紫荊、湖北紫荊中單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性研究

王明豪， 張靜涵， 趙京軻， 張亮亮， 駱嘉言*

(1.南京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2.華僑大學(xué)先進(jìn)碳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究院，福建 廈門 361021)

紫荊，為本土豆科植物，在我國有著廣泛的栽培，有重要的藥用價(jià)值。湖北紫荊，又名巨紫荊，為紫荊的近屬種，是一種主要用于園林綠化的喬木，尚無對其化學(xué)成分進(jìn)行研究的報(bào)道，有待于對其開展研究從而進(jìn)行開發(fā)利用?，F(xiàn)有研究表明，紫荊中富含黃酮類化合物[1]，而黃酮類化合物與植物中的縮合單寧有著密切的生源關(guān)系?？s合單寧又稱聚黃烷醇類多酚，是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類衍生于黃烷化合物的多酚類物質(zhì),為羥基黃烷類單體組成的縮合物[2]，絕大部分為多聚原花色素，是一種多分散體系。實(shí)際上人們很難通過分離純化獲得單一結(jié)構(gòu)的純的多聚原花色素，往往只能得到相對分子質(zhì)量在一定范圍內(nèi)的多聚原花色素，因而對所獲得的多聚原花色素組分進(jìn)行準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)特征描述是非常重要的[3]。多酚類化合物作為植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，可以幫助植物免受病原菌、真菌及昆蟲的侵害[4]。此外，單寧還具有多種生物活性，抗氧化活性便是其中之一[5]。本研究對紫荊和湖北紫荊不同部位縮合單寧的含量進(jìn)行了測定，通過NMR、RP-HPLC技術(shù)對紫荊及湖北紫荊單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)開展研究，并對其抗氧化能力進(jìn)行了測定，以期為更好地開發(fā)利用紫荊、湖北紫荊資源提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

紫荊(CercischinensisBunge)、湖北紫荊(CercisglabraPampan.)葉片2021年7月采于南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，湖北紫荊莢果2021年9月采于南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，洗凈后于-20 ℃保存。丙酮、甲醇、鹽酸、醋酸、醋酸鈉、正丁醇、芐硫醇、三氟乙酸、三氯化鐵，均為國產(chǎn)分析純試劑；乙腈為色譜純；色譜填料Sephadex LH-20，Cytiva公司；氘代丙酮、氘代水，北化二廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，Sigma公司；丁基羥基茴香醚(BHA，純度98%)、抗壞血酸(Vc)，分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司；一級水。

JJ-2BS組織搗碎機(jī)，中國VRERA公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)，日本EYEIA公司；Cary 8454型紫外/可見分光光度計(jì)，美國Agilent公司；AvanceⅢ 600MHz高分辨核磁共振儀，德國Bruker公司；LTQ Orbitrap XL液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司。

1.2 縮合單寧的提取與純化

新鮮紫荊葉、湖北紫荊葉片及莢果洗凈后-20 ℃冰凍，凍干機(jī)中凍干后用組織搗碎機(jī)研磨成粉，儲藏于-20 ℃?zhèn)溆?。?0 g植物材料粉末，加入200 mL 70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)丙酮，浸提1 h，重復(fù)3次，合并提取液在45 ℃下旋蒸去除丙酮和部分水，水相冷凍干燥后得到單寧粗提物。粗提物用少量50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液溶解后上Sephadex LH-20色譜柱，用50%甲醇溶液淋洗去除雜質(zhì)，70%丙酮溶液洗脫并收集純化的單寧組分。45 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去丙酮和部分水，剩余水相冷凍干燥，即得純化單寧。樣品置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?，所有后續(xù)分析均使用該純化后的樣品。

1.3 可溶縮合單寧含量的測定

1.3.1樣品溶液的制備 取0.1 g 3種植物原料粉末，與2 mL 70%丙酮溶液混合，于25 mL容量瓶中用甲醇定容，室溫下避光保存。

1.3.2可溶縮合單寧含量的測定 參考文獻(xiàn)[6]的方法，取1 mL過濾后的樣品溶液，加入6 mL正丁醇-鹽酸(體積比95 ∶5，下同)溶液，沸水浴處理75 min。冷卻至室溫后在550 nm處用分光光度計(jì)測定其吸光度，甲醇作為空白對照。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 為得到更為真實(shí)的單寧含量測定結(jié)果，以純化后的植物單寧作為標(biāo)準(zhǔn)品，純化后單寧經(jīng)HPLC法檢測，純度均達(dá)到95%以上。將純化得到的植物單寧樣品配置成質(zhì)量濃度梯度為0、 100、 200、 300、 400和500 mg/L的甲醇溶液，各質(zhì)量濃度取1 mL，加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液，按上述方法處理后，測定吸光度并繪制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得紫荊葉片單寧含量標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.965 2x+0.014 6(R2=0.996 5)、湖北紫荊葉片單寧含量標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.043x+0.035 7(R2=0.99)、湖北紫荊莢果單寧含量標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.034 4x-0.003 6(R2=0.993 4)。

1.4 可溶縮合單寧結(jié)構(gòu)分析

1.4.1液體13C NMR分析 參考文獻(xiàn)[7]的方法，縮合單寧的液體13C NMR用AvanceⅢ 600MHz高分辨核磁共振儀測定。120 mg的純化縮合單寧用1 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的氘代丙酮溶液溶解后，轉(zhuǎn)移到直徑5 mm的核磁管中；在反轉(zhuǎn)門控去偶條件下測定13C NMR譜，掃描頻率為125.78 MHz，脈沖角為45°，延遲時(shí)間為3 s。

1.4.2HPLC-MS分析 樣品在HPLC分析之前，需先經(jīng)過芐硫醇的醇解。首先配置3.3%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的鹽酸-甲醇溶液、 5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)芐硫醇-甲醇溶液及5 g/L的純化縮合單寧甲醇溶液。反應(yīng)時(shí)，取50 μL樣品，50 μL 3.3%鹽酸-甲醇溶液和100 μL 5%芐硫醇-甲醇溶液，充分混勻后40 ℃水浴30 min，0.45 μm濾膜過濾。

將經(jīng)芐硫醇硫解的樣品上機(jī)進(jìn)樣20 μL，色譜柱為Hypeisil Gold反相柱(100 mm×2.1 mm，5 μm)，0.1%甲酸和乙腈為洗脫劑。流程設(shè)定如下：0～15 min，12%～80%乙腈(線性梯度)；15～20 min，80%～95%乙腈；20～26 min，95%乙腈；26～27 min，12%乙腈；27～30 min，100%乙腈(線性梯度)。柱溫控制在25 ℃，洗脫液流速為0.5 mL/min，檢測波長為280 nm，紫外光譜檢測范圍設(shè)置在200～600 nm。

ESI離子源負(fù)離子掃描；掃描范圍(m/z)為100～1 500；霧化器溫度350 ℃，霧化器流速10 L/min，霧化器壓力241.38 kPa，霧化器電壓3.5 kV。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1DPPH自由基清除率 DPPH自由基(DPPH·)清除率的測定參照Chen等[8]的方法，略作改動。配置500 mg/L 的純化單寧樣品甲醇溶液，并使用二倍稀釋法，得到質(zhì)量濃度為500、 250、 125、 62.5和31.25 mg/L 的系列樣品甲醇溶液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.1 mL與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.004%的DPPH甲醇溶液3 mL于10 mL試管中，搖勻后室溫下靜置反應(yīng)30 min,使用紫外分光光度計(jì)在517 nm處測定吸光度(AS)；以甲醇為空白對照，測定其在517 nm處的吸光度值(A0)。以BHA、Vc為陽性對照，配置500、 250、 125、 62.5和31.25 mg/L系列工作溶液，測定吸光度，按下式計(jì)算DPPH·清除率(η)：

η=(A0-AS)/A0×100%

1.5.2總抗氧化能力 參考Benzie等[9]的方法，采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)分析法測定純化單寧樣品的總抗氧化能力。首先，將0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液、 10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以體積比10 ∶1 ∶1混合，配制TPTZ工作溶液。取質(zhì)量濃度為15.625～250 mg/L的各樣品、對照品溶液0.1 mL，加入3 mL TPTZ工作溶液，混勻后25 ℃反應(yīng)5 min，593 nm處測定吸光度值。

配置0.2、 0.4、 0.6、 0.8和1.0 mmol/L的Vc標(biāo)準(zhǔn)液，以甲醇為空白對照。各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與TPTZ工作液反應(yīng)5 min，593 nm處測得吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得：y=1.279 6x+0.038 4(R2=0.999 3)。總抗氧化能力以達(dá)到相同抗氧化能力的Vc的量(mmol/g)來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 可溶性縮合單寧含量

經(jīng)測定，紫荊葉片、湖北紫荊葉片和湖北紫荊莢果3種植物原料的可溶縮合單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(151.56±13.64)、(96.75±13.96)和(198.12±7.24) mg/g。結(jié)果顯示：3種植物原料均具有較高的單寧含量，其中湖北紫荊莢果中可溶縮合單寧含量最高，紫荊葉片次之，湖北紫荊葉片中含量最低。

2.2 可溶性縮合單寧的結(jié)構(gòu)分析

2.2.113C NMR分析 通過13C NMR技術(shù)對縮合單寧進(jìn)行分析，可以得到其基本結(jié)構(gòu)單元的組成及其連接方式的信息。紫荊葉片、湖北紫荊葉片及莢果縮合單寧的液態(tài)13C NMR分析圖譜見圖1，相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)式見圖2。結(jié)果分析參考已報(bào)道的解析圖譜峰信號的相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]。

圖1 紫荊葉片(a)、湖北紫荊葉片(b)和湖北紫荊莢果(c)縮合單寧13C NMR圖譜Fig.1 13C NMR spectra of condensed tannins from C. chinensis(a), C. glabra leaves(b) and pod(c)

圖2 圖2 原花青素(PC)、原翠雀素(PD)和原天竺葵素(PP)的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of procyanidin(PC), prodelphinidin(PD) and propelargonidin(PP)

由圖1和圖2可知，δ157處的信號峰為PP或PD單元的C4’，而δ157～150間出現(xiàn)的峰值為PC或PD單元的C5、C7和C8a。δ146出現(xiàn)的峰值為PD單元的C3’和C5’，PC單元的C3’、C4’在δ145處出現(xiàn)峰值。PD的C4’與PC、PD的C1’均在δ131附近出現(xiàn)峰值。δ119出現(xiàn)的峰可認(rèn)定為PC單元的C6’，δ116 處出現(xiàn)的信號峰則為PC單元的C2’和C5’。δ110～90之間出現(xiàn)的聚集峰代表著PC單元的C8、C4a和C6以及PD單元的C4a、C6、C8、C2’和C6’，此外δ104～102處出現(xiàn)信號峰代表著A型連接的存在。δ90～70之間是縮合單寧結(jié)構(gòu)單元的C2，其出現(xiàn)的位置代表著黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元的順式(2,3-cis)和反式(2,3-trans)結(jié)構(gòu)。以δ80為分界線，反式黃烷-3-醇單元C2的信號峰出現(xiàn)在δ85～80處，而順式黃烷-3-醇的信號峰則出現(xiàn)在δ80～75處。而順式反式對C3的化學(xué)位移并無太大影響，延伸單元C3順式和反式異構(gòu)體的信號峰均位于δ72處。δ36處的峰則代表著延伸單元的C4。此外，δ164、 147、 140、 122以及110等處峰值信號則表明縮合單寧結(jié)構(gòu)單元C3上存在有棓?；〈?。

由圖譜分析可知，紫荊葉片、湖北紫荊葉片及莢果縮合單寧均由PC、PD、PP 3種基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成。通常而言，由于PC單元B環(huán)的C3’、C4’和PD單元的C3’、C5’具有相同的弛豫時(shí)間和核歐沃豪斯效應(yīng)，對二者峰面積積分可得到2種結(jié)構(gòu)單元的構(gòu)成比例。然而，通過分析圖譜可知，3種縮合單寧中均存有一定數(shù)量的棓?；〈瑮旛；螩3、C5的化學(xué)位移與PD結(jié)構(gòu)單元的C3、C5存在重疊，故而難以精確量化PC、PD單元的構(gòu)成比例。通過對比分析δ84及δ77的峰值可知，3種縮合單寧的結(jié)構(gòu)單元均主要呈順式異構(gòu)。

2.2.2HPLC-MS分析 將縮合單寧樣品硫解后進(jìn)行RP-HPLC-ESI-MS分析，可以判斷其末端單元以及延伸單元的化學(xué)組成。芐硫醇作為親核試劑，在酸性條件下可以使縮合單寧得到有效的降解，破壞縮合單寧基本結(jié)構(gòu)單元的連接鍵，從而得到末端單元和延伸單元，其中末端單元以游離的黃烷-3-醇的形式解離出來，而延伸單元?jiǎng)t以芐硫醇加合物的形式存在。對經(jīng)芐硫醇硫解的3種植物縮合單寧樣品進(jìn)行RP-HPLC-ESI-MS分離鑒定，總離子流圖如圖3所示，參考文獻(xiàn)[13-15]對其末端單元及延伸單元與芐硫醇的加合物進(jìn)行了分析鑒定。

1.兒茶素/表兒茶素catechin/epicatechin(C/EC)； 2.棓兒茶素棓酸酯/表?xiàng)攦翰杷貤斔狨allocatechin gallate/epigallocatechin gallate(GCG/EGCG)； 3.兒茶素棓酸酯/表兒茶素棓酸酯catechin gallate/epicatechin gallate(CG/ECG)； 4.棓兒茶素/表?xiàng)攦翰杷仄S硫醚gallocatechin/epigallocatechin-benzylthioethers(GC/EGC-thio)； 5.未知unknow; 6.兒茶素/表兒茶素芐硫醚C/EC-thio； 7.兒茶素/表兒茶素-阿福豆素/表阿福豆素C/EC-afzelechin/epiafzelechin(AF/EAF)圖3 紫荊葉片(a)、湖北紫荊葉片(b)和湖北紫荊莢果(c)縮合單寧HPLC-MS總離子流圖Fig.3 HPLC-MS total ion flow chromatograms of condensed tannins from C. chinensis(a), C. glabra leaves(b) and pod(c)

在負(fù)離子模式下，化合物1的[M-H]-峰為m/z289.1，同時(shí)質(zhì)譜圖上還出現(xiàn)了m/z325.0[M+Cl]-的峰，m/z579.2的[2M-H]-峰，m/z615.1的[2M+Cl]-峰，與文獻(xiàn)[13]比對后鑒定為兒茶素/表兒茶素(C/EC)?；衔?的[M-H]-峰為m/z457.1，化合物3的[M-H]-峰為m/z441.1，參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]可推測其可能為棓兒茶素棓酸酯/表?xiàng)攦翰杷貤斔狨?GCG/EGCG)及兒茶素棓酸酯/表兒茶素棓酸酯(CG/ECG)?；衔?的[M-H]-峰為m/z427.1，同時(shí)質(zhì)譜圖上還可以檢測到m/z303.0的[M-SC7H7-H2-H]-峰，m/z855.2的[2M-H]-峰；化合物6的[M-H]-峰為m/z411.1，同樣質(zhì)譜圖上可以檢測到m/z287.0的[M-SC7H7-H2-H]-峰，m/z823.2的[2M-H]-峰。與文獻(xiàn)[13]比對判定化合物4及化合物6分別為棓兒茶素/表?xiàng)攦翰杷仄S硫醚及兒茶素/表兒茶素芐硫醚的一系列同分異構(gòu)體?；衔?的[M-H]-峰為m/z563.1，參考文獻(xiàn)[15-16]推測其為由兒茶素/表兒茶素與阿福豆素/表阿福豆素(C/EC-AF/EAF)組成的B型連接的二聚黃烷-3-醇。根據(jù)主要色譜峰的保留時(shí)間、特征離子峰、分子質(zhì)量，將推測化合物總結(jié)于表1，其中尚有一種化合物無法辨別。

表1 3種植物的縮合單寧HPLC-MS定性分析結(jié)果Table 1 Qualitative analysis results of condensed tannins from three plants by HPLC-MS

根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果可以推斷，3種單寧的末端單元均主要由C/EC構(gòu)成，并根據(jù)檢測出的黃烷-3-醇芐硫醚加合物可以判斷其延伸單元主要為C/EC及棓兒茶素/表?xiàng)攦翰杷亍４送赓|(zhì)譜圖中雖未檢測到阿福豆素/表阿福豆素芐硫醚的存在，但化合物7可能代表著由C/EC與AF/EAF組成的B型二聚黃烷-3-醇的存在，因而不能排除延伸單元中AF/EAF的存在。此外，結(jié)合文獻(xiàn)還鑒定出了GCG/EGCG及CG/ECG，表明3種單寧均存在棓酰基取代，與核磁結(jié)果相吻合。由此可知，3種縮合單寧均主要由原花青素及原翠雀素組成，且均存在著棓?；〈?/p>

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1DPPH·清除能力 以50%自由基清除時(shí)抑制劑的質(zhì)量濃度(IC50)表示3種縮合單寧對DPPH·的清除能力。從圖4(a)可以看出，3種縮合單寧樣品對DPPH·均有較好的清除能力，IC50值均低于陽性對照組BHA(134.11 mg/L)，其中紫荊葉片及湖北紫荊莢果縮合單寧表現(xiàn)出較為突出的DPPH·清除能力，其IC50值分別為69.67和67.02 mg/L，略低于陽性對照組Vc(76.65 mg/L)；而湖北紫荊葉片縮合單寧的DPPH·清除能力則要稍弱一些，其IC50值為97.70 mg/L，要顯著高于Vc。

圖4 不同樣品中單寧對DPPH·的清除能力(a)及FRAP(b)Fig.4 DPPH· scavenging activities(a) and FRAP(b) of tannins from different samples

2.3.2總抗氧化能力 從圖4(b)和表2可以看出，隨著單寧質(zhì)量濃度增加，所有樣品的吸光度值均有所提高，表2中對應(yīng)的 FRAP值則在一定范圍內(nèi)波動。

表2 不同樣品中單寧的總抗氧化能力Table 2 Total antioxidant activities of tannins from different samples

由表2可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為125 mg/L以下時(shí)，紫荊葉片單寧的FRAP值要高于陽性對照BHA及其他兩種單寧樣品；當(dāng)質(zhì)量濃度為125 mg/L及以上時(shí)，各組FRAP值趨于穩(wěn)定，此時(shí)各組吸光度值的大小關(guān)系為：BHA>紫荊葉片單寧>湖北紫荊葉片單寧>湖北紫荊莢果單寧。

取125 mg/L時(shí)的FRAP值作為總抗氧化能力值。由表2結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，此時(shí)，3種植物縮合單寧樣品的FRAP值都要低于陽性對照BHA，表明樣品的總抗氧化能力要弱于BHA。在3種樣品中，紫荊葉片單寧表現(xiàn)出了最好的總抗氧化性，其FRAP值為(5.56±0.08)mmol/g，僅略低于陽性對照BHA(6.51±0.15 mmol/g)。而湖北紫荊果莢單寧雖然在DPPH自由基清除能力測試中表現(xiàn)良好，但其總抗氧化能力最弱，F(xiàn)RAP值僅為(3.51±0.39) mmol/g。

3 結(jié) 論

3.1紫荊葉片、湖北紫荊葉片和莢果的單寧含量測定結(jié)果表明：3種紫荊原料中可溶性縮合單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高，在96.75～198.12 mg/g之間。

3.2通過13C NMR和HPLC-MS分析方法對縮合單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：3種縮合單寧均主要由原花青素(PC)及原翠雀素(PD)組成，且均存在著棓?；〈?。

3.33種縮合單寧樣品均表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，其中紫荊葉片及湖北紫荊莢果單寧對DPPH·表現(xiàn)出較為突出的清除能力，其IC50值分別為69.67和67.02 mg/L，略低于陽性對照Vc(76.65 mg/L)；紫荊葉片單寧還表現(xiàn)出良好的總抗氧化能力，是值得開發(fā)的天然抗氧化劑。