羅非魚加工副產(chǎn)物不同部位硫酸軟骨素的制備、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

左格格，鐘賽意,2,3,*，陳 菁，徐敏鳳，陳建平，李 瑞，劉曉菲，宋兵兵，賈學(xué)靜

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518063；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，由交替的D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GlcA）和N-乙酰氨基半乳糖（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）連接的二糖單位組成[1]。根據(jù)GlcA和GalNAc不同位置上連接硫酸基團(tuán)的數(shù)量和種類不同，CS主要分為A型、C型、D型和E型。CS主要從動(dòng)物軟骨中獲取，比如豬軟骨[2]、牛軟骨[3]、雞龍骨[4]、鯊魚[5]、魷魚軟骨[6]。相比之下，由于陸地動(dòng)物存在瘋牛病，豬霍亂和口蹄疫等疾病[7]，海洋來源的CS安全性更高。然而，商品化CS主要是鯊魚來源，其資源珍稀且價(jià)格昂貴，因此尋找經(jīng)濟(jì)且安全性高的CS新來源受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

羅非魚（Oreochromis mossambicus）又稱非洲鯽魚，屬于熱帶性硬骨魚類，具有生長(zhǎng)快、肉質(zhì)好、產(chǎn)量高、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)。2020年我國(guó)淡水養(yǎng)殖羅非魚總產(chǎn)量約為165萬 t[8]，主要以冷凍羅非魚片作為我國(guó)的出口水產(chǎn)品，在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物（包括魚頭、魚尾、魚骨、魚鱗、魚皮和內(nèi)臟等）[9]。這些廢料富含CS[10]、膠原蛋白[11]、魚油[12]等高值物質(zhì)，具有多種生物活性，但通常會(huì)被丟棄或不加區(qū)分的加工成飼料等低值產(chǎn)品，使得大量的資源未得到充分的開發(fā)利用。目前，國(guó)內(nèi)外還未確定羅非魚頭骨、脊骨、魚鰭和魚尾中CS的含量和類型。

本研究以羅非魚副產(chǎn)物不同部位為原料制備CS，并對(duì)其理化性質(zhì)和精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，評(píng)估羅非魚下腳料是否可以作為商品化CS的一個(gè)潛在來源，旨在為羅非魚副產(chǎn)物的高值化開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚副產(chǎn)物購(gòu)自廣東省湛江市遂溪縣恒誠(chéng)生物科技有限公司，于-20 ℃冷凍保藏。

硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；CS（CS-A、CS-C） 上海麥克林生化科技有限公司；Savinase 16L 美國(guó)Sigma公司；2709堿性蛋白酶南京龐博生物工程有限公司；D-甘露糖（D-mannose，Man）、GlcA、D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，GalA）、D-無水葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）、D-木糖（D-xylose，Xyl）、阿拉伯糖（L-arabinose，Ara）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、氨基半乳糖（D-galactosamine，GalN）、GlcNAc 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200LC高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Agilent公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)、AUW120型電子分析天平日本島津公司；Tensor-27傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司；FD8508真空冷凍干燥機(jī) 韓國(guó)ilshin公司；Varioskan Flas全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Sorval Lynx6000高速落地離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；HL-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的制備

取新鮮的羅非魚副產(chǎn)物按魚頭、魚鰭、魚脊骨、魚尾切分為4 個(gè)部位，分別進(jìn)行蒸煮除去多余的肌肉等雜質(zhì)，用乙醇浸泡過夜，濕骨放入65 ℃烘箱烘干，然后粉碎成粉末，骨粉在-80 ℃貯存?zhèn)溆?。?0 g不同部位的骨粉，按料液比1∶25（g/mL）加入50 mmol/L Na2CO3溶液，調(diào)節(jié)pH 7.0，再加200 μL Savinase 16L，55 ℃水浴攪拌4 h，100 ℃滅酶10 min。冷卻到室溫，加入終質(zhì)量濃度5.4 mg/mL的2709堿性蛋白酶，50 ℃反應(yīng)2 h，100 ℃滅酶10 min。冷卻到4 ℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液。按濾液質(zhì)量加入5%三氯乙酸靜置3 h，離心收集上清液，3 倍乙醇醇沉4 ℃過夜。離心收集沉淀，溶于20 mmol/L Na2SO4溶液，緩慢滴加質(zhì)量濃度6 g/100 mL氯化十六烷基吡啶溶液直至不再有沉淀析出。離心收集沉淀復(fù)溶于2 mol/L NaCl溶液-乙醇（100∶15，V/V）溶液，然后3 倍乙醇醇沉4 ℃過夜。離心得到沉淀，用蒸餾水溶解透析24 h，濃縮，冷凍干燥，得到不同部位的CS。提取率計(jì)算公式如下：

式中：m1為樣品質(zhì)量/g；m2為原料質(zhì)量/g。

1.3.2 羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS理化性質(zhì)測(cè)定

CS含量測(cè)定：采用硫酸-咔唑法[13]，以硫酸軟骨素鈉為標(biāo)準(zhǔn)品；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用Folin-酚法[14]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；GlcA含量測(cè)定：采用硫酸-咔唑法[15]，以GlcA為標(biāo)準(zhǔn)品；GlcN含量測(cè)定：采用Elson-Morgan法[16]，以GlcN為標(biāo)準(zhǔn)品；硫酸基含量測(cè)定：采用BaCl2-明膠比濁法[17]，以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 紫外光譜掃描

將CS標(biāo)準(zhǔn)品和4 個(gè)部位制備的CS用蒸餾水配成0.25 mg/mL的溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，以吸光度為縱坐標(biāo)、波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)繪制光譜圖。

1.3.3.2 醋酸纖維膜電泳

稱4 個(gè)部位制備的CS、CS-A、CS-C各5 mg，用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。以pH 3.0的0.1 mol/L吡啶-0.47 mol/L甲酸混合溶液，作為電泳緩沖液，在7 mA電流下電泳20 min。結(jié)束后用阿利新藍(lán)溶液染色（2%醋酸溶液作為溶劑）15 min，再用2%醋酸溶液脫色10 min。

1.3.3.3 傅里葉紅外光譜掃描

采用硫化鉀壓片法，稱取硫酸軟骨素鈉和4 個(gè)部位CS各1 mg，與100 mg干燥后的溴化鉀在瑪瑙研缽中充分研磨混勻，壓成透明薄片于400～4 000 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.3.4 分子質(zhì)量測(cè)定

稱取5 mg 4 個(gè)部位CS樣品，溶于1 mL超純水中，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后采用高效凝膠過濾色譜測(cè)定樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。色譜條件：色譜柱UltrahydrogelTMLinear（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃。

1.3.3.5 單糖組成測(cè)定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）-柱前衍生化HPLC法[18]，以CS-A、CS-C為對(duì)照對(duì)4 個(gè)部位制備的CS進(jìn)行單糖組成分析。色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18分離柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.74）-乙腈（83∶17，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm，紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.3.6 二糖組成測(cè)定

根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定[19]，采用強(qiáng)陰離子交換-HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行二糖組成分析。色譜條件：Hypersil SAX柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm；流動(dòng)相：A為水（pH 3.5），B為2 mol/L NaCl溶液（pH 3.5）；進(jìn)樣量20 μL；洗脫程序：0～4 min，100% A、0% B；4～45 min，100%～50% A、0%～50% B。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

表1 羅非魚不同部位CS的理化性質(zhì)比較Table 1 Comparison of physicochemical properties of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

如表1所示，羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的理化性質(zhì)具有差異性。4 個(gè)部位CS的總糖含量和糖醛酸含量沒有顯著差異。魚頭和魚尾的CS含量、GlcN含量、硫酸基含量沒有顯著差異。其中魚頭部位的CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取率最高，分別達(dá)到（90.37±1.77）%和1.02%，可能是CS主要存在于軟骨中；魚尾、魚鰭和魚脊骨CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（83.33±17.88）%、（59.76±1.22）%和（52.01±3.15）%。GlcN質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為魚尾、魚頭、魚鰭、魚脊骨，最高達(dá)（19.28±1.62）%，最低為（2.49±0.62）%。4 個(gè)部位CS的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為魚頭（22.89±0.11）%、魚尾（22.72±2.92）%、魚鰭（18.34±0.42）%、魚脊骨（12.56±0.28）%，差異明顯。4 個(gè)部位CS的蛋白質(zhì)含量較低，說明三氯乙酸除蛋白效果較好。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外波長(zhǎng)掃描光譜

如圖1所示，羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS和CS標(biāo)準(zhǔn)品都在190～200 nm之間具有糖類特征吸收峰，且峰形均較窄、尖銳、無其他雜峰。其中魚頭和魚脊骨CS在260 nm波長(zhǎng)處有微弱的吸收峰，說明含有少量的核酸。4 個(gè)部位CS在280 nm波長(zhǎng)處都沒有蛋白質(zhì)的吸收峰[20]，表明純度較好。

圖1 羅非魚不同部位CS的紫外光譜Fig. 1 UV spectra of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

2.2.2 醋酸纖維膜電泳

圖2 羅非魚不同部位CS的電泳圖Fig. 2 Acetate cellulose electrophoresis patterns of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia and chondroitin sulfate standard

根據(jù)不同類型CS的遷移率不同，從而對(duì)其進(jìn)行鑒別[21]。如圖2所示，CS-C和CS-A的結(jié)構(gòu)相似，但CS-C的硫酸化程度和電荷密度較高，因此遷移率表現(xiàn)比CS-A快。羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的電泳條帶單一、較窄，說明不含其他糖胺聚糖且電荷均一。4 個(gè)樣品的遷移率與CS標(biāo)準(zhǔn)品接近，均含有不同比例的CS-A和CS-C。

2.2.3 傅里葉變化紅外光譜分析

圖3 羅非魚不同部位CS的紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectra of chondroitin sulfate in four body parts of tilapia

表2 羅非魚不同部位CS的紅外光譜分析Table 2 Infrared spectral analysis of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

如圖3所示，4 個(gè)部位CS在4 000～1 300 cm-1范圍內(nèi)無明顯區(qū)別，而在1 300～400 cm-1指紋區(qū)域內(nèi)有細(xì)微差別。魚頭和魚尾CS紅外圖譜在指紋區(qū)與CS-C標(biāo)準(zhǔn)品相近，而魚脊骨和魚鰭CS與CS-A標(biāo)準(zhǔn)品相似。如表2所示，4 個(gè)樣品CS相同之處在于：在3 400 cm-1附近處由O—H伸縮振動(dòng)引起，說明存在氫鍵，且峰形均較寬；2 900 cm-1附近有糖類物質(zhì)的特征吸收峰[22]；1 640 cm-1和1 550 cm-1附近有—NHCOCH3—的C＝O伸縮振動(dòng)和N—H變角振動(dòng)，屬于酰胺I吸收帶[23]；1 420 cm-1附近存在羧基的C＝O伸縮振動(dòng)；1 370 cm-1附近有以GlcA形式存在的O—H變角振動(dòng)[24]；1 240 cm-1附近存在硫酸基；1 040 cm-1和920 cm-1附近存在吡喃糖伸縮振動(dòng)，說明4 個(gè)部位CS都存在糖環(huán)、乙酰氨基、硫酸基、羥基和羧基等官能團(tuán)，具有CS的基本結(jié)構(gòu)[25]。

2.2.4 分子質(zhì)量分析

圖4 羅非魚不同部位CS分子質(zhì)量分布圖Fig. 4 Molecular mass analysis of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia

表3 羅非魚不同部位CS分子質(zhì)量分析Table 3 Molecular mass analysis of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

如圖4所示，羅非魚下腳料不同部位CS的出峰時(shí)間和CS標(biāo)準(zhǔn)品一致，其中倒峰是溶劑NaNO3的峰，相比較而言樣品CS的峰形對(duì)稱性較差且有雜峰，表明樣品中含有小分子雜質(zhì)[26]。將保留時(shí)間代入不同分子質(zhì)量葡聚糖所得的線性回歸方程，結(jié)果如表3所示。CS的相對(duì)分子質(zhì)量一般在5 000～50 000范圍內(nèi)[27]，羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的分子質(zhì)量屬于CS類。比較發(fā)現(xiàn)，鯊魚來源CS-C標(biāo)準(zhǔn)品的mn、mw和mz均顯著高于牛軟骨來源的CS-A標(biāo)準(zhǔn)品。魚脊骨和魚鰭CS的mn較接近，分別為18 402和19 481，接近但均低于CS-A。而魚頭和魚尾CS的mn介于CS-A和CS-C之間，分別為51 422和76 371。魚頭CS的mw和mz都高于其他3 個(gè)部位CS，顯著低于CS-C標(biāo)準(zhǔn)品。分散系數(shù)是（mw/mn）用于衡量分子質(zhì)量的分布廣度，魚尾CS的分散系數(shù)最低，說明其分子質(zhì)量分布較窄，其次是魚頭CS為3.77，均比鯊魚來源CS-C的分散系數(shù)低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[28]，來自牛氣管相對(duì)分子質(zhì)量為10 000～15 000，豬軟骨相對(duì)分子質(zhì)量為9 000～13 000，雞軟骨相對(duì)分子質(zhì)量為7 800～12 800，安康魚骨相對(duì)分子質(zhì)量為48 680，鱈魚骨相對(duì)分子質(zhì)量為18 120，鮭魚骨相對(duì)分子質(zhì)量為20 070，表明不同來源CS的分子質(zhì)量有明顯差異，且軟骨魚類和硬骨魚類分子質(zhì)量之間也有區(qū)別，而羅非魚不同部位CS的分子質(zhì)量更接近硬骨魚類。

2.2.5 單糖組成分析

圖5 HPLC法對(duì)羅非魚不同部位CS單糖組成分析Fig. 5 HPLC chromatograms showing the monosaccharide composition of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia

表4 羅非魚4 個(gè)部位的單糖組成分析Table 4 Analysis of monosaccharide composition of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia

采用PMP衍生法，以CS-A和CS-C為參照，對(duì)羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS進(jìn)行單糖組成測(cè)定，色譜圖如圖5所示，分析結(jié)果如表4所示。4 個(gè)部位CS和標(biāo)準(zhǔn)品的單糖種類相似，主要含有GlcA、Glc、GalN，以及少量的GlcN、GalA、GlcNA、Gal、Xyl、Ara。魚頭CS不含有GalA，魚尾CS含有少量的Man。不同部位CS在13 min都在出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間不匹配的未知峰，可能是未降解的寡糖片段[29]，這與分子質(zhì)量分析結(jié)果一致。

2.2.6 二糖組成分析

圖6 羅非魚不同部位CS二糖組成圖Fig. 6 Chromatograms showing the disaccharide composition of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

表5 羅非魚不同部位CS二糖組成分析Table 5 Disaccharide composition of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

將羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS用硫酸軟骨素酶降解，利用強(qiáng)陰離子交換-HPLC對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜圖如圖6所示。CS-A和CS-C的硫酸基團(tuán)位置和數(shù)量不同，CS-A中Δdi4S比Δdi6S多，而CSC相反[30]。如表5所示，4 個(gè)部位CS均不含三硫酸化二糖。其中魚頭CS不含有二硫化二糖，Δdi6S（46.10%）比Δdi4S（41.01%）含量高，屬于CS-C。魚尾也是CS-C，與魚頭不同的是還含有0.68%二硫酸二糖（Δdi2,6S）。鯊魚CS主要由單硫酸二糖Δdi6S（40.8%）和Δdi4S（34.9%）組成[31]，從羅非魚頭和魚尾提取的CS與鯊魚CS的二糖組成相似。Δdi4,6S（1.21%）只在魚脊骨CS中存在，除此之外還包含Δdi2,4S（0.46%），但Δdi4S（71.86%）含量最高，主要為CS-A。魚鰭CS與魚脊骨CS二糖組成相似，但不含有Δdi4,6S而是含有0.41%的Δdi2,6S二硫化二糖，主要為CS-A。根據(jù)Δdi4S和Δdi6S物質(zhì)的量比（4S/6S）可得出相同結(jié)論，與紅外光譜掃描的結(jié)果一致。硫酸化程度和電荷密度呈正比[32]，4 個(gè)部位CS的電荷密度0.96～0.81不等，其中魚鰭CS電荷密度最高，硫酸根含量最高；其次是魚脊骨CS，最低的是魚尾CS，這與醋酸纖維膜電泳結(jié)果相同。

3 結(jié) 論

利用Savinase 16L和2709堿性蛋白酶雙酶酶解從羅非魚下腳料中提取CS，對(duì)其理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)不同部位CS的純度從90.37%～52.01%不等，糖醛酸含量相近，GlcN含量差別明顯。醋酸纖維膜電泳、單糖組成和紅外光譜進(jìn)一步分析表明4 個(gè)部位制備的樣品均為CS，但類型不同。通過二糖組成對(duì)其進(jìn)行鑒定，魚頭和魚尾CS硫酸化主要在GalNAc的C6位，但魚尾含有0.68%的CS-D，此類型在軟骨魚中存在較多；魚脊骨和魚鰭CS硫酸化主要在GalNAc的C4位，區(qū)別是魚脊骨含有1.21%的CS-E。陸地來源中提取的CS基本不存在二硫化二糖，因此從羅非魚副產(chǎn)物CS分離出的二硫化二糖可以作為鑒定CS來源的標(biāo)志。

羅非魚頭和魚尾的Δdi6S含量比鯊魚高，分別為46.01%和41.44%，4S/6S為0.89和0.92，與鯊魚的二糖組成相似。因此，無論從資源、經(jīng)濟(jì)還是安全性的角度，羅非魚副產(chǎn)物代替鯊魚作為CS新來源的優(yōu)勢(shì)顯而易見。本研究結(jié)果可為硬骨魚類CS的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，使得加工生產(chǎn)中的廢料變成高附價(jià)值產(chǎn)品成為可能。

CS具有抗血栓、抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等活性，也會(huì)對(duì)生物材料的性能產(chǎn)生影響[33]。CS的活性和功能與其特定的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有密切的關(guān)系，會(huì)受到硫酸化的位點(diǎn)和程度以及分子質(zhì)量影響。因此，本研究從羅非魚加工副產(chǎn)物不同部位制備的CS可以為其構(gòu)效關(guān)系、活性研究以及產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考[34]。