溫度對堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系色澤、理化特性及抗氧化活性的影響

譚繼恩，姚 瑤，吳 娜，徐明生，趙 燕，劉會平，涂勇剛,*

（1.江西農業(yè)大學 江西省農產品加工與質量控制工程實驗室，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

蛋清是食品工業(yè)的重要營養(yǎng)資源和寶貴成分，其主要由水（88%）和蛋白質（11%）組成。卵白蛋白是蛋清主要蛋白質，約占蛋清總蛋白質的54%[1]。卵白蛋白在蛋清的功能特性如凝膠性、起泡性及乳化性中起重要作用[2]。卵白蛋白由385 個氨基酸組成，分子質量約為45 kDa，等電點（pI）為4.5[3]。卵白蛋白是一種單聚糖蛋白，在其第292位的天冬酰胺（Asn）結合了一個單一碳水化合物[4]。在卵白蛋白核心內部有4 個游離硫醇基團，在第73位和第120位的半胱氨酸（Cys）之間存在1 個二硫鍵。

前期實驗室發(fā)現當腌制過程中溫差較大時，或在低溫貯藏過程中皮蛋蛋白會出現返色現象，這說明溫度對皮蛋蛋白色澤具有重大影響。且在前期研究中，實驗構建了由蛋清和NaOH組成的模型，發(fā)現美拉德反應抑制劑的添加可以抑制模型色澤的形成；并基于此模型對禽蛋蛋清和脫糖蛋清進行堿誘導處理，發(fā)現蛋清在脫糖前后的色澤存在顯著差異?；谝陨涎芯拷Y果，認為皮蛋蛋白色澤主要是由強堿誘導的美拉德反應導致，此推測與皮蛋色澤相關的報道一致[5-7]。由于卵白蛋白是蛋清中含量最多的蛋白質，且前期實驗室對蛋清凝膠的研究表明卵白蛋白對強堿誘導的蛋清凝膠的形成具有很大的貢獻作用[8]?；诖耍J為卵白蛋白在皮蛋腌制過程中對皮蛋蛋白色澤的形成也可能起很大作用，為了探討皮蛋蛋白色澤是否主要由卵白蛋白在堿作用下與糖發(fā)生美拉德反應造成，通過構建卵白蛋白-葡萄糖的體外模型探討溫度對其色澤等的影響。蛋清除了含有大量蛋白質，還含有一定量還原糖，其還原糖質量分數為0.4%[9]。蛋清中卵白蛋白-還原糖質量比大致為15∶1，因此本實驗構建的模型中卵白蛋白-葡萄糖質量比為15∶1。

美拉德反應，又稱非酶褐變反應，是指在食品熱處理或儲存過程中含羰基化合物（如還原糖）與含氨基化合物（如氨基酸、肽、蛋白質等）通過縮合、聚合而生成類黑精的反應[10]。在美拉德反應期間會產生很多不同種類的早期、中間及晚期產物，它們統(tǒng)稱為美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）。美拉德反應受許多因素影響，如溫度、pH值、水分活度、反應物的類型及反應時間等[11]。許多研究表明MRPs具有抗氧化活性，其展現抗氧化活性的機制包括破壞自由基鏈、螯合過渡金屬，分解過氧化氫和清除活性氧等[10,12]。因此本研究測定卵白蛋白-葡萄糖體系在堿作用后的抗氧化活性，以期開發(fā)一種應用在食品工業(yè)中的天然抗氧化劑。

幾十年來，對美拉德反應的研究都集中在熱誘導和微波誘導，而對堿誘導美拉德反應的研究甚少。本實驗將卵白蛋白-葡萄糖混合液與2 g/100 mL NaOH溶液混合后放置在不同溫度（4、25、37 ℃）孵育不同時間（1、3、5、7 d）。由于皮蛋的低溫貯藏溫度為4 ℃，腌制溫度為25 ℃，且蛋清蛋白在過高的溫度下會發(fā)生熱變性，因此選擇4、25、37 ℃作為考察溫度。通過顏色、褐變強度、熒光強度和pH值等的變化評估體系理化特性的變化，通過還原力，2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除活性及Fe2+螯合活性評估體系抗氧化活性的變化。本研究將對皮蛋蛋白色澤形成規(guī)律有更深入的了解，豐富美拉德反應的理論體系，且有助于開發(fā)一種應用在食品工業(yè)中的天然抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白、ABTS 美國Sigma公司；葡萄糖、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；溴化鉀（光譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

色差儀 美國亨特工程公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 賽默飛世爾科技公司；垂直電泳儀 美國伯樂公司；氨基酸自動分析儀 日本日立有限公司；多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；UV-5200PC紫外-可見光分光光度計 元析儀器（上海）有限公司；970CRT熒光分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 反應液的制備

將卵白蛋白與葡萄糖用超純水配制成蛋白質量濃度6 g/100 mL、糖質量濃度0.4 g/100 mL的混合溶液。將混合溶液與質量濃度2 g/100 mL NaOH溶液以2∶1的比例混合，迅速攪拌均勻后放置在不同溫度（4、25、37 ℃）孵育不同時間（1、3、5、7 d）。卵白蛋白-葡萄糖混合液用作對照。

1.3.2 顏色的測定

使用色差儀測定在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系隨孵育時間的顏色變化。在測定前用白板和黑板對色差儀進行校正。取反應后的樣品液于比色皿中進行顏色的測定。色差儀可以提供3 個顏色參數：L*（亮度參數，其值0～100表示從黑色到白色，值越高越白）、a*（紅綠參數，其值-100～100表示從綠色到紅色，正值表示紅色，負值表示綠色）、b*（黃藍參數，其值-100～100表示從藍色到黃色，正值表示黃色，負值表示藍色）[13]。

1.3.3 紫外吸光度的測定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改，將樣品液稀釋25 倍后，用紫外-可見光分光光度計測定稀釋液在294 nm波長處的吸光度。

1.3.4 褐變程度的測定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改，取1.5 mL樣品液于石英比色皿中，用紫外-可見光分光光度計測定樣品液在420 nm波長處的吸光度。

1.3.5 熒光強度的測定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改，將樣品液稀釋25 倍后，用熒光分光光度計測定稀釋液在激發(fā)波長為347 nm，發(fā)射波長為415 nm處的熒光強度。

1.3.6 pH值的測定

使用前對pH計進行校正，用校正好的pH計測定樣品液的pH值。

1.3.7 FTIR分析

參考Sheng Long等[15]的方法略作修改，測定卵白蛋白-葡萄糖體系的FTIR。將不同反應時間的卵白蛋白-葡萄糖體系混合液在-80 ℃冷凍完全，然后在真空冷凍干燥機中冷凍干燥。將干燥好的樣品與KBr以質量比1∶100混合，充分研磨后用壓片機壓成厚度小于0.5 mm的透明薄片。用FTIR對薄片進行掃描（分辨率4.0 cm-1、掃描次數32、波數范圍4 000～400 cm-1）。用OMNIC 6.0數據收集軟件對收集的原始譜圖做進一步分析。

1.3.8 氨基酸分析

參考Zhong Lei等[16]的方法略作修改，對卵白蛋白-葡萄糖體系的氨基酸含量進行分析。在凍干的粉末中加入6 mol/L HCl溶液，于110 ℃的水解爐中水解22 h。取出水解樣品，冷卻至室溫后，將水解液過濾至50 mL容量瓶中，用超純水定容。取1.0 mL濾液至15 mL試管中，用試管濃縮儀在40～50 ℃的加熱環(huán)境下減壓干燥，干燥后殘留物用1～2 mL超純水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。往干燥后試管中加入1～2 mL檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 2.2）溶解殘留物，振蕩混勻后用0.22 μm的濾膜過濾溶液，而后用自動氨基酸分析儀進行分析。

1.3.9 抗氧化活性的測定

1.3.9.1 抗氧化活性成分的制備

將在不同溫度孵育不同時間的卵白蛋白-葡萄糖溶液于-80 ℃冷凍完全后進行冷凍干燥，將干燥后的樣品置于干燥器中進行保存以進行抗氧化活性的測定。

1.3.9.2 還原力的測定

參考Tan Ji’en等[14]的方法并略作修改。取1.0 mL 8 mg/mL樣品液，加入1.0 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和1.0 mL鐵氰化鉀溶液（質量濃度1 g/100 mL）。而后把上述反應液于50 ℃的水浴鍋中水浴20 min，取出冷卻至室溫后，加入1.0 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混勻后3 000 r/min離心10 min。取1.0 mL上清液加入1.0 mL蒸餾水和200 μL氯化鐵溶液，混勻后用酶標儀測定其在700 nm波長處的吸光度。

1.3.9.3 ABTS陽離子自由基清除活性的測定

ABTS陽離子自由基的制備：將7 mmol/L ABTS儲備溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫下于黑暗中放置16 h[17]。取1.0 mL 0.2 mg/mL的樣品液，加入1.0 mL ABTS陽離子自由基工作液，混勻后于黑暗中放置6 min，而后用酶標儀測定其在734 nm波長處的吸光度。樣品ABTS陽離子自由基清除活性計算公式如下：

式中：As為樣品在734 nm波長處的吸光度；A0為空白在734 nm波長處的吸光度（即樣品液被超純水取代）。

1.3.9.4 Fe2+螯合活性的測定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改。將1.0 mL 2 mg/mL樣品液與1.85 mL超純水混合，而后加入0.05 mL 0.2 mol/L FeCl2溶液，于室溫放置30 s后，即刻加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪溶液?；靹蚝笥谑覝胤胖?0 min，而后3 000 r/min離心5 min，最后用酶標儀測定其在562 nm波長處的吸光度。用超純水代替樣品溶液作為空白。樣品的Fe2+螯合活性計算公式如下：

式中：As為樣品溶液的吸光度；A0為空白的吸光度。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系顏色變化

食物顏色反映的是與原料相關的有色天然產物或加工過程中產生的有色化合物[18]。卵白蛋白-葡萄糖體系在不同溫度孵育不同時間的顏色變化見圖1a。在4 ℃孵育時，卵白蛋白-葡萄糖體系的顏色沒有出現明顯變化；在25 ℃孵育時，其顏色隨著孵育時間延長而逐漸加深；在37 ℃孵育時，其顏色在3 d內迅速加深，而后隨著孵育時間延長其顏色逐漸由黃色轉變成棕色。卵白蛋白-葡萄糖體系顏色的變化初步表明卵白蛋白與葡萄糖在堿作用下可能發(fā)生了美拉德反應。

圖1 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系顏色隨著孵育時間的變化Fig. 1 Changes in color of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

圖1b～d展示了卵白蛋白-葡萄糖體系在不同溫度孵育不同時間的顏色參數變化。在4 ℃和25 ℃孵育時，卵白蛋白-葡萄糖體系的L*值在孵育5 d內隨孵育時間的延長而逐漸下降（P＜0.05），當孵育7 d又輕微上升（P＜0.05）；而在37 ℃孵育時，其L*值在孵育3 d內逐漸下降（P＜0.05），然后隨著孵育時間的繼續(xù)延長而逐漸上升（P＜0.05）。L*值下降可能是由于棕色色素的形成所致[13]，這與前面的顏色變化結果相對應。在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的a*值均為負值，這表明體系反映出更多綠色特征。在4 ℃孵育時，體系的b*值隨著孵育時間延長而輕微下降；在25 ℃和37 ℃孵育時，在整個孵育期間其b*值呈先上升后下降的趨勢。且在3 個不同溫度下體系的b*值均為負值，表明體系在整個孵育期間都展示出黃色特征。這3 個顏色參數在孵育期間的變化可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應，從而生成了各種各樣的中間和最終產物所致[19]。

2.2 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系紫外吸光度的變化

美拉德反應過程中形成的中間產物通常在294 nm波長處有最大吸收峰[20]。不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在294 nm吸光度隨孵育時間的變化如圖2所示。與未加堿的卵白蛋白-葡萄糖混合物相比，卵白蛋白-葡萄糖體系在4 ℃孵育時，其在294 nm波長處的吸光度隨著孵育時間延長而不斷上升（P＜0.05）；在25 ℃孵育時，其在294 nm波長處的吸光度在前5 d內隨著孵育時間延長而逐漸上升（P＜0.05），到第7天時趨于平穩(wěn)（P＞0.05）；在37 ℃孵育時，其在294 nm波長處吸光度在整個孵育期間呈現先上升后下降（P＜0.05）的變化趨勢，在第5天達到最大值。在294 nm波長處吸光度的增加表明卵白蛋白-葡萄糖體系在孵育過程中形成了美拉德反應中間產物。先前的研究表明，隨著反應時間的延長，一些美拉德反應中間產物會進一步發(fā)生聚合反應生成棕色物質，從而導致中間產物含量的減少[21-22]。這可能就是卵白蛋白-葡萄糖體系在37 ℃孵育后期其在294 nm波長處吸光度下降的原因。孵育溫度越高，卵白蛋白-葡萄糖體系在294 nm波長處的吸光度也越高，這可能是因為在不同溫度下美拉德反應的反應速率不同，在更高溫度下，中間產物的形成速率更快。這與Jin Wengang等[20]對扇貝性腺水解產物-核糖體系的研究觀察到的結果一致，發(fā)現其在294 nm波長處吸光度隨反應溫度升高而升高。

圖2 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在294 nm波長處吸光度隨著孵育時間的變化Fig. 2 Changes in absorbance at 294 nm of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.3 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系褐變程度變化

美拉德反應的后期階段非常復雜，在這個階段會產生各種各樣的含氮或不含氮的棕色聚合物，這些聚合物在420 nm波長處有最大吸收峰，因此可用420 nm波長處的吸光度指示棕色聚合物的生成[23]。如圖3所示，在3 個不同溫度下孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在420 nm波長處吸光度均隨孵育時間延長而呈上升趨勢（P＜0.05），只是在4 ℃孵育時，其吸光度只是輕微上升，而在25 ℃和37 ℃孵育時，其上升趨勢更為顯著。且孵育溫度越高，體系在420 nm波長處吸光度越大。與卵白蛋白-葡萄糖混合物在420 nm波長處吸光度相比，孵育后卵白蛋白-葡萄糖體系在420 nm波長處吸光度的增加說明孵育期間卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應，生成了棕色聚合物。孵育溫度更高，體系在420 nm波長處的吸光度越高是因為溫度越高，美拉德反應速率越快，導致生成更多的棕色聚合物。這結果與體系在294 nm波長處吸光度結果一致，都是孵育溫度越高，體系吸光度也相對越高。

圖3 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在420 nm波長處吸光度隨著孵育時間的變化Fig. 3 Changes in absorbance at 420 nm of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.4 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系熒光強度的變化

在美拉德反應中間階段除生成具有紫外吸收的物質，還生成具有熒光吸收的物質，這些具有熒光吸收的物質通常被認為是棕色化合物的前體[24]。具有熒光吸收的中間產物與具有紫外吸收的中間產物并不相同，它們具有不同的動力學，具有熒光吸收的中間產物相對來說更具有反應性，更容易轉變?yōu)樽厣酆衔颷25]。如圖4所示，在3 個不同孵育溫度下，卵白蛋白-葡萄糖體系的熒光強度都隨孵育時間延長而不斷增加（P＜0.05）。但是與其在294 nm和420 nm波長處吸光度不同的是，在37 ℃孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系熒光強度是3 個溫度中最低的，最高在25 ℃，其次在4 ℃。熒光強度的增加表明卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應，生成了具有熒光吸收的物質。而在37 ℃孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的熒光強度最低可能是因為美拉德反應在高溫下具有更高的反應速率，導致在37 ℃條件下生成的熒光物質更快地轉變成了棕色化合物。在37 ℃孵育卵白蛋白-葡萄糖體系的熒光強度最低，而其在294 nm波長處吸光度卻最高，這可能是因為具有熒光吸收的中間產物比具有紫外吸收的中間產物更具反應性所致。

圖4 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系熒光強度隨著孵育時間的變化Fig. 4 Changes in fluorescence intensity of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.5 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系pH值變化

在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的pH值隨著孵育時間的變化見圖5。第0天為對照組即卵白蛋白-葡萄糖混合物的pH值，加入2 g/100 mL NaOH溶液后，體系的pH值迅速上升（P＜0.05），而后隨著孵育時間的繼續(xù)延長，在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的pH值都呈現逐漸下降的趨勢（P＜0.05），且在更高的孵育溫度下，其pH值下降得更迅速。與結果相似的是，有研究者發(fā)現卵白蛋白-葡萄糖體系在微波條件下處理時，其pH值也是隨著處理時間的延長而呈現出逐漸下降的趨勢[26]。在孵育過程中體系pH值的下降可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在孵育過程中發(fā)生了美拉德反應，生成了一些酸性物質所致。有研究者在發(fā)生美拉德反應后的體系中發(fā)現了酸性物質（如甲酸、乙酸、甲基乙二醛、乙二醛）的存在，這些酸性物質的存在會降低體系的pH值[20,24]。且當葡萄糖與卵白蛋白反應時，會消耗卵白蛋白中的氨基酸，這也會降低體系的pH值。而在更高孵育溫度下體系的pH值更低是因為美拉德反應在更高溫度下具有更高的反應速率，因此會生成更多的酸性物質，同時也會消耗更多的氨基酸，從而使體系的pH值下降得更快。這與在294 nm以及420 nm波長處的吸光度結果一致，在更高溫度下體系在294 nm和420 nm波長處的吸光度越高，說明在更高溫度下產生了更多的中間和最終產物，而在更高溫度下pH值下降越快是因為產生了更多的酸性物質。

圖5 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系pH值隨著孵育時間的變化Fig. 5 Changes in pH of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.6 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系FTIR光譜的變化

蛋白質在紅外區(qū)域有幾個特征吸收帶，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）和II帶（1 600～1 500 cm-1）是研究蛋白質二級結構最具價值的吸收帶[27]。當蛋白質發(fā)生反應后，其分子水平上的官能團會發(fā)生修飾，這在紅外光譜上表現為新條帶的出現或舊條帶的消失，以及峰強度和位置的變化。

圖6展示了卵白蛋白以及在不同溫度孵育不同時間的卵白蛋白-葡萄糖體系的紅外圖譜。在3 個不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在1 655 cm-1和1 540 cm-1兩處吸收峰的強度都比卵白蛋白在此兩處的吸收峰強度更低，且隨著孵育時間的延長，其強度呈不斷下降的趨勢。這表明酰胺I帶和II帶發(fā)生了修飾，可能是因為在孵育過程中卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應，消耗了卵白蛋白的氨基所致。Su Junfeng等[28]研究得到相似的結果，實驗發(fā)現在羧甲基纖維素和大豆蛋白發(fā)生美拉德反應期間，酰胺I帶和II帶處的吸收峰強度隨著反應時間的延長而逐漸下降。除了酰胺I帶和II帶峰強度的下降，在1 453 cm-1和1 239 cm-1兩處的峰強度也在孵育后呈現逐漸下降的趨勢，進一步說明卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應。且卵白蛋白-葡萄糖體系孵育后，在884 cm-1處出現了一個新的吸收峰，這個新吸收峰可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在堿作用下生成的MRPs（如Amadori化合物、席夫堿或吡嗪）引起的。Liu Qian等[29]報道形成MRPs（Amadori化合物、席夫堿和吡嗪）的鍵在1 800～800 cm-1處具有吸收峰。其他一些學者也觀察到相似的現象，即反應體系發(fā)生美拉德反應后會在紅外圖譜中出現新的吸收峰[15-16]。FTIR表明不同溫度下孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系發(fā)生了美拉德反應，葡萄糖成功與卵白蛋白綴合。

圖6 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系FTIRFig. 6 FTIR spectra of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.7 氨基酸分析

如表1所示，與卵白蛋白的總氨基酸含量相比，在不同溫度孵育后的卵白蛋白-葡萄糖體系的總氨基酸含量都呈現出明顯的下降趨勢，這可能是由于孵育期間卵白蛋白的氨基與葡萄糖的羰基發(fā)生了美拉德反應，消耗了一部分卵白蛋白中的氨基酸所致[30]。除了總氨基酸含量在孵育后呈下降外，各種氨基酸含量在孵育后也呈現出下降趨勢。與其他氨基酸相比，絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）和Cys展現出較明顯的下降趨勢，在孵育后分別下降約50%、70%和100%。這表明3種氨基酸的反應性高，是卵白蛋白與葡萄糖在堿處理下發(fā)生美拉德反應的主要氨基酸。尤其是Cys，在孵育后其含量下降到0%左右，說明它基本都參與了美拉德反應，與葡萄糖形成了共軛物，因此其含量下降很快，這也說明Cys的反應性比其他氨基酸都高，是堿處理下卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應的主要結合位點[31]。這與Zhong Lei等[16]研究的結果相似，他們發(fā)現在燕麥蛋白分離物與平菇β-葡聚糖混合孵育后Cys的含量下降最多。Chen Zhangyi等[8]發(fā)現在堿處理過程中，蛋清中的巰基含量隨著處理時間的延長不斷上升，而二硫鍵含量隨著處理時間的延長不斷下降，這說明堿會破壞蛋清中的二硫鍵而使巰基暴露出來。因此當卵白蛋白-葡萄糖體系在堿處理過程中，卵白蛋白第73位和第120位的Cys之間存在的二硫鍵可能會被堿破壞，從而使Cys暴露出來，使其更易與葡萄糖發(fā)生反應，這可能就是堿處理過程中卵白蛋白中Cys具有最高反應性的原因。

在更高溫度下，體系氨基酸含量下降得更加迅速。這與顏色、紫外吸光度、褐變程度等的結果相似，都是在更高溫度下顯示出更顯著的變化。這進一步說明溫度越高，美拉德反應的反應性越高，因此在更高溫度下卵白蛋白中的氨基酸與葡萄糖發(fā)生反應的速率越快，導致其氨基酸含量下降得更快。

表1 卵白蛋白及不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的氨基酸含量Table 1 Amino acid contents of ovalbumin and ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods%

2.8 抗氧化活性

2.8.1 還原力

如圖7所示，與卵白蛋白-葡萄糖混合物還原力相比，在不同溫度孵育后，卵白蛋白-葡萄糖體系的還原力都有了很大的提升（P＜0.05）。但隨著孵育時間的進一步延長，不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系還原力都呈逐漸下降趨勢（P＜0.05）。孵育溫度越高，卵白蛋白-葡萄糖體系還原力也相對較高，而且其隨孵育時間的延長下降得也越快。與本實驗結果相似的是，有研究者發(fā)現卵白蛋白與葡萄糖在120 ℃濕熱處理20 min后，其還原力也有了顯著的提升[32]。卵白蛋白-葡萄糖體系在孵育后其還原力顯著上升可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應，生成了中間產物還原酮等。Amarowicz[33]報道，還原酮等中間產物因其具有捐贈氫原子來打斷自由基鏈的能力而展現出較高的還原力。當美拉德反應從中間階段進入后期階段時，在中間階段形成的中間產物還原酮等會進一步反應生成復雜的最終產物，從而失去還原力[33]。這可能就是卵白蛋白-葡萄糖體系還原力在孵育時間進一步延長后而不斷下降的原因。

根據Arrhenius原理，溫度升高會提高分子的動能和碰撞速率，從而使反應速率增加[34]。因此在更高的孵育溫度下，卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應的速率更快，從而能生成更多的還原酮等具有還原力的中間產物，這就是卵白蛋白-葡萄糖體系在更高溫度下具有更高還原力的原因。至于在更高孵育溫度下其還原力下降得更快，也是因為在更高溫度下前期生成的還原酮等中間產物轉變成最終產物的速率更快，從而使其還原力下降得更快。

圖7 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系還原力隨孵育時間的變化Fig. 7 Changes in reducing power of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.8.2 ABTS陽離子自由基清除活性

如圖8所示，與卵白蛋白-葡萄糖混合物相比，在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的ABTS陽離子自由基清除活性均在孵育1 d后顯著增加（P＜0.05）。而后在4 ℃和25 ℃孵育時，隨著孵育時間的進一步延長，其ABTS陽離子自由基清除活性未出現明顯變化（P＞0.05）；在37 ℃孵育時，其ABTS陽離子自由基清除活性隨著孵育時間的進一步延長而出現輕微下降（P＜0.05）。與本實驗結果相似，有研究者發(fā)現卵白蛋白與葡萄糖在120 ℃濕熱處理20 min后，其ABTS陽離子自由基清除活性也有了顯著提升[32]。有學者報道有些美拉德反應中間產物和最終產物可以作為氫原子供體，從而展現出ABTS陽離子自由基清除活性[35-36]。因此孵育后卵白蛋白-葡萄糖體系的ABTS陽離子自由基清除活性增加可能是因為卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應，生成了可以作為氫供體的中間產物和最終產物。當美拉德反應從中間階段進入最終階段時，中間產物會進一步反應生成最終產物，從而可能失去其ABTS陽離子自由基清除活性[33]。在3 個溫度下，只有在37 ℃孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的ABTS陽離子自由基清除活性下降是因為美拉德反應在更高的溫度下反應速率更快，因此可能在37 ℃時具有ABTS陽離子自由基清除活性的中間產物有一部分已轉化為最終產物，而在4 ℃和25 ℃時具有ABTS陽離子自由基清除活性的中間產物還沒有轉化為最終產物。而體系還原力與ABTS陽離子自由基清除活性隨孵育時間的變化趨勢不同可能是因為在不同的測定方法中起作用的物質不同。這說明MRPs的抗氧化活性很復雜。

圖8 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系ABTS陽離子自由基清除活性隨孵育時間的變化Fig. 8 Changes in ABTS radical cation scavenging activity of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.8.3 Fe2+螯合活性

由圖9可知，卵白蛋白-葡萄糖混合物的Fe2+螯合活性只有1.8%左右，當其在堿作用下在不同溫度下孵育1 d后，其Fe2+螯合活性有顯著提高（P＜0.05）。在4 ℃孵育時，隨著孵育時間的進一步延長其Fe2+螯合活性變化不大，只有在孵育7 d后才出現輕微下降（P＜0.05）。然而在25 ℃和37 ℃孵育時，其Fe2+螯合活性隨著孵育時間的進一步延長呈不斷下降的趨勢（P＜0.05）。有研究者報道MRPs是有效的金屬螯合劑，因為它們中的羥基和吡咯基團具有螯合金屬的作用[37-38]。卵白蛋白-葡萄糖體系在孵育后其Fe2+螯合活性顯著提高可能是因為在孵育過程中卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應生成了具有羥基和吡咯基團的MRPs。而隨著孵育時間的延長其Fe2+螯合活性出現輕微下降可能是因為某些具有Fe2+螯合活性的MRPs隨著美拉德反應的繼續(xù)進行進一步發(fā)生了反應，生成了更加復雜的MRPs，而失去了Fe2+螯合活性。至于在更高溫度下Fe2+螯合活性下降得更快的原因如前所述，是因為美拉德反應在更高溫度下的速率更快，因此更多具有Fe2+螯合活性的產物進一步反應生成更復雜的物質而失去抗氧化活性。

圖9 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系Fe2+螯合活性隨孵育時間的變化Fig. 9 Changes in Fe2＋-chelating activity of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

3 結 論

考察溫度對堿處理下卵白蛋白-葡萄糖體系顏色、物化特性及抗氧化活性的影響。孵育溫度越高，卵白蛋白-葡萄糖體系的顏色、紫外吸收、褐變程度以及熒光強度等指標展現出更顯著的變化。FTIR表明，堿作用下，卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應，氨基酸分析表明兩者發(fā)生美拉德反應的主要結合位點為Ser、His和Cys，最主要的結合位點為Cys。孵育后的卵白蛋白-葡萄糖體系的抗氧化活性與卵白蛋白葡萄糖混合相比有顯著提升，但隨孵育時間的延長有輕微的下降?？傊?，溫度對堿處理下卵白蛋白-葡萄糖體系顏色、物化性質及其抗氧化活性具有顯著影響，卵白蛋白可能在皮蛋腌制過程中對皮蛋蛋白顏色的形成起很大的作用。