì)胞培養(yǎng)后期進(jìn)行。添加較低濃度MeJA或SA不會(huì)影響半夏懸浮細(xì)胞的增殖，這在麻花艽懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中同樣得到驗(yàn)證[16]。同時(shí)，培養(yǎng)3周左右通常需要更換新鮮培養(yǎng)基，以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分并減少壞死細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的影響。因此，確定懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)時(shí)間為21 d用于不同誘導(dǎo)子對(duì)生物堿累積影響的研究。

MeJA或SA作為重要的誘導(dǎo)子已用于萜類化合物等生物堿的代謝研究[17]。本研究表明，MeJA或SA處理均能顯著促進(jìn)生物堿在半夏懸浮細(xì)胞中累積。培養(yǎng)21 d后，150 μmol/L MeJA處理組生物堿含量為對(duì)照組3.6倍，50 μmol/L SA處理組懸浮細(xì)胞生物堿含量達(dá)到對(duì)照組的2.5倍。同時(shí)測(cè)定了生物堿中嘌呤核苷酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶IMP脫氫酶和sAMP合成酶活性的變化情況。添加MeJA或SA均能顯著提高二者的酶活性。100 μmol/L MeJA、50 μmol/L SA處理使IMP脫氫酶活性分別為對(duì)照組3.0、3.7倍，150 μmol/L MeJA、100 μmol/L SA處理使sAMP合成酶活性分別為對(duì)照組2.6、4.4倍。比較生物堿累積量及所測(cè)代謝酶活性變化情況發(fā)現(xiàn)，生物堿累積與所測(cè)代謝酶活性變化趨勢(shì)較一致，說明IMP脫氫酶及sAMP合成酶在半夏生物堿代謝中具有較為重要的作用。

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Effects of Abiotic Elicitors MeJA and SA on Alkaloids Accumulation and Related Enzymes Metabolism in Pinellia ternata Suspension Cell Cultures

DUAN Yong-bo, LU Fang,

CUI Ting-ting, ZHAO Feng-lan, TENG Jing-tong, SHENG Wei, ZHANG Ai-min, XUE Jian-ping (Key Laboratory of Resource Plant Biology of Anhui Province, College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

Objective To study the effects of abiotic elicitors methyl jasmonate (MeJA) and salicylic acid (SA) on the alkaloids accumulation and related enzymes metabolism in Pinellia ternata suspension cell cultures. Methods Using the leaf petioles-derived suspension cell cultures as the study object, the culture duration, concentrations of MeJA and SA were determined to get the optimal alkaloids accumulation, and the activities of metabolic enzymes IMP dehydrogenase and sAMP synthase were also measured. Results A 9-fold of dried biomass and a 3-fold of alkaloids accumulation were observed in P. ternata suspension cell cultures after culture for 21 d. Both MeJA and SA could significantly promote the accumulation of alkaloids in P. ternata suspension cells. 150 μmol/L MeJA enhanced alkaloids content (4.7 mg/g DW) by 3.6 folds in comparison with control group, whereas 50 μmol/L SA showed a 2.5-fold increase. Meanwhile, 100 μmol/L MeJA and 50 μmol/L SA promoted the increase in IMP dehydrogenase activity by 3.0 and 3.7 fold respectively, and 150 μmol/L MeJA and 100 μmol/L SA showed the increase by 2.6 and 4.4 fold respectively. Conclusion Proper adding exogenous MeJA and SA can promote the accumulation of alkaloids in Pinellia ternata suspension cell cultures.

Pinellia ternata; suspension cell cultures; alkaloids; methyl jasmonate; salicylic acid

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.021

R282.6

A

1005-5304(2017)01-0087-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31501368、81573518）；安徽省自然科學(xué)基金（1408085MC58、1608085MC52）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2016B016、KJ2015ZD35）

薛建平，E-mail：xuejp@163.com