超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中24種真菌毒素

丁學(xué)妍，邵瑞婷，張涵璐

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心（北京市食品檢驗(yàn)所），北京 100041）

真菌毒素是霉菌等真菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，可廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品[1]。目前已知的真菌毒素種類已經(jīng)有400種，主要有黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素等，近期的研究也發(fā)現(xiàn)在谷物和飼料中出現(xiàn)了一些高污染率的“新興真菌毒素”[2-3]，其中的交鏈孢霉毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等引起了廣泛關(guān)注[4]。交鏈孢霉毒素是由交鏈孢霉產(chǎn)生的一類有毒代謝產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)70多種，其中交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚、交鏈孢菌酮酸和騰毒素是食品中最常檢測到、污染水平較高、危害較大、最具有代表性的交鏈孢毒素[5-7]。目前，國內(nèi)外還沒有食品中交鏈孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[8]，但是在小麥、蔬菜、水果及其制品中均檢出了該類毒素[9-11]。正是由于真菌毒素普遍存在的污染狀況，特別是曲霉菌屬（主要分泌黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等）、鐮孢菌屬（主要分泌玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素、串珠鐮孢菌毒素）在糧谷和飼料中高頻的檢出，及對新興毒素的日益關(guān)注，都提示真菌毒素對人畜健康存在著潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。已有研究證實(shí)，真菌毒素不僅可通過食入、吸入或皮膚接觸進(jìn)入人體內(nèi)，具有強(qiáng)毒性、致癌、致畸和致突變等作用，還會通過與人和動物機(jī)體內(nèi)DNA、RNA結(jié)合并抑制其合成蛋白質(zhì)及各種酶類。細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，抑制了機(jī)體的免疫力，引發(fā)人類和動物的急性或慢性中毒，損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等，會對人畜健康造成極大威脅[12-16]。

牛乳是最古老的天然飲料之一，被譽(yù)為“白色血液”，其營養(yǎng)豐富，是人體鈣質(zhì)的最佳來源，其制品更是成為了大眾餐桌上不可或缺的一員。而真菌毒素在植物性飼料原料中普遍存在污染，有研究通過檢測來源于我國某大型公司的分布于7 省份、9 個(gè)奶牛場的精料、國產(chǎn)燕麥、玉米青貯和全混合日糧100余份樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏馬毒素及嘔吐毒素均處于嚴(yán)重污染水平[17]。2021年，受極端氣象影響原料小麥和玉米的霉菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，這一異常情況的風(fēng)險(xiǎn)直接造成了奶牛中毒素高污染的情況，給奶牛養(yǎng)殖安全帶來嚴(yán)重影響[18-20]，造成牛乳中潛在的真菌毒素污染，食入被污染的食品后會對人體造成不可逆轉(zhuǎn)的危害。雖然多國對真菌毒素最高殘留量進(jìn)行了限制，但在食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)主要集中在谷物、堅(jiān)果及其制品等類別上，而對于乳及乳制品中真菌毒素的限量要求主要集中在黃曲霉M1上，對其他真菌毒素的限量要求相對缺失[21-22]，目前真菌毒素檢測方法主要有高效液相色譜法[23-24]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[25-27]、酶聯(lián)免疫法[24]和放射免疫法[28]等。大部分檢測方法為單類目標(biāo)物的測定，對多種毒素同時(shí)檢測的能力有限[29]，不能滿足同時(shí)檢測多組分目標(biāo)物的快速檢測要求。而樣品的前處理方法主要以免疫親合柱凈化為主[23,30]，由于免疫親合柱具有較強(qiáng)的選擇性且價(jià)格較高，不能滿足不同類別多種毒素的檢測，當(dāng)下有必要開發(fā)和建立快速、高效、高通量的檢測方法，以及時(shí)應(yīng)對突發(fā)的食品安全事件，為食品檢測提供高效、準(zhǔn)確的技術(shù)支撐。故本方法采用基質(zhì)分散固相萃取的方式進(jìn)行凈化，以解決此問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸銨（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；甲酸（質(zhì)譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-葡萄糖苷酸/硫酸酯復(fù)合酶 德國默克公司；多功能凈化柱 美國Romer公司；無水硫酸鎂國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性氧化鋁 美國CNW公司；PSA、弗羅里硅土、C18美國Agilent公司。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、13C17黃曲霉毒素B1、13C17黃曲霉毒素B2、13C17黃曲霉毒素G1、13C17黃曲霉毒素G2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、13C34伏馬毒素B1、13C34伏馬毒素B2、13C34-伏馬毒素B3、T-2毒素、HT-2霉素、交鏈孢霉單甲基醚、交鏈孢酚、騰毒素、細(xì)交鏈孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國ROMER公司；黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品 北京曼哈格生物科技有限公司；α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-TQS質(zhì)譜儀 美國Waters公司；T10BS25均質(zhì)器 德國IKA公司；高速冷凍離心機(jī)、MAXQ5000恒溫振蕩搖床 美國Thermo Fisher公司；DL1028H超聲波提取儀 德國Banoelin公司；ME203千分之一電子天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

精確稱取各類固體標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光、-18 ℃保存。

精密量取各類液體標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各類外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成含交鏈孢霉單甲基醚、交鏈孢酚、騰毒素、細(xì)交鏈孢菌酮酸2 μg/mL，玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇1 μg/mL，伏馬毒素B17 μg/mL，伏馬毒素B2、伏馬毒素B33 μg/mL，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇10 μg/mL，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G20.03 μg/mL，黃曲霉毒素M10.005 μg/mL，赭曲霉毒素A 1 μg/mL，T-2毒素 5 μg/mL，HT-2霉素10 μg/mL的混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各類內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成含13C17黃曲霉毒素B1、13C17黃曲霉毒素B2、13C17黃曲霉毒素G1、13C17黃曲霉毒素G2、13C34伏馬毒素B1、13C34伏馬毒素B2、13C34-伏馬毒素B31 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光、-18 ℃保存。

準(zhǔn)確吸取混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL用乙腈定容至10 mL，配制成混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

分別吸取混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 mL，各加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01 mL，用空白基質(zhì)試樣溶液定容至1 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列工作液。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5 mL，混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度線，混勻，備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g（精確到0.01 g）混勻試樣，置于50 mL具塞離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL，4 mL pH 5.2的乙酸銨溶液，于37 ℃酶解16 h，靜置室溫，加入16 mL乙腈渦旋混勻后，超聲提取20 min，以10 000 r/min冷凍離心10 min，待用。

稱取0.15 g C18+0.15 g多功能凈化柱下層粉末+0.05 g硫酸鎂于10 mL具塞離心管中混勻，隨后加入4 mL提取后的樣液上清液，渦旋振蕩30 s后，5 000 r/min冷凍離心2 min。將全部上清液轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃試管中，于40 ℃氮?dú)獯抵两?。殘留物? mL 50%乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)）復(fù)溶，渦旋混勻后，過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測。

空白基質(zhì)試樣溶液：稱取8 個(gè)與試樣等量的空白基質(zhì)試樣，不加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，與試樣同批同法處理，制得空白基質(zhì)試樣溶液，備用。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度15 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速0.3 mL/min；流動相：A為乙腈、B為0.1%甲酸；梯度洗脫程序：0～1 min，10% A，90% B；1～4 min，10%～50% A，90%～50% B；4～6 min，50%～60% A，50%～40% B；6～9 min，60%～80% A，40%～20% B；9～10 min，80%～90% A，20%～10% B；10～12 min，90% A，10% B；12～12.1 min，90%～10% A，10%～90% B；12.1～15 min，10% A，90% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)監(jiān)測電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）檢測，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔氣流速150 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min，其他質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表1 24種真菌毒素多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for the twenty-four mycotoxins

續(xù)表1

1.3.5 目標(biāo)物的確證計(jì)算

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜屬于低分辨質(zhì)譜，根據(jù)歐盟指令2002/657/EC，規(guī)定低分辨率質(zhì)譜需滿足4 分，即選取1 個(gè)母離子（1 分）和2 個(gè)子離子（各1.5 分）用來確證化合物。在本實(shí)驗(yàn)方法條件下24種化合物的檢測結(jié)果都能夠滿足此要求，符合對目標(biāo)化合物的確證準(zhǔn)則。

本實(shí)驗(yàn)按照儀器條件測定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，且定性離子對相對豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對豐度一致，則判斷樣品中存在相應(yīng)的被測物。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑選擇

分別用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚4種有機(jī)溶劑對牛奶樣品中24種化合物進(jìn)行提取條件實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，甲醇有一定的提取效果，但出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，回收率不足40%；乙酸乙酯及叔丁基甲基醚作為提取試劑，乳化現(xiàn)象更為明顯，無法達(dá)到提取效果；采用乙腈作為提取溶劑，蛋白沉淀效果明顯，目標(biāo)物回收率范圍在85%～110%之間，具有顯著的優(yōu)勢，故本研究選取乙腈作為提取溶劑。

2.2 基質(zhì)分散劑的確定

牛奶中含有大量脂肪、蛋白、維生素、磷脂等，這些物質(zhì)對檢測會造成比較大的干擾，故選擇凈化劑時(shí)都要考慮到，本實(shí)驗(yàn)選擇多功能凈化柱、PSA、C18、中性氧化鋁、弗羅里硅土作為凈化填料，無水硫酸鎂作為助劑，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索。

分別稱取0.2 g PSA、C18、中性氧化鋁、弗羅里硅土、多功能凈化柱上層粉末、多功能凈化柱下層粉末于10 mL具塞管中，各加入1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，渦旋振蕩30 s后，以5 000 r/min冷凍離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測，得到24種真菌回收率，見圖1a。結(jié)果表明，C18、多功能凈化柱下層粉末對24種真菌毒素都能回收，故主要選擇這2種填料用于樣品凈化的主要填料。

再分別稱取多功能凈化柱下層粉末+C18（0.1 g+0.1 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18（0.15 g+0.15 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18（0.2 g+0.2 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+PSA（0.2 g+0.2 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.1 g+0.1 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.15 g+0.15 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.15 g+0.2 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.2 g+0.2 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.2 g+0.25 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂+PSA（0.2 g+0.2 g+0.05 g+0.05 g）于10 mL具塞管中，各加入1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，渦旋振蕩30 s后，5 000 r/min冷凍離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測，得到24種真菌回收率，見圖1b。結(jié)果表明，C18+多功能凈化柱下層粉末+無水硫酸鎂（0.15 g+0.15 g+0.05 g）對24種真菌有更好的回收率，故在本研究中，選取C18+多功能凈化柱下層粉末+無水硫酸鎂（0.15 g+0.15 g+0.05 g）作為分散基質(zhì)固相萃取柱。

2.3 定容溶劑選擇

吸取混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05 mL+混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01 mL，分別用50%、80%、100%乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)）稀釋配制成同一濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供儀器檢測，在相同參數(shù)條件下，結(jié)果如圖2所示，50%乙腈作為定容液可以得到更好分離度且峰形尖銳。故在本研究中，選取50%乙腈作為定容溶劑。

圖1 24種真菌毒素回收率Fig. 1 Effect of matrix dispersant on recoveries of 24 mycotoxins

圖2 以黃曲霉毒素B2為例的離子譜圖Fig. 2 Ion chromatograms of AFB2

2.4 流動相選擇

吸取混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05 mL+混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01 mL，用50%乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)）配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供儀器檢測，對比2 組流動相，分別為乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，在相同參數(shù)條件下，結(jié)果如圖3所示，乙腈-0.1%甲酸可以更好分離各種物質(zhì)且峰形尖銳，故選取乙腈-0.1%甲酸作為流動相。

圖3 不同流動相條件下24種化合物的總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatograms of 24 compounds under different mobile phase conditions

2.5 色譜條件的優(yōu)化

2.5.1 液相色譜條件優(yōu)化

比較ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），在相同參數(shù)條件下，結(jié)果如圖4所示，BEH C18色譜柱拖尾現(xiàn)象明顯，且無法實(shí)現(xiàn)多種化合物的基線分離；而HSS T3色譜柱的峰形尖銳，且分離效果明顯優(yōu)于BEH C18色譜柱。故在本實(shí)驗(yàn)中，選擇HSS T3色譜柱。

圖4 不同色譜柱組成條件下赭曲霉毒素A、T2-毒素為例的離子色譜圖Fig. 4 Ion chromatograms of OTA and T2 using different columns

2.5.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用ESI，不接色譜柱，標(biāo)準(zhǔn)品直接注射狀態(tài)下，分別將100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式，結(jié)果表明，玉米赤霉烯酮類（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮）、細(xì)交鏈孢菌酮酸、交鏈孢酚8種真菌毒素在負(fù)離子模式下靈敏度較高，其他16種真菌毒素均在正離子模式下靈敏度較高。故本實(shí)驗(yàn)選取正、負(fù)離子2種模式。

2.6 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.6.1 檢出限、定量限與線性范圍結(jié)果

分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 mL，用空白基質(zhì)試樣溶液定容至1 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列工作液，設(shè)置進(jìn)樣量為10 μL，濃度從低到高進(jìn)樣，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，以定量離子峰面積（峰面積比）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。以待測化合物定性離子對的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比不小于3確定方法檢出限，以定量離子對的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比不小于10確定方法定量限，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，24種化合物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)平方（R2）均大于0.985，能滿足定量分析的要求。

表2 24種真菌毒素檢出限、定量限與線性關(guān)系Table 2 Limits of detection and quantitation and calibration curves of 24 mycotoxins

2.6.2 樣品的加標(biāo)回收率

在5.0 g牛奶樣品中加入含有24種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，應(yīng)用優(yōu)化好的方法進(jìn)行提取、凈化分離和確證，回收率范圍為71.0%～123.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。結(jié)果表明，各化合物在不同添加水平均得到滿意的回收率和較好的方法重復(fù)性。以交鏈孢霉單甲基醚、交鏈孢酚、騰毒素為例的離子色譜圖如圖5所示。

圖5 以交鏈孢霉單甲基醚（a）、交鏈孢酚（b）、騰毒素（c）為例的樣品加標(biāo)離子色譜圖Fig. 5 Ion chromatograms of spiked samples with AME (a),AOH (b) and TEN (c)

3 結(jié) 論

通過比對不同提取試劑、基質(zhì)分散劑、定容液、流動相及色譜柱確定最終實(shí)驗(yàn)條件，采用分散基質(zhì)固相萃取凈化，建立了牛奶中24種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。與其他文獻(xiàn)相比，該方法檢測通量大，前處理簡便高效，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足牛奶中24種真菌毒素的快速篩查和定量的要求，已在日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中得到良好的應(yīng)用。