甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的性質(zhì)差異分析及對多糖的協(xié)同降解

劉 學(xué)，盧海強(qiáng)，王玉印，田洪濤，谷新晰

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是一類水解甘露聚糖中β-1,4-D-吡喃甘露糖苷鍵的內(nèi)切酶[1]，在食品、養(yǎng)殖業(yè)、造紙、生物燃料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。甘露聚糖酶主要來自細(xì)菌[3]、真菌[4]及放線菌等微生物[5-6]，依據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)差異可分為4 類，即GH5、GH26、GH113和GH134家族。目前GH5家族甘露聚糖酶的研究報道較多，是主要的商業(yè)用酶。2015年，GH134家族甘露聚糖酶首次在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中獲得[7]，是分子質(zhì)量最小的一類甘露聚糖酶。研究表明GH5、GH26和GH113家族的甘露聚糖酶有較大相似性，同屬于GH-A超家族，具有典型的(β/α)8-磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephoaphate isomerase，TIM）桶狀結(jié)構(gòu)并遵循異頭碳構(gòu)象保留型催化機(jī)制，而GH134家族甘露聚糖酶則表現(xiàn)出明顯差異，顯示出類似溶菌酶的折疊并采用異頭碳反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制[8-9]。探究不同家族酶的性質(zhì)差異可為甘露聚糖酶的具體應(yīng)用提供借鑒，如Freiesleben等[10]表征了真菌來源的GH5和GH26家族甘露聚糖酶的性質(zhì)，表明GH26家族甘露聚糖酶的最適pH值在5～7范圍內(nèi)，最適反應(yīng)溫度在50～68 ℃之間，而GH5家族甘露聚糖酶的最適pH值為3～6，最適反應(yīng)溫度為78～87 ℃，且與GH26家族的甘露聚糖酶相比，其熱穩(wěn)定性強(qiáng)；此外在降解甘露聚糖的過程中，發(fā)現(xiàn)GH5家族甘露聚糖酶的初始速率均低于GH26家族的甘露聚糖酶，但兩個家族酶的底物特異性沒有顯示出明顯差異。Tailford等[11]發(fā)現(xiàn)，來自芽孢桿菌（Bacillus）的GH5和GH26家族甘露聚糖酶的亞位點對底物所含糖單元的識別與催化有嚴(yán)格特異性，其中來自瓊脂芽孢桿菌（Bacillus agaradhaerens）的BaMan5A在其－2和+1亞位點可容納葡萄糖或甘露糖，而來自枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的BsMan26A在其負(fù)結(jié)合位點對甘露糖有嚴(yán)格的特異性。然而，作為結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制存在巨大差異的GH5和GH134家族β-甘露聚糖酶的差異分析鮮有報道。

多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量大、黏度高、水解困難，其完全降解需要多個酶的協(xié)同作用。對于甘露聚糖酶，已發(fā)現(xiàn)存在同質(zhì)協(xié)同和異質(zhì)協(xié)同兩種協(xié)同水解方法[12]。其中同質(zhì)協(xié)同是兩種主鏈切割酶（如甘露聚糖酶、甘露糖苷酶）或兩種側(cè)鏈切割酶（如乳糖苷酶、乙酰甘露聚糖酯酶）之間的協(xié)同作用，異質(zhì)協(xié)同則是一個主鏈切割酶和一個側(cè)鏈切割酶（如甘露聚糖酶和半乳糖苷酶）之間的協(xié)同作用[13-14]。Han Yejun等[15]研究表明細(xì)菌Caldanaerobius polysaccharolyticus來源的Man5A-TM1和Man5A-TM2對β-甘露聚糖和瓜爾豆膠的降解有協(xié)同作用，Man5A-TM1和Man5B對β-甘露聚糖和羧甲基纖維素的降解有協(xié)同作用，還原糖含量增加。Chen Xi等[3]發(fā)現(xiàn)Bacillus來源的BaMan5A與商業(yè)α-半乳糖苷酶水解半乳甘露聚糖時顯示有協(xié)同作用，最大協(xié)同系數(shù)可達(dá)1.58。因此采用復(fù)合甘露聚糖酶協(xié)同降解多糖，對提高多糖的水解效率有重要意義。

本研究擬從煙曲霉（A. fumigatus）HBHF5和微孢根霉（Rhizopus microsporus）GZHF10中克隆表征GH5和GH134家族甘露聚糖酶（AfMan5A和RmMan134C），探究兩者在酶結(jié)構(gòu)、酶學(xué)特性、底物特異性和底物親和力方面的差異，并開展酶協(xié)同降解多糖的研究，旨在為GH5和GH134家族甘露聚糖酶的高效催化提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株A. fumigatusHBHF5、R. microsporusGZHF10、畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115、質(zhì)粒pET30a（+）和pPIC9K由本課題組篩選并保存[16]；感受態(tài)大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、E. coliBL21（DE3） 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒 美基生物科技有限公司；Taq酶、限制性內(nèi)切酶 日本TaKaRa公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；魔芋粉、刺槐豆膠、瓜爾豆膠、角豆膠、殼聚糖 源葉生物有限公司；微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、果膠、甘露糖 北京索萊寶科技有限公司；皂角米多糖由本實驗室提取并保存；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：0.5% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.001% FeSO4·7H2O、0.02% CaCl2、0.3%酵母浸粉、0.3%魔芋粉；BMGY/BMMY培養(yǎng)基：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、1.34%無氨基酸酵母氮源（含硫酸銨）、4×10－5%生物素、1%甘油、0.5%甲醇；LB培養(yǎng)基：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

T100TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博遠(yuǎn)實業(yè)有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Universal 320高速冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾儀器廠；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；DW-86L388J超低溫冰箱 海爾智家股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

使用MEGA7.0軟件對AfMan5A（AFUA_7G01070）、RmMan134C（ORE23177.1）及其他GH5、GH26、GH113和GH134家族β-甘露聚糖酶的蛋白序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[17-18]。采用軟件ProtParam（https://www.expasy.org/resources/protparam）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，PredictProtein（https://predictprotein.org/）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。選擇與AfMan5A序列一致性為70.35%的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:3wh9）和與RmMan134C（PDB:5xxa）序列一致性為77.78%的晶體結(jié)構(gòu)為模板，使用SWISSSMODEL軟件模擬構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)，使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）分析蛋白保守序列，并通過軟件Pymol進(jìn)行蛋白保守序列的可視化分析，氨基酸殘基以梯度著色。

1.3.2 重組甘露聚糖酶基因的克隆與載體構(gòu)建

菌株A. fumigatusHBHF5和R. microsporusGZHF10分別接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，45 ℃培養(yǎng)3 d，離心收集菌體備用。采用RNA提取試劑盒提取總RNA，－80 ℃保存?zhèn)溆谩＠靡镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得AfMan5A和RmMan134C基因，并將獲得的基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-AfMan5A和pET30a-RmMan134C。引物AfMan5APF（GGGGAATTCCCCAGCGCAAAGAAATTCG）、AfMan5A-PR（GAATGCGGCCGCCTAAA CCCACCCCTGCTTC）、RmMan134C-PF（GGGGAATTCAGGCCCGGCGATAGAGGCC）、RmMan134C-PR（GAATGCGGCCGCTTAAATAGCGGTAA CGTCGACCCAG），由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.3 重組甘露聚糖酶酶液的制備及純化

質(zhì)粒pPIC9K-AfMan5A經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglII線性化，并經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒pET30a-RmMan134C熱激轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）。分別參照酵母表達(dá)手冊和pET系統(tǒng)手冊篩選陽性轉(zhuǎn)化子。AfMan5A的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng) BMGY培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)48 h后，菌泥重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，并加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，保持甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.5%。RmMan134C的陽性轉(zhuǎn)化子接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，直至OD600nm為0.5～0.8時，加入1/1 000的1 mol/L異丙基硫代半乳糖苷，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

采用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.4AfMan5A和RmMan134C酶活力測定

參考Miller[19]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定甘露聚糖酶酶活力。將100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到900 μL的0.25%魔芋底物溶液中，搖勻后50 ℃水浴20 min，加入1.5 mL的DNS試劑終止反應(yīng)，煮沸5 min后冷卻至室溫，在540 nm波長處測定OD值。酶活力單位（U）：該反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量。

1.3.5 溫度和pH值對酶活力的影響

在10、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃和100 ℃條件下測定重組酶的最適反應(yīng)溫度，以最高酶活力為100%，計算不同溫度下的相對酶活力。在50 ℃下處理AfMan5A和RmMan134C的酶液0～60 min，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力，分析其熱穩(wěn)定性。以未經(jīng)處理的酶溶液作對照，其酶活力定為100%。

用100 mmol/L的pH 2～3甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH 3～8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和pH 8～12甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液溶解的底物，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定AfMan5A和RmMan134C酶活力，以最高酶活力為100%，計算不同pH值下的相對酶活力。使用上述緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，于0 ℃處理酶液1 h，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力，分析其pH值穩(wěn)定性。以最適pH值處理的酶溶液作對照，其酶活力定為100%。

1.3.6 金屬離子對酶活力的影響

分析金屬離子（Mg2+，Ca2+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Zn2+，Li+，Na+，K+，Mn2+）對酶活力的影響。在標(biāo)準(zhǔn)酶活力反應(yīng)體系中，加入金屬離子，使其終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，以未處理為對照組，其酶活力定為100%，計算不同金屬離子處理酶溶液的相對酶活力。

1.3.7AfMan5A和RmMan134C的蛋白含量測定

參照Bradford[20]方法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)法測定酶液的蛋白含量。

1.3.8AfMan5A和RmMan134C底物譜和底物親和力的差異分析

以蛋白質(zhì)量濃度為（1±0.04）mg/mL的酶液進(jìn)行底物譜和底物親和力分析。用pH 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制1.25 g/L的魔芋粉、皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠、角豆膠、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、殼聚糖和果膠底物，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，分別在最適反應(yīng)溫度條件下測定酶活力，分析底物特異性。

取底物溶液4 mL，加入2 mL蛋白質(zhì)量濃度為（1±0.04）mg/mL的酶液，于4 ℃、25 r/min條件下混勻8 h，12 000 r/min離心5 min取上清液，以1.25 g/L的魔芋粉為底物，未與底物結(jié)合酶液的酶活力定為100%，在最適反應(yīng)條件下測定它和上清液的酶活力，計算兩者差值，分析底物結(jié)合的親和力[21]。

1.3.9AfMan5A和RmMan134C的協(xié)同酶解多糖分析

取1.3.8節(jié)配制好的底物溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，將相同蛋白質(zhì)量濃度（（1±0.04）mg/mL）的酶液在各自最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)，中途煮沸20 min滅活酶液，對照組為單個酶液反應(yīng)，并添加100 μL蒸餾水代替酶液。測定AfMan5A和RmMan134C三種協(xié)同反應(yīng)，包括兩者同時反應(yīng)、AfMan5A先反應(yīng)和RmMan134C先反應(yīng)。以甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對照組和雙酶協(xié)同組的還原糖含量，以協(xié)同系數(shù)判定AfMan5A和RmMan134C的協(xié)同降解作用。協(xié)同系數(shù)為協(xié)同組的還原糖含量值與對照組還原糖含量相加值的比值，協(xié)同系數(shù)小于1說明無協(xié)同作用，大于1有協(xié)同作用，且隨著比值的增加，協(xié)同作用顯著[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個實驗重復(fù)3 次，使用GraphPad Prism 8.0.1、Excel 2010和SPSS Statistics 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfMan5A和RmMan134C的生物信息學(xué)分析及表達(dá)

由4 個家族甘露聚酶的進(jìn)化樹結(jié)果可知（圖1），甘露聚糖酶按照家族各自構(gòu)成一個分支，同時發(fā)現(xiàn)，GH134家族甘露聚糖酶與其他3 個家族的β-甘露聚糖酶相比，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與GH5、GH26和GH113家族的β-甘露聚糖酶屬于同一超級家族（GH-A）有關(guān)，都遵循保留型催化機(jī)制，而GH134家族甘露聚糖酶則采用異頭碳反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制。

圖1 GH5和GH134家族β-甘露聚糖酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹及結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Phylogenetic tree and structure analysis of β-mannanase from the GH5 and GH134 families

經(jīng)同源建模分析AfMan5A由8 個α-螺旋及8 個β-折疊交替排列形成了TIM桶狀結(jié)構(gòu)，排列在一起的8 個β-折疊片段形成桶狀內(nèi)部凹槽結(jié)構(gòu)，與之相連接的α-螺旋則組成桶的外沿，其中有54.96%的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)、31.1%的α-螺旋結(jié)構(gòu)、13.94%的β-折疊結(jié)構(gòu)。并由8 個保守氨基酸殘基構(gòu)成了該桶狀的活性口袋，分別是R76、H124、N191、E192、H265、Y267、E300及W330，其中第4個及第7個β-折疊的C末端是2 個高度保守的谷氨酸殘基（E192和E300），是β-甘露聚糖酶的親核催化及酸堿催化位點[23-24]。RmMan134C由9 個α-螺旋及2 個反向平行的β-折疊組成，其中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占65.03%、α-螺旋結(jié)構(gòu)占27.32%、β-折疊結(jié)構(gòu)占7.65%。分析RmMan134C的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)E55和D67是其活性催化位點，此外173～183位的氨基酸（DTRFWVDVTAI）組成了RmMan134C最短的保守區(qū)，且該區(qū)域相對而言最為保守，主要是β-折疊片結(jié)構(gòu)，推測可為RmMan134C的蛋白分子機(jī)構(gòu)穩(wěn)定提供保障。

甘露聚糖酶AfMan5A基因全長1 119 bp，編碼373 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為41.31 kDa，含28 個堿性氨基酸和38 個酸性氨基酸，等電點為5.52，不穩(wěn)定系數(shù)為16.54。RmMan134C基因由549 bp堿基組成，編碼183 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為20.71 kDa，含21 個堿性氨基酸和21 個酸性氨基酸，等電點為6.91，不穩(wěn)定系數(shù)為26.39。圖2為AfMan5A和RmMan134C的蛋白電泳圖，其分子大小均大于理論值，推測是由于具有糖基化位點[25]和N端的His標(biāo)簽引起[26]，仍需進(jìn)一步研究。

圖2 重組酶AfMan5A和RmMan134C的SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE pattern of recombinant AfMan5A and RmMan134C

2.2 AfMan5A和RmMan134C的酶學(xué)性質(zhì)差異

2.2.1 溫度和pH值對酶活力的影響

如圖3所示，AfMan5A的最適溫度和最適pH值為60 ℃和6.0，RmMan134C的最適溫度和最適pH值為35 ℃和5.0。AfMan5A在50 ℃熱處理1 h后，可保持（90.0±2.7）%的殘余酶活力，RmMan134C在50 ℃熱處理1 h后，可保持（13.2±2.6）%的殘余酶活力。pH值穩(wěn)定性結(jié)果顯示，AfMan5A在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)，酶活力較穩(wěn)定，顯示出80%以上的殘余酶活力，RmMan134C在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，酶活力較穩(wěn)定，顯示出60%以上的殘余酶活力。結(jié)果表明，AfMan5A屬于高溫酶，RmMan134C屬于中溫酶，熱處理結(jié)果顯示，較高的溫度條件下，AfMan5A的熱穩(wěn)定性優(yōu)于RmMan134C。pH值測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者均為偏酸性酶，在酸性和中性pH值范圍內(nèi)均有較好的耐受性。

圖3 重組酶AfMan5A和RmMan134C的最適溫度（A）、溫度穩(wěn)定性（B）、最適pH值（C）及pH值穩(wěn)定性（D）Fig. 3 Optimum temperature (A), temperature stability (B), optimum pH (C) and pH stability (D) of recombinant AfMan5A and RmMan134C

2.2.2 金屬離子對酶活力的影響

通過分析不同金屬離子對AfMan5A和RmMan134C酶活性的影響（表1），發(fā)現(xiàn)金屬離子Cu2+、Zn2+、Mn2+均可抑制兩個酶的酶活力，且Cu2+和Mn2+的抑制作用比Zn2+強(qiáng)，但對兩個酶的抑制程度有差別，5 mmol/L的Cu2+、Zn2+和Mn2+對AfMan5A的抑制率為53.2%、21.2%和86.6%，對RmMan134C的抑制率為16.5%、7.6%和70.8%。根據(jù)顯著性分析結(jié)果，Mg2+、Ca2+、Fe3+、Li+、Na+、K+可提高AfMan5A的酶活性，其中Ca2+的促進(jìn)效果最為明顯，可提高175%的酶活力，而這些金屬離子除Fe3+、5 mmol/L的Mg2+和Li+對RmMan134C酶活性有輕微抑制作用外，其余的金屬離子對RmMan134C酶活力影響不大。數(shù)據(jù)表明，AfMan5A和RmMan134C對金屬離子耐受性較好。

表1 金屬離子對AfMan5A和RmMan134C相對酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity of AfMan5A and RmMan134C%

2.3 酶的底物特異性及親和力分析

甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C對多種底物均表現(xiàn)出一定的水解活性，結(jié)果如表2所示。AfMan5A對甘露聚糖底物的特異性強(qiáng)，可水解魔芋葡甘露聚糖及皂角米、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和角豆膠來源的半乳甘露聚糖，對纖維素和醛酸類底物沒有顯示出降解能力。RmMan134C較AfMan5A具有更寬的底物譜，對甘露聚糖、纖維素和醛酸類底物均顯示出降解活性，最適底物為魔芋葡甘露聚糖，這一結(jié)果與微孢根霉來源的RmMan134A不同，它對刺槐豆膠（100%）有高酶活性，其次是魔芋（39.4%）和瓜爾豆膠（21.9%）[27]。

表2 重組酶AfMan5A和RmMan134C的底物特異性和親和力分析Table 2 Substrate specificity and affinity analysis of AfMan5A and RmMan134C

一般來說，酶的水解速率和酶與底物的吸附能力有關(guān)，酶與底物親和力越大，酶催化效率越高，因此，分析酶的底物親和力可能會對酶與底物結(jié)合機(jī)制及在底物降解過程中與其他酶協(xié)同作用提供新的見解。由表2可知，AfMan5A對角豆膠的親和力最小，RmMan134C對刺槐豆膠的親和力最小，但均對魔芋葡甘露聚糖顯示出最高的親和力，這與魔芋葡甘露聚糖是AfMan5A和RmMan134C的最適底物結(jié)果一致。其中米曲霉來源的AoMan134A[28]酶解魔芋粉（kcat/Km=564 mL/（s·mg））時的動力學(xué)參數(shù)大于刺槐豆膠（kcat/Km=527 mL/（s·mg））和瓜爾豆膠（kcat/Km=77 mL/（s·mg）），也表現(xiàn)出相同結(jié)果。此外AfMan5A和RmMan134C對羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、殼聚糖的親和力相近，但AfMan5A對皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和果膠的親和力大于RmMan134C。

2.4 AfMan5A和RmMan134C的協(xié)同酶解

由圖4可知，AfMan5A和RmMan134C同時降解魔芋粉、皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和角豆膠底物，協(xié)同系數(shù)均小于1，顯示無協(xié)同效果。而進(jìn)一步探究AfMan5A和RmMan134C反應(yīng)的先后順序?qū)f(xié)同作用的影響，結(jié)果顯示AfMan5A和RmMan134C按不同的先后順序反應(yīng)時，協(xié)同組的還原糖含量仍小于對照組還原糖含量相加值，因此，結(jié)果表明AfMan5A和RmMan134C對甘露聚糖類底物無協(xié)同作用。以羧甲基纖維素鈉或殼聚糖為底物時，發(fā)現(xiàn)AfMan5A先反應(yīng)時顯示有協(xié)同效果，協(xié)同系數(shù)分別為1.29和4.19。在降解微晶纖維素底物時，AfMan5A先反應(yīng)或后反應(yīng)，結(jié)果均顯示有協(xié)同作用，協(xié)同系數(shù)為分別為6.10和1.14，且AfMan5A先反應(yīng)時，與其他底物的降解效果相比，其還原糖含量值最高，協(xié)同效果最顯著。結(jié)果表明，AfMan5A和RmMan134C對甘露聚糖類底物無協(xié)同作用，對纖維素類底物有協(xié)同作用，且協(xié)同效果與酶液反應(yīng)的先后順序有關(guān)。因此對于纖維素類底物的降解，AfMan5A和RmMan134C可作為新的酶制劑選擇，高效應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

圖4 AfMan5A和RmMan134C對多糖的協(xié)同酶解作用Fig. 4 Synergistic hydrolysis of AfMan5A and RmMan134C on polysaccharides

3 討 論

GH5家族的β-甘露聚糖酶分子質(zhì)量在30～70 kDa之間，具有典型的(β/α)8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)，催化機(jī)制為保留型。與AfMan5A相比，來源于黑曲霉（A. niger）AEY76082.1、宇佐美曲霉（A. usamii）ADZ99027.1和硫色曲霉（A. sulphureus）ABC59553.1的甘露聚糖酶α-螺旋結(jié)構(gòu)占31.85%、33.94%和31.07%，β-折疊結(jié)構(gòu)占19.06%、18.80%和20.63%，且等電點為4.45、4.38和4.19，均屬于酸性蛋白質(zhì)。目前已報道的4 個GH134家族的β-甘露聚糖酶分子質(zhì)量小，為20 kDa左右，催化機(jī)制為反轉(zhuǎn)型，與GH5家族相比差異顯著。分析蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，來自于構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）AnMan134A[7]、米曲霉（A. oryzae）AoMan134A[28]、鏈霉菌屬（Streptomycessp.）SsGH134[5]和RmMan134A[27]的甘露聚糖酶α-螺旋結(jié)構(gòu)與β-折疊結(jié)構(gòu)的占比差異較大，其中AoMan134A的α-螺旋結(jié)構(gòu)（46.33%）與β-折疊結(jié)構(gòu)的占比（8.47%）相差最大，為37.86%，同時AoMan134A的α-螺旋結(jié)構(gòu)占比也最大。此外，GH134家族的β-甘露聚糖酶等電點在5.5～7.5之間，與GH5家族的β-甘露聚糖酶相比也具有較明顯差異。His標(biāo)簽分子質(zhì)量低，其中His中的咪唑環(huán)可與金屬離子如Ni2+、Zn2+等特異性結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化，但也會破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象，降低酶的活性和穩(wěn)定性[29]。Halliwell等[30]將His標(biāo)簽融合到嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）L-乳酸脫氫酶的N端或C端，結(jié)果表明與野生型和N-末端標(biāo)記的酶相比，C-末端標(biāo)記的酶顯示出較低的活性。而Esen等[31]構(gòu)建了N端和C端His標(biāo)記的嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）的甲酸脫氫酶（CtFDH），發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解度不受標(biāo)簽位置的影響，但與N-CtFDH相比，C-CtFDH 的比活性高約3 倍，催化效率高2 倍。因此關(guān)于His標(biāo)簽對AfMan5A和RmMan134C酶活力的影響仍需進(jìn)一步研究。

大量研究指出微生物來源的β-甘露聚糖酶最適溫度在40～60 ℃之間，且一般來源于嗜熱微生物的酶最適反應(yīng)溫度較高，如來源于A. nigerManBK[32]、藍(lán)狀菌（Talaromyces leycettanus）Man5A[33]、小巢狀曲霉（A. nidulans）Man5XZ7[34]的GH5家族嗜熱β-甘露聚糖酶的最適溫度分別為80、90、80 ℃。然而本研究的RmMan134C與這些嗜熱菌來源酶有很大不同，其最適溫度為35 ℃，屬于低溫酶，這可能與RmMan134C的氨基酸組成和蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且RmMan134C最適溫度與其他報道的GH134家族β-甘露聚糖酶相近，如AnMan134A、AoMan134A、SsGH134和RmMan134A的最適溫度分別為30、30、40、50 ℃。比較酶的最適反應(yīng)pH值，發(fā)現(xiàn)不同來源的β-甘露聚糖酶pH值差異也較大，一般真菌來源的酶最適反應(yīng)pH值偏酸性，細(xì)菌來源的酶最適反應(yīng)pH值偏堿性或中性，測定結(jié)果表明，AfMan5A和RmMan134C的最適反應(yīng)pH值分別為6.0和5.0，無較大差異，且與多數(shù)真菌來源的酶最適pH值相似。值得注意的是，在降解魔芋葡甘露聚糖底物時，發(fā)現(xiàn)RmMan134C的比活力（0.31 U/mg）大于AfMan5A（0.21 U/mg），因此，相比于GH5家族的甘露聚糖酶，GH134家族甘露聚糖酶的催化能力更為明顯。

與多糖相比，寡糖分子質(zhì)量低，黏度低、生物活性高。目前酶解法因特異性強(qiáng)、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點，已成為制備寡糖的首選方法[35]。此外，由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難降解，因此采用復(fù)合酶協(xié)同降解多糖來制備寡糖是有必要的，可增強(qiáng)酶解效率和寡糖制備率[36]。本實驗以AfMan5A和RmMan134C為研究對象，探討了兩個酶的不同加樣順序?qū)Χ嗵堑膮f(xié)同降解效果。結(jié)果表明，AfMan5A和RmMan134C對甘露聚糖類底物無協(xié)同作用，對纖維素類底物有協(xié)同作用，且酶液反應(yīng)的順序不同其協(xié)同效果也不同，在酶解羧甲基纖維素鈉和殼聚糖時，AfMan5A先反應(yīng)時具有協(xié)同作用，協(xié)同系數(shù)分別為1.29和4.19，酶解微晶纖維素時，AfMan5A先反應(yīng)和后反應(yīng)均有協(xié)同效果，其中AfMan5A先反應(yīng)時的協(xié)同效果最大，協(xié)同系數(shù)為6.10，這可能是由于多糖結(jié)構(gòu)差異和酶的復(fù)雜性導(dǎo)致產(chǎn)生了不同的協(xié)同效果。

4 結(jié) 論

本研究成功從A. fumigatusHBHF5和R. microsporusGZHF10中獲得GH5和GH134家族的β-甘露聚糖酶，發(fā)現(xiàn)兩個酶的三維結(jié)構(gòu)差異明顯。甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的最適溫度分別為60 ℃和35 ℃，也相差較大，此外金屬離子對AfMan5A酶活性的影響效果明顯。底物特異性和親和力實驗結(jié)果表明，兩個酶的最適底物均為魔芋葡甘露聚糖，且均對魔芋葡甘露聚糖有最高親和力，但AfMan5A對皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和果膠的親和力大于RmMan134C。兩個酶協(xié)同降解多糖時，發(fā)現(xiàn)對微晶纖維素、殼聚糖和羧甲基纖維素鈉均顯示出一定的協(xié)同作用，其中對微晶纖維素的協(xié)同效果最好。本研究分析了GH5和GH134家族AfMan5A和RmMan134C的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，以及二者協(xié)同降解多糖的能力，為β-甘露聚糖酶的實際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。