基于代謝組學的中藥抗大腸癌研究?

王雅楠，王奇鈺，張治寬，鄒 敏，屈蓮平，石彩冬，高 峰

(1.甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院結直腸肛門外科，蘭州 730050)

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第三，死亡率位居第二[1]。據(jù)中國2015年癌癥發(fā)病率和死亡率報告顯示，中國大腸癌的年齡標準化發(fā)病率和死亡率分別為17.81/10萬和8.12/10萬，發(fā)病率和死亡率分別位居第四五位[2]，已成為癌癥相關死亡的主要原因之一。在治療大腸癌方面，中藥具有逆轉放化療耐藥性、調節(jié)免疫功能、誘導細胞凋亡、提高放化療敏感性、降低放化療毒副反應等明顯優(yōu)勢[3-5]，近年來成為人們關注的熱點。

大腸癌的早期診斷是影響病人預后的關鍵因素[6]。目前對大腸癌的有效診斷仍依賴于腸鏡檢查，但由于大腸癌早期的無明顯癥狀、腸鏡是侵入性檢查的影響以及患者依從性差等因素[7，8]，使得早期診斷變得非常困難。因此，尋求更簡易有效的篩查方法對大腸癌的早期診斷具有重要意義。隨著生物技術的不斷發(fā)展，尤其是與癌癥有關代謝組學技術的快速推進，為大腸癌的診斷和治療帶來了新的可能。

1 代謝組學技術平臺

代謝組學是位于基因組學、轉錄組學、蛋白組學的下游，通過對特定時間生物機體內所有內源性低分子量代謝物(<1.5 kDa)的定性及定量分析，研究這些代謝物含量變化與機體生理病理變化之間的關系，發(fā)現(xiàn)生物標志物以及尋找機體代謝機制的學科，屬于系統(tǒng)生物學范疇[9-11]。以代謝組為研究對象，可以分析在不同的生理病理狀態(tài)下，機體的血清/血漿、糞便、尿液、組織等樣本內代謝物的差異，從而闡明差異性代謝物的功能。研究這些差異性代謝物在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用，對疾病的診斷和治療具有重要意義[12]。

目前核磁共振譜(nuclear magnetic resonance，NMR)和質譜(mass spectrum，MS)是常用的2種代謝物測定技術，在代謝物測定中占據(jù)主導地位[13]。NMR具有所需樣本含量少、高度重復性和非破壞性，一度被公認為代謝物測定中的“金標準”。基于MS技術的代謝組學具有高選擇性和高靈敏性的優(yōu)勢，可以識別代謝物并對所識別代謝物進行定性和定量分析[14，15]。近年來，由于人體復雜的生物系統(tǒng)以及需要滿足血清/血漿、組織、尿液、糞便等多樣本的測定，高通量[16]、高靈敏度[17]和高選擇性[18]的代謝物測量技術，如氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、液相色譜-質譜(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)、超高效液相色譜-質譜(ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS)、超高效液相色譜-四極飛行時間-質譜等[19,22]得到了廣泛的應用。

2 基于代謝組學的大腸癌代謝組研究

為了更加全面、準確地測量有關大腸癌代謝物差異，研究者分別選取不同的樣本進行測定，各樣本下具體代謝物的變化詳(見表1)。

2.1 血清/血漿樣本

大腸癌代謝組學研究中，以血清/血漿作為檢測樣本最為常見。在大腸癌血清代謝組學的臨床研究中，Hashim等[20]對使用了不同分析平臺、不同國家人群的9項血清/血漿代謝組學研究進行質量評價，結果顯示糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TCA)循環(huán)、無氧呼吸、蛋白質生物合成、脂質代謝和谷胱甘肽代謝的代謝物水平在大腸癌患者和對照樣本之間有顯著差異。在該9項研究發(fā)現(xiàn)的許多代謝物中，共有11種一致性代謝物，分別為丙酮酸、葡萄糖、乳酸、蘋果酸、富馬酸、3-羥基丁酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、肌酐和鳥氨酸。雖然使用不同的分析平臺以及不同的人群樣本，但其共同代謝物的一致性失調也為大腸癌代謝物層面的診斷和治療提供了可能。Ariadna 等[21]通過高分辨率液相色譜質譜(liquid-chromatography coupled to high-resolution mass spectrom，LC-HRMS)法對轉移性大腸癌患者和健康人血清的代謝物進行研究，發(fā)現(xiàn)患者和健康人血清中的內源性大麻素、鞘磷脂和甘油磷脂代謝有關的脂質種類代謝物水平出現(xiàn)差異，指出大腸癌的發(fā)展可能與這些脂質的種類變化相關。Lee等[22]通過LC-MS法對大腸癌患者術前術后血清標本之間代謝產物的差異性進行對比，發(fā)現(xiàn)鞘脂代謝途徑、類固醇生物合成途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑中的代謝物出現(xiàn)了顯著差異，且術后患者血清中腐胺濃度明顯低于術前，提示腐胺可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。Gu等[23]通過核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR)對大腸癌患者和健康者血清的代謝物進行研究分析，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者相比健康人血清主要的異常代謝途徑為糖酵解，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷氨酰胺和谷氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，并報道了大腸癌患者的代謝標志物。這些異常代謝途徑和代謝標志物與Li等[24]在大腸癌早期代謝標志物研究中的報道相一致，表明這些代謝標記物有望用于對大腸癌的診斷以及作為輔助治療指標。

2.2 組織樣本

外科手術中采集的組織樣本也是大腸癌代謝組學研究中的重要部分。在大腸癌組織代謝組學的臨床研究中，KIBI等[25]通過GC-MS和LC-MS方法對10例大腸癌患者的腫瘤和正常黏膜組織進行代謝組學分析，研究發(fā)現(xiàn)組織樣本中與糖酵解、磷酸戊糖途徑、谷胱甘肽生物合成和色氨酸、犬尿氨酸途徑有關的中間產物含量明顯升高。該研究還發(fā)現(xiàn)，與細胞增殖至關重要的色氨酸含量明顯降低，認為癌細胞可能通過抑制色氨酸來完成自身的快速增殖。Li等[26]使用1H-NMR法對小鼠大腸癌(CT-26)肺轉移模型代謝譜的研究中發(fā)現(xiàn)，糖酵解、TCA循環(huán)、谷氨酰胺分解、膽堿代謝和絲氨酸生物合成途徑中存在代謝紊亂，模型組組織樣本較正常組組織樣本中乳酸的含量顯著增加，提示乳酸可能有利于增加癌細胞的轉移能力。Satoh等[27]在大腸癌的正常和腫瘤組織代謝物研究中也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織較正常組織中乳酸含量增加，谷氨酰胺代謝水平下降，這2項研究結果呈現(xiàn)一致性[26，27]，表明這些途徑中相關代謝物的差異性變化可能用于大腸癌發(fā)生肺轉移的診斷指標，為診斷大腸癌的肺轉移提供了依據(jù)。

2.3 糞便/尿液樣本

在有關大腸癌糞便代謝組學的臨床研究中，Clos-Garcia等[28]在使用UHPLC-MS法對大腸癌患者糞便樣本代謝組的研究中發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者糞便中膽固醇酯和鞘磷脂水平的差異。Kim等[29]通過UHPLC-MS法對大腸腺瘤患者糞便代謝組學特征的研究中發(fā)現(xiàn)，腺瘤患者糞便代謝物中脂質代謝、鞘磷脂代謝、次級膽汁酸、嘌呤代謝以及多不飽和脂肪酸均異常于正常人。Yang 等[30]通過GC-MS法對大腸癌患者糞便代謝組的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白質生物合成、氨循環(huán)和半乳糖代謝途徑中的代謝物異常于正常人。該研究還報道了在大腸癌患者糞便中，減少的代謝物(糖和長鏈脂肪酸)的數(shù)量比增加的代謝物(氨基酸和多胺)數(shù)量更多，說明正常人較大腸癌患者具有更好地維持碳水化合物代謝和腸道內環(huán)境的能力。值得注意的是，該研究中報道的大腸癌患者糞便代謝物中脫氧膽酸含量較正常人代謝含量降低，這與其他報道不一致[29-31]。脫氧膽酸被證實與大腸癌腫瘤的發(fā)展相關，具有促腫瘤作用[32]。在有關大腸癌尿液代謝組學的臨床研究中，Kim等[33]使用NMR法對晚期大腸腺瘤和早期大腸癌患者的尿液標本進行代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)丙氨酸、?；撬岷?-氨基異丁酸有可能是成為準確診斷的標志性代謝物，這些代謝物都與能量代謝途徑有關。

在大腸癌代謝組學研究中，在不同的檢測標本下發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者和健康人的代謝物、模型組與正常對照組代謝物之間均存在差異性。本研究總結了基于代謝組學研究方法得到的潛在大腸癌差異性代謝物(見表1)。

表1 大腸癌差異性代謝物總結比較

本研究總結基于代謝組學技術分析大腸癌代謝物代謝水平變化的文獻共15篇，其中血清樣本7篇，組織樣本3篇，糞便樣本4篇，尿液樣本1篇。通過總結文獻發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者與正常人、模型組與正常對照組體內代謝物含量均具有明顯差異。文獻中出現(xiàn)頻率≥3次的一致性差異代謝物有6種，與正常組比較丙酮酸、乳酸和谷氨酸代謝水平升高，色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺代謝水平降低。文獻中出現(xiàn)2次的一致性代謝差異物有15種，其中葡萄糖、3-羥基丁酸、肌酐、蘇氨酸、膽堿、醋酸、胸腺嘧啶、黃嘌呤、腺嘌呤、前列腺素E2、異亮氨酸、絲氨酸和丙氨酸代謝水平在患病后顯著升高，而患者大麻素和琥珀酸代謝水平降低。結果提示，這21種差異性代謝物有可能作為潛在的大腸癌生物標記物，也可能作為潛在的抗大腸腫瘤藥物的藥效評價標記物，用于大腸癌的診斷及治療。通過相關代謝路徑分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌細胞主要通過影響體內糖酵解、TCA循環(huán)、蛋白質代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝和磷脂代謝等一種或多種代謝途徑來完成自身能量的供給和快速增殖。

3 基于代謝組學的中藥抗結直腸腫瘤機制研究與藥效評價

3.1 紫草素

Chen等[34]研究了紫草素對裸鼠移植瘤模型的抗腫瘤作用，并報道了紫草素抗結腸癌的代謝作用機制。對體外使用紫草素干預的SW-620大腸癌腫瘤細胞實驗組進行代謝組學分析，結果提示紫草素通過嘌呤代謝、谷胱甘肽代謝、精氨酸生物合成和β-丙氨酸代謝途徑影響SW-620細胞生長。利用SW-620細胞建立裸鼠移植瘤模型開展的體內研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠顯著抑制小鼠腫瘤生長，進一步的代謝組學分析鑒定出23種差異性顯著的代謝物。對比發(fā)現(xiàn)，在紫草素的干預下，腺嘌呤和腺苷兩種代謝物在體內和體外的嘌呤代謝均呈現(xiàn)下調趨勢。結果證實，紫草素具有明顯的抗大腸癌腫瘤作用，其作用機制可能與嘌呤代謝、谷胱甘肽代謝、氨基酸代謝和甘油磷脂代謝紊亂有關。

Chen等[35]研究了紫草素對結直腸患者的異種移植小鼠模型的抗腫瘤作用。對經紫草素治療組和模型組小鼠的腫瘤組織和血清進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，治療組小鼠組織中有32個差異性代謝物，其中20個上調12個下調，血清中有20個差異性代謝物，其中8個上調12個下調。組織和血清中的一致性代謝物為黃嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、膽堿和馬尿酸。該實驗結果表明，紫草素的抗腫瘤作用與精氨酸生物合成、嘌呤代謝、氨基酸生物合成和谷胱甘肽代謝紊亂有關，可見紫草素可能通過這些代謝途徑抑制大腸癌腫瘤生長。

3.2 黃芪-溫郁金(astragalus membranaceus-curcuma wenyujin，AC)藥對

Sun[36]等研究了不同比例AC對小鼠結腸癌腫瘤的抑制作用，發(fā)現(xiàn)AC比例為2∶1時抑瘤效果最為顯著。AC干預治療15 d的結腸癌小鼠組和未經處理的對照組小鼠血清代謝組學對比分析結果顯示，AC干預能夠使多項指標回調，其中結腸癌小鼠血清中亮氨酸、全反式維甲酸水平升高，次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤水平下降，表明AC的抗腫瘤機制與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、氨基酰轉移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)的生物合成、咖啡因代謝和視黃醇代謝途徑相關，并以回調該途徑內的代謝物水平來發(fā)揮抑制結腸癌細胞生長和轉移的作用。

3.3 金復康口服液

邱云平等[37]研究了金復康口服液對二甲肼誘發(fā)的大腸癌癌前病變作用機制，通過尿液代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組中15個代謝物具有顯著差異，實驗組僅有4個代謝物具有顯著差異。模型組與實驗組比較，琥珀酸、檸檬酸、烏頭酸、異檸檬酸、吲哚乙酸、色胺、5-羥基吲哚乙酸、腐胺和亞精胺代謝水平升高，被調控的這些差異性代謝物與TCA循環(huán)、色氨酸代謝和多胺代謝等途徑有關。

3.4 苦津茶

BI等[38]研究了苦津茶對偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)誘導大鼠結直腸癌前病變的作用機制，該研究分為對照組、AOM組和實驗組(AOM+苦津茶組)，在第12周末收集每只大鼠24 h尿液進行代謝組學分析，結果顯示與對照組比較，AOM組中9-癸烯酰肉堿、辛?；咸烟侨┧崴缴?，肌酸、5-甲基脫氧胞苷、尿酸、吲哚-3-羧酸、馬尿酸、對甲酚葡萄糖醛酸水平降低，而在實驗組治療后代謝物出現(xiàn)逆轉趨勢，表明苦津茶對大腸癌前病變具有顯著改善作用。其作用機制可能與嘌呤代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和色氨酸代謝等途徑有關。

3.5 五達顆粒

Wang等[39]探討了大腸癌患者腹腔鏡術后聯(lián)合五達顆粒對大腸癌的治療作用。對大腸癌病人術前和術后聯(lián)合五達顆粒治療3 d后的血清樣本進行代謝組學分析，與術前組比較，治療組中花生四烯酸、丙酮酸、亮氨酸水平下降，亞麻酸、谷氨酰胺、組氨酸、色氨酸水平上升，特別是花生四烯酸水平恢復至與健康者接近。經相關代謝途徑分析，五達顆粒調控的這些差異性代謝物，主要涉及花生四烯酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、α-亞麻酸代謝、丙酮酸代謝和組氨酸代謝等一個或多個途徑，從而發(fā)揮治療作用。

4 結語與展望

通過總結基于代謝組學技術分析大腸癌患者體內代謝物差異的有關文獻，結果顯示大腸癌的潛在生物標記物有丙酮酸、乳酸、谷氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺等21種代謝物。這些代謝物不僅能為大腸癌的前期診斷和篩查提供可能依據(jù)，也可能作為抗大腸癌中藥藥效生物標記物，用于大腸癌患者的早期和術后聯(lián)合治療。中藥抗大腸癌作用的相關代謝分析表明，中藥所調控的途徑涉及氨基酸代謝、嘌呤代謝、糖酵解、TCA循環(huán)、甘油磷脂代謝和脂質代謝等一個或多個代謝途徑，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。這些研究結果不僅從代謝物層面驗證了抗腫瘤中藥的多途徑協(xié)同作用特點，也與中醫(yī)的整體觀念和辨證論治理念相吻合[40]，完善了中藥抗大腸癌腫瘤的代謝機制。

代謝組學為我們從代謝層面認識大腸癌提供了新的思路方法，一定程度上也為中醫(yī)藥和現(xiàn)代醫(yī)學之間對大腸癌的治療搭建了橋梁，促進了中西醫(yī)的聯(lián)合，但仍存在一些不足。一是在利用代謝組學技術對大腸癌患者的樣本進行分析時，無法精確控制客觀影響因素，如患者的飲食習慣、吸煙、體質等；二是基于代謝組學技術，文獻中雖然報道了許多差異性代謝物，但部分代謝物在不同研究中的改變不一致，如亮氨酸[24,26,39]、脫氧膽酸[29，30，31]等。不同的研究方法、不同地域的研究對象以及不同的飲食習慣都是造成這些差異的原因；三是在有關中藥對大腸癌抑制作用的研究中，多數(shù)都通過差異性代謝物的代謝水平和有關代謝途徑來闡明藥物作用機制，未聯(lián)合蛋白組學、轉錄組學等方法從差異蛋白間的作用關系來探討藥物的作用機制。若能多組學整體性的分析藥物作用機制，不僅更加貼合中醫(yī)學“整體觀念”的理念，并且能多角度、多層面地去闡明藥物的作用機制，結果將更加令人信服。