基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討青蒿琥酯治療獲得性免疫缺陷綜合征的作用機(jī)制?

馬 沖，張洪岐，劉 穎

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥防治艾滋病中心，北京 100700)

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵犯人體免疫系統(tǒng)，發(fā)生各種機(jī)會性感染和腫瘤的綜合征。截至2020年10月底，我國報告現(xiàn)存HIV/AIDS患者104.5萬例，當(dāng)年新增HIV感染者11.2萬例[1]。抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)能夠有效控制HIV復(fù)制，延長患者壽命，但HIV對T細(xì)胞的直接作用導(dǎo)致的異常免疫激活可造成疾病進(jìn)展[2]。此外，免費藥物種類稀少、治療依從性不佳及藥物不良反應(yīng)等問題，也對AIDS的治療造成一定的影響[3]。目前，中西醫(yī)結(jié)合治療正越來越多地應(yīng)用于AIDS患者的治療中，具有較好的療效和治療優(yōu)勢[4]。

青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素衍生物，具有抗瘧、抗腫瘤、抗病毒及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用[5]，是經(jīng)濟(jì)、高效、低毒的抗瘧用藥。此外，青蒿琥酯也是有效的免疫抑制劑，對多種免疫性疾病具有較好的治療作用。對感染猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)的中國恒河猴模型的研究顯示，青蒿琥酯可調(diào)控CD4+T細(xì)胞極化，抑制輔助T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)的細(xì)胞增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulator T cell，Treg)增殖[6]，促進(jìn)Th17/Treg平衡[7]，改善T細(xì)胞免疫異常激活[2]。本課題組在國家“十三五”科技重大專項臨床研究中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠改善AIDS患者CD4細(xì)胞計數(shù)水平，促進(jìn)患者免疫功能重建。由此可見，青蒿琥酯對于AIDS患者免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制尚不清晰。為此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科交融的研究角度，探索青蒿琥酯治療AIDS的分子機(jī)制。

1 方法

1.1 青蒿琥酯靶點獲取

本研究的藥物名稱為青蒿琥酯片，通過藥物說明書及相關(guān)文獻(xiàn)可知其化學(xué)成分為青蒿琥酯，故僅針對青蒿琥酯的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點篩選。應(yīng)用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索其分子結(jié)構(gòu)，并獲得其2 D結(jié)構(gòu)圖，將2 D結(jié)構(gòu)圖上傳至Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[8-10]，與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[11]，以獲得化合物的蛋白質(zhì)靶點，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將蛋白質(zhì)靶點進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 AIDS靶點獲取

以“acquired immune deficiency syndrome”為關(guān)鍵詞在GeneCards(https://www.genecards.org/)[12]、OMIM(https://omim.org/)[13]、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[14]、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)[15]進(jìn)行潛在靶點挖掘。在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點時，Score值越高表明靶點與疾病關(guān)系越密切，因此若靶點過多，則根據(jù)經(jīng)驗選取大于Score中位數(shù)的潛在靶點，之后將4個數(shù)據(jù)庫的靶點進(jìn)行合并，刪除重復(fù)值后獲得AIDS靶點。

1.3 青蒿琥酯-AIDS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為明確青蒿琥酯與AIDS之間的相互作用，應(yīng)用VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，并獲取二者交集靶點。將交集靶點上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)[16]，以此構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最小互作閾值設(shè)定為“medium confidence(>0.4)”，余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置。獲取結(jié)果后保存為TSV文件，導(dǎo)入至Cytoscape3.8.2，利用MCODE插件進(jìn)行模塊化分析，對其特征進(jìn)行分析，篩選核心模塊。

1.4 青蒿琥酯-AIDS靶點功能與通路的富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)聚集了各種公共基因組資源，集成度高且注釋數(shù)據(jù)覆蓋全面[17，18]。將青蒿琥酯-AIDS交集靶點提交至DAVID數(shù)據(jù)平臺，進(jìn)行GO富集分析(生物過程、細(xì)胞組成、分子功能)及KEGG富集分析，探索其潛在作用的生物學(xué)過程及代謝通路，并對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯結(jié)構(gòu)及靶點

初步獲取青蒿琥酯靶點373個，合并剔除重復(fù)值后共獲取靶點333個(見圖1)。青蒿琥酯2D結(jié)構(gòu)圖(見圖2)。

2.2 AIDS相關(guān)靶點

由GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得AIDS相關(guān)靶點7761個，根據(jù)Score值中位數(shù)限定靶點選取范圍，如中位數(shù)為23.34則設(shè)定Score>23.34的靶點為AIDS潛在靶點。結(jié)合OMIM、DRUGBANK、TTD數(shù)據(jù)庫合并相關(guān)靶點，剔除重復(fù)值后共獲得1040個AIDS相關(guān)靶點。

2.3 青蒿琥酯-AIDS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選結(jié)果

篩選青蒿琥酯靶點與AIDS靶點后選取二者交集靶點，并繪制韋恩圖，得到青蒿琥酯-AIDS交集靶點85個(見圖3)。進(jìn)而將交集靶點上傳至STRING11.0平臺獲得青蒿琥酯-AIDS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，共85個節(jié)點562條連接(見圖4)。利用Cytoscape中MCODE插件進(jìn)行模塊化分析，篩選出4個核心模塊(A、B、C、D)，其聚類評分依次為13.75、5.83、4、4，此結(jié)果表明核心模塊中靶點對其他節(jié)點具有較大影響力(見圖5)。

圖3 青蒿琥酯-AIDS靶點韋恩圖

圖4 青蒿琥酯-AIDS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 青蒿琥酯-AIDS核心靶點模塊

2.4 青蒿琥酯-AIDS的GO富集分析與KEGG富集分析

應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫對青蒿琥酯治療AIDS的相關(guān)靶點進(jìn)行富集分析，借助網(wǎng)絡(luò)繪圖平臺對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析。GO富集分析顯示，該類靶點涉及的生物過程主要包括肽基絡(luò)氨酸磷酸化、信號傳導(dǎo)、DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞遷移、血小板活化、凝血等方面(見圖6A)；細(xì)胞組成主要包括胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜、膜筏、核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、核染色質(zhì)等(見圖6B)；分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、受體活性、受體結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等(見圖6C)。KEGG富集分析顯示，青蒿琥酯治療AIDS涉及的通路主要包括缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路、叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box transcription tactor O，F(xiàn)oxO)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3/kinase-protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路、大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus，Ras)信號通路、Ras相關(guān)蛋白1(ras related protein 1，Rap1)信號通路、趨化因子信號通路等(見圖6D)，靶點通路結(jié)果(見表1)。

表1 青蒿琥酯治療AIDS相關(guān)靶點通路富集結(jié)果

注：A：GO-BP分析；B：GO-CC分析；C：G0-MF分析；D：KEGG分析

3 討論

我國AIDS的防控與治療已取得了長足的進(jìn)步，目前HIV/AIDS處于低流行趨勢[1]。ART的出現(xiàn)使得AIDS逐漸成為一種慢性、可控性疾病，AIDS患者生存期逐漸延長，生活質(zhì)量明顯提高，但是我國AIDS治療也面臨著較多的困難，長期治療使得患者老年化伴隨的合并癥、ART藥品種類少、抗病毒藥物花費大及耐藥等問題日益突出[19]。中醫(yī)藥在改善AIDS患者癥狀、免疫功能及不良反應(yīng)等方面不斷進(jìn)行探索，并取得了一定的成果[20，21]。因此，從中醫(yī)藥領(lǐng)域探索AIDS的補(bǔ)充與替代治療，開發(fā)中醫(yī)藥治療的新藥和新方法，或許能夠成為AIDS研究的重要方向。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于疾病-基因-靶點-藥物作用網(wǎng)絡(luò)，通過分析平臺、中藥數(shù)據(jù)庫、靶標(biāo)預(yù)測技術(shù)等，系統(tǒng)揭示藥物與人體相互作用的機(jī)制[22]，在中藥機(jī)制研究、新藥發(fā)現(xiàn)、藥物重新定位及不良反應(yīng)等方面具有較大的應(yīng)用價值[23，24]。本研究共收集333個藥物靶點及1040個疾病靶點，映射后獲得85個潛在作用靶點562條相互作用關(guān)系。通過核心模塊篩選獲得雌雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、核受體亞家族3C組成員1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)、胱天蛋白酶3(Caspase 3，CASP3)、磷脂酰肌醇激酶-3催化亞單位α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等核心基因。研究顯示，ESR1可直接抑制HIV轉(zhuǎn)錄[25]，NR3C1、CASP3能夠限制HIV的復(fù)制[26，27]，EGFR、AKT-1、STAT3等對HIV-1具有潛在的激活作用[28]。由此可見，青蒿琥酯可能通過調(diào)控以上靶點的作用治療AIDS。

本研究通過富集分析顯示，青蒿琥酯治療AIDS主要涉及HIF-1、FoxO、PI3K/Akt、Ras、Rap1及趨化因子信號通路等。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞周期、HIV潛伏、調(diào)節(jié)線粒體及Treg細(xì)胞等方面具有重要作用[29，30]。HIV-1包膜蛋白(env)與宿主細(xì)胞表面CD4的相互作用首先激活PI3K/Akt信號通路，隨后HIV-1包膜糖蛋白(gp120)與宿主細(xì)胞表面的輔助受體(CCR5/CXCR)相互作用，使得跨膜糖蛋白(gp41)發(fā)生構(gòu)象變化，從而誘導(dǎo)膜融合，使介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)[31]。在T細(xì)胞中，抗原受體(T cell receptor，TCR)與CD28可導(dǎo)致PI3K激活，導(dǎo)致質(zhì)膜磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)中肌醇環(huán)的3-羥基磷酸化生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3充當(dāng)Akt及其上游激活劑PDK1質(zhì)膜對接位點，促使Akt激活，mTOR的磷酸化可促進(jìn)Akt最大限度激活，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，之后p-Akt通過抑制FoxO1活性而抑制記憶CD8T細(xì)胞的形成和T細(xì)胞多個階段的功能[32]。此外，PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞及線粒體功能方面具有負(fù)反饋作用，抑制PI3K/Akt信號通路，可恢復(fù)Treg細(xì)胞及線粒體功能[33-35]。本研究顯示，諸如FoxO、HIF-1、Ras等信號通路也在青蒿琥酯治療HIV/AIDS中發(fā)揮重要作用。FoxO家族能夠通過控制B淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的發(fā)育及功能，維持免疫穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)oxO失活可導(dǎo)致慢性炎癥及自身免疫[36]，介導(dǎo)FoxO信號通路相關(guān)蛋白被上調(diào)后，可促進(jìn)HIV-1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在生產(chǎn)性感染期間凋亡[37]，促進(jìn)免疫功能恢復(fù)。Ras信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、運動等過程[38]，HIV-1 Tat通過激活Ras信號通路促進(jìn)AIDS相關(guān)性癡呆的發(fā)生發(fā)展[39]。同時研究表明，通過Ras信號通路基因表達(dá)的差異可對ART中斷后的CD4+T細(xì)胞下降程度進(jìn)行預(yù)測[40]。HIF-1信號通路受在HIV-1感染的外周血單個核細(xì)胞中的幾種下調(diào)miRNA調(diào)控，HIF信號通路中的HIF-1α可與缺氧反映元件(hypoxia-responsive element，HRE)結(jié)合，導(dǎo)致諸多凋亡通路相關(guān)基因上調(diào)，從而促使CD4+T細(xì)胞凋亡[41]，使AIDS患者免疫功能進(jìn)一步下降，推進(jìn)疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索了青蒿琥酯治療AIDS的靶點及其相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測青蒿琥酯可通過不同生物學(xué)過程及信號通路發(fā)揮作用，體現(xiàn)了多通路、多靶點以及相互作用的特點，為進(jìn)一步開展青蒿琥酯治療AIDS的臨床及動物研究提供了科學(xué)依據(jù)，也為青蒿琥酯在AIDS治療中的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的局限性以及青蒿琥酯治療AIDS的研究正處于發(fā)展階段，使得本研究存在一定的不足，仍需進(jìn)一步深入探索。