棉花半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因GhGalT1啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

秦麗霞 李 靜 張換樣 李 盛 竹夢(mèng)婕 焦改麗 吳慎杰

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所, 山西運(yùn)城 044000

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y)廣泛存在于植物體內(nèi), 負(fù)責(zé)催化小分子化合物(激素、次級(jí)代謝物等)的糖基化, 將活性糖基從供體轉(zhuǎn)移到受體(小分子化合物), 從而改變這些化合物的生物化學(xué)性質(zhì)[1-2]。按照序列同源性及催化底物特性及糖苷鍵立體化學(xué)性質(zhì)將GTs分為94個(gè)不同的家族(http://www.cazy.org/fam/acc_GT.html)[3]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示GTs在調(diào)節(jié)植物激素和植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

在擬南芥中過(guò)量表達(dá) UGT84B1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出生長(zhǎng)素缺陷表型, 植株矮化, 多分枝, 葉片皺縮, 根系失去向地性生長(zhǎng)[4-5]。UGT74E2在體外能糖基化生長(zhǎng)素IBA, UGT74E2過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出矮化、多分枝, 抗鹽、抗旱性增強(qiáng)[6]。在煙草中過(guò)量表達(dá)玉米素合成相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶ZOG1, 導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因比非轉(zhuǎn)基因材料需多添加 10倍的玉米素才能誘導(dǎo)愈傷組織形成芽[7]。擬南芥UGT76C1、UGT76C2、UGT85A1、UGT73C1 和UGT73C5參與調(diào)控植物對(duì)細(xì)胞分裂素的響應(yīng)[8-9]。UGT73C5和 UGT73C6催化油菜素內(nèi)酯的糖基化,在擬南芥中過(guò)量表達(dá) UGT73C5植株表現(xiàn)出油菜素內(nèi)酯缺陷表型, 同時(shí)伴隨著高水平的油菜素內(nèi)酯糖苷物的積累, 而在突變體株系中則未檢測(cè)到油菜素內(nèi)酯糖苷物[10-12]。從擬南芥分離出的葉片傷口處檢測(cè)到茉莉酸糖苷的富集, 表明 GTs在激素調(diào)節(jié)和病原菌防御之間也起重要作用[13]。UGT73B1、UGT73B2、UGT73B3和UGT71C1功能缺失突變體增強(qiáng)了植物對(duì)氧化脅迫的抗性[14-16]。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)水楊酸合成糖基轉(zhuǎn)移酶 AtSGTl導(dǎo)致植株體內(nèi)水楊酸及其糖苷水平降低, 進(jìn)而增加對(duì)半活體營(yíng)養(yǎng)侵染型病原菌假單胞菌的敏感性[17]。雖然以上研究已表明糖基轉(zhuǎn)移酶參與植物耐逆過(guò)程, 但對(duì)其具體作用機(jī)理尚不清楚, 糖基轉(zhuǎn)移酶參與植物耐逆過(guò)程的分子機(jī)制有待深入探索。

非生物脅迫(干旱、土壤鹽漬化、低溫冷害等)是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、威脅作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素,而傳統(tǒng)育種方法并不能精準(zhǔn)有效地提高植物耐受逆境能力。因此, 通過(guò)植物基因工程技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)育種手段, 使抗逆基因在目標(biāo)作物中特異表達(dá), 以提高作物對(duì)逆境脅迫的抗性, 逐漸成為作物育種中的一個(gè)重要手段。啟動(dòng)子作為啟動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元件, 主要有組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[18]。雖然組成型啟動(dòng)子在啟動(dòng)外源基因表達(dá)中具有高效、廣譜和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但是由于高效、持續(xù)表達(dá)目標(biāo)基因容易造成一些負(fù)面影響(如植株生長(zhǎng)異常等), 而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在特定條件下啟動(dòng)目標(biāo)基因的表達(dá), 很大程度上緩解了由于大量異源蛋白的高表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)造成的傷害[19-20]。

棉花的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程經(jīng)常受到高鹽、干旱等非生物脅迫因素的影響, 導(dǎo)致產(chǎn)量降低。到目前為止, 在棉花中參與調(diào)節(jié)激素平衡及抗逆脅迫方面的糖基轉(zhuǎn)移酶尚未見(jiàn)報(bào)道。我們之前從棉花cDNA文庫(kù)中分離了一個(gè)棉花糖基轉(zhuǎn)移酶 GhGalT1基因[21],為研究其在植物逆境應(yīng)答中的功能, 本研究分離克隆了GhGalT1基因起始密碼子ATG上游539 bp的啟動(dòng)子序列。通過(guò)PlantCARE軟件分析發(fā)現(xiàn)其包含許多與逆境、激素等相關(guān)的順式作用元件, 推測(cè)該啟動(dòng)子受干旱、熱、脫水、激素等脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 為此我們構(gòu)建了含有該啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體pBI121-pGhGalT1-GUS, 并通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥對(duì)其功能進(jìn)行了驗(yàn)證, 以期豐富植物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子種類(lèi), 為植物抗逆遺傳育種改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品種Coker 312克隆GhGalT1基因的啟動(dòng)子,擬南芥(Arabidopsis thaliana, 哥倫比亞型)用于啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與功能驗(yàn)證。

1.2 棉花基因組DNA的提取

選取飽滿的Coker 312棉花種子, 以70%乙醇處理1 min, 10%過(guò)氧化氫(H2O2)處理1.5 h, 無(wú)菌水沖洗 3～4次, 隨后加入適量無(wú)菌水浸泡至種子根尖露白。去掉種皮, 置1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā), 28oC培養(yǎng)5～7 d后, 選取生長(zhǎng)健壯的幼苗移栽至土壤中, 待幼苗長(zhǎng)出2片真葉時(shí), 取2 g左右幼嫩葉片利用CTAB法提取基因組DNA[22]。

1.3 GhGalT1基因啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

以GhGalT1編碼區(qū)序列為探針, Blast搜索中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所網(wǎng)站的陸地棉(Gossypium hirsutum)基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cgp.genomics.org.cn/page/species/blast.jsp), 將該基因上游2 kb左右序列作為目標(biāo)區(qū)域。

利用在線順式作用元件分析工具 PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.htm)和PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動(dòng)子序列, 預(yù)測(cè)順式作用元件。

以 Coker 312的基因組 DNA為模板, 使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真酶, PCR擴(kuò)增 GhGalT1基因的啟動(dòng)子目的片段, 命名為pGhGalT1, 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶大小。擴(kuò)增體系為 5×Prime STAR 緩沖液 (Mg2+plus) 4 μL,dNTPs (各 2.5 mmol L–1) 4 μL, 模板 DNA (500 ng μL–1) 1 μL, 引物 pGhGalT1-F (10 μmol L–1) 1 μL,pGhGalT1-R (10 μmol L–1) 1 μL (表 1), PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (2.5 U μL–1) 0.2 μL, 用 ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?98oC 10 s, 55oC 15 s, 72oC 1 min,30個(gè)循環(huán); 72oC 10 min。將擴(kuò)增得到的序列連接至pBluescript(pSK)載體上測(cè)序驗(yàn)證, 與棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)。

表1 本試驗(yàn)中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 GhGalT1啟動(dòng)子載體構(gòu)建、擬南芥轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株檢測(cè)

用 Sal I和 BamH I分別酶切植物表達(dá)載體pBI101和擴(kuò)增的 GhGalT1基因啟動(dòng)子目的片段pGhGalT1后, 進(jìn)行連接, 獲得重組質(zhì)粒 pBI101-pGhGalT1-GUS (圖1), 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥[23]。經(jīng)卡那霉素抗性篩選后獲得 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥。取 T1代轉(zhuǎn)基因植株幼苗葉片, 利用 SDS法提取基因組DNA, 并以此為模板通過(guò) PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性植株,擴(kuò)增引物為 pGhGalT1-F和 pGhGalT1-R、GUS-F和GUS-R和抗性標(biāo)記基因NPTII-F和NPTII-R (表1), 產(chǎn)物大小分別為539、1812和795 bp。選取PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的單株收獲種子并加代, 再經(jīng)卡那霉素抗性篩選及PCR檢測(cè)得到T3代純合轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系。

圖1 pBI101-pGhGalT1-GUS表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig. 1 Map of construction of the pBI101-pGhGalT1-GUS expression vector

1.5 GUS組織化學(xué)染色

取野生型和 T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子, 經(jīng)10% NaClO溶液表面消毒后, 分別點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上, 4oC春化處理2 d, 于恒溫光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h 黑暗, 22～24oC)培養(yǎng), 分別取生長(zhǎng) 5、10 和 15 d幼苗、莖、花和角果、成熟葉片等組織進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色[24]。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗浸入 GUS染液(含 10 mmol L–1EDTA, 100 mmol L–1NaH2PO4·H2O, 0.5%Triton X-100, 1 mmol L–1K3Fe(CN)6, 1 mmol L–1K4Fe(CN)6·3H2O, 0.1% X-Gluc)中, 于 37oC 染色 6～8 h, 除去染液。再用70%乙醇室溫脫色3～5 h, 其間更換 70%乙醇 2～3次, 直至各組織的色素完全退去。取樣品在Leica MZ16f體視顯微鏡下觀察, 照相。

取適量生長(zhǎng)10 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗分別移至含 150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA)和500 nmol L–1油菜素內(nèi)酯(BL)的MS液體培養(yǎng)基中處理6 h后, 進(jìn)行GUS染色分析, 本試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 GUS酶活測(cè)定

GUS活性的熒光檢測(cè)方法參照J(rèn)efferson[25]。將生長(zhǎng)10 d幼苗分別用MS液體和添加有150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1MeJA 或 500 nmol L–1BL 的 MS 液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)6 h。取0.1 g樣品于預(yù)冷的研缽中, 加0.5 mL預(yù)冷的研磨緩沖液(100 mmol L–1K3PO4, pH 7.8,1 mmol L–1EDTA, 1% Triton X-100), 迅速研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5 mL離心管中, 2130×g, 4oC離心10 min, 上清液即為GUS蛋白粗提取液。以4-MUG為作用底物進(jìn)行酶促反應(yīng)后, 反應(yīng)產(chǎn)物在365 nm的激發(fā)光下測(cè)定455 nm的熒光強(qiáng)度(HITACHI F-2500),考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.7 GUS基因的表達(dá)分析

取適量生長(zhǎng)10 d攜有啟動(dòng)子序列的擬南芥幼苗分別移至含 150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1MeJA 或 500 nmol L–1BL的MS液體培養(yǎng)基中處理6 h后收取幼苗材料。用RNA-Solv Reagent (Omega)提取幼苗總RNA, 經(jīng)DNase (RQ1 RNase-Free DNase, Promega)消化后, 用逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase,Promega)合成cDNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)(MJ Research, Opticon 2), 以 cDNA 為模板, 用GUS基因特異性引物GUS-RTF和GUS-RTR (表1)和 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO)進(jìn)行 PCR反應(yīng)。以擬南芥的 Actin2作為內(nèi)參基因, 目標(biāo)基因每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增都被 SYBR-Green熒光檢測(cè), 具體步驟及分析參照Li等[26]的方法, 重復(fù)3次, 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhGalT1啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

靠近GhGalT1編碼區(qū)開(kāi)放閱讀框5′上游539 bp(圖2)區(qū)域序列具有TATA-box、CAAT-box等真核生物啟動(dòng)子基本調(diào)控元件, 此外還包含多種逆境響應(yīng)功能元件, 如干旱誘導(dǎo)的 MYB結(jié)合元件 MBS、脫水響應(yīng)元件 MYCCONSE、熱應(yīng)答元件 HSE、防御與脅迫應(yīng)答元件 TC-rich repeats、MeJA響應(yīng)元件CGTCA-motif、調(diào)控生物節(jié)律元件以及多種光響應(yīng)相關(guān)元件等(圖3和表2)。

圖2 棉花GhGalT1基因啟動(dòng)子的克隆Fig. 2 Amplified fragment of GhGalT1 gene promoter in cotton

圖3 GhGalT1啟動(dòng)子序列及預(yù)測(cè)的順式作用元件Fig. 3 Sequence and predicted cis-acting elements of GhGalT1 promoter

2.2 GhGalT1啟動(dòng)子載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性植株的鑒定

為了研究GhGalT1啟動(dòng)子的活性及其表達(dá)模式,將該啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物pGhGalT1 (圖2)及植物表達(dá)載體pBI101分別用Sal I和Bam HI雙酶切后連接, 經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切檢測(cè)驗(yàn)證獲得正確的重組質(zhì)粒(圖4-A和 B)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥, 獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的單株收獲種子并加代(圖5, 圖6-A～C), 獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系(圖6-D)。

表2 GhGalT1啟動(dòng)子主要順式作用元件及預(yù)測(cè)的功能Table 2 The cis-acting elements and predicted functions in the GhGalT1 promoter sequence

圖4 GhGalT1啟動(dòng)子載體的構(gòu)建Fig. 4 Vector construction of GhGalT1 promoter

圖5 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的卡那霉素抗性篩選Fig. 5 Kanamycin resistance screening of T1 generation transgenic positive plants

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的PCR檢測(cè)Fig. 6 Positive detection in transgenic Arabidopsis lines by PCR

2.3 GUS組織化學(xué)染色

圖7表明GUS信號(hào)主要在生長(zhǎng)5、10和 15 d轉(zhuǎn)基因植株幼苗的主根及側(cè)根的根尖表達(dá), 在 10 d以后的子葉及蓮座葉邊緣也有GUS表達(dá), 而在莖、花、角果等部位未檢測(cè)到 GUS信號(hào), 表明靠近GhGalT1編碼區(qū)開(kāi)放閱讀框上游的 539 bp的GhGalT1啟動(dòng)子區(qū)域可以驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá), 是啟動(dòng)子的活性區(qū)域。

圖7 GhGalT1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性檢測(cè)Fig. 7 Histochemical assay of GUS activity in pGhGalT1:GUS transgenic Arabidopsis

2.4 不同脅迫條件下的GUS染色及定量分析

Genevestigator網(wǎng)站(https://genevestigator.com/gv/)分析顯示, 與 GhGalT1基因同源的擬南芥AtGalTs基因受鹽、干旱、激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導(dǎo)。將生長(zhǎng) 10 d的幼苗移至分別添加 150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1MeJA 和 500 nmol L–1BL 的 MS液體培養(yǎng)基中處理6 h, 然后進(jìn)行GUS染色分析。圖 8顯示, 與無(wú)脅迫對(duì)照相比, 經(jīng) NaCl、甘露醇和MeJA處理后, 轉(zhuǎn)基因株系根中GUS信號(hào)明顯減弱;用BL處理后, 根中GUS信號(hào)顯著增強(qiáng); 而在6-BA處理的小苗根中GUS信號(hào)完全消失, 子葉和蓮座葉中的GUS信號(hào)卻明顯增強(qiáng)。

圖8 鹽、干旱和激素處理GhGalT1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性檢測(cè)Fig. 8 Histochemical assay of GUS activity of GhGalT1 promoter in transgenic Arabidopsis under stresses

進(jìn)一步定量確定啟動(dòng)子的表達(dá)活性, 對(duì)鹽、干旱、激素(6-BA、MeJA、BL)處理過(guò)的 10 d幼苗進(jìn)行GUS酶活測(cè)定, 同時(shí)提取總RNA后, 對(duì)GUS基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析其表達(dá)量。結(jié)果經(jīng)NaCl、甘露醇和MeJA處理后, GUS活性及GUS基因表達(dá)量顯著降低, 6-BA、BL處理后GUS活性及GUS基因表達(dá)量顯著升高(圖9), 表明GhGalT1基因的啟動(dòng)子受鹽、滲透脅迫和激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導(dǎo)。

圖9 脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS定量分析Fig. 9 Quantification of GUS activity and GUS gene in transgenic Arabidopsis under different stresses

3 討論

真核生物基因表達(dá)受染色體水平上的基因活化調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平的調(diào)控, 外源基因在受體內(nèi)的表達(dá)受到諸多因素的影響, 如插入位置、拷貝數(shù)、啟動(dòng)子類(lèi)型等, 但很大程度上依賴(lài)于外源基因的啟動(dòng)子[27]。目前, 研究啟動(dòng)子的方法主要有生物信息學(xué)分析及試驗(yàn)分析兩種。利用生物信息學(xué)分析啟動(dòng)子序列, 預(yù)測(cè)其中的順式作用元件種類(lèi)、數(shù)目及位置, 可以為進(jìn)一步確定啟動(dòng)子的功能奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)分析主要有瞬時(shí)表達(dá)、5′端片段缺失分析[28]、凝膠阻滯[29]、酵母單雜交[30]等方法。本研究采用生物信息學(xué)分析和啟動(dòng)子融合GUS基因瞬時(shí)表達(dá)相結(jié)合的方法, 研究GhGalT1基因啟動(dòng)子的重要順式作用元件和表達(dá)特性。

通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 在 GhGalT1啟動(dòng)子區(qū)域存在多種重要的非生物脅迫應(yīng)答元件, 例如響應(yīng)干旱、防御與脅迫等逆境的元件。Genevestigator網(wǎng)站(https://genevestigator.com/gv/)分析也顯示與GhGalT1基因同源的擬南芥 AtGalTs基因受鹽、干旱、激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導(dǎo)。GUS組織化學(xué)染色表明鄰近GhGalT1基因開(kāi)放閱讀框5′端上游的539 bp啟動(dòng)子區(qū)段是其活性核心區(qū)域; 同時(shí)生物信息學(xué)分析結(jié)果也顯示該活性區(qū)域中包含了響應(yīng)干旱和滲透脅迫的順式作用元件。我們對(duì)轉(zhuǎn)539 bp片段啟動(dòng)子擬南芥進(jìn)行脅迫處理, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NaCl、甘露醇和 MeJA處理后, 轉(zhuǎn)基因株系中 GUS信號(hào)、GUS酶活性及GUS表達(dá)量明顯降低。在BL處理后, 其活性及表達(dá)量顯著增加, 而在6-BA處理后, GUS信號(hào)由根尖轉(zhuǎn)移至子葉及蓮座葉邊緣部位且GUS活性及表達(dá)量顯著升高。推測(cè) GhGalT1基因的啟動(dòng)子響應(yīng)鹽、干旱和激素脅迫應(yīng)答, 可能是通過(guò)結(jié)合干旱誘導(dǎo)型MYB結(jié)合元件MBS、熱應(yīng)答元件 HSE、防御與脅迫應(yīng)答元件 TC-rich repeats、MeJA響應(yīng)元件CGTCA-motif來(lái)調(diào)節(jié)的。

利用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在特定條件下驅(qū)動(dòng)相應(yīng)基因的高效表達(dá), 增強(qiáng)植物對(duì)不良環(huán)境條件的抵抗性,近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前已有一些關(guān)于植物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究報(bào)道, 如馬鈴薯?yè)p傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Wun1[31]、柑橘冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pPtcor8[32]、馬鈴薯光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Sgt1p[33]、擬南芥冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子CBF3[34]、擬南芥逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A[35]、棉花受多逆境誘導(dǎo)表達(dá)的GhWRKY64基因啟動(dòng)子[36]、小麥干旱和滲透脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子TaPP2AbB″-α[37]等。這些能夠同時(shí)受多種因素誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子被稱(chēng)為多元調(diào)控啟動(dòng)子, 目前能夠廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的多元調(diào)控啟動(dòng)子仍然比較少, 而本研究所克隆的棉花GhGalT1啟動(dòng)子受干旱和高鹽、激素誘導(dǎo)表達(dá), 屬于多逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子, 為了將該啟動(dòng)子更精確地用于棉花遺傳改良, 后續(xù)的工作將對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行缺失片段分析, 確定對(duì)鹽、干旱及不同激素響應(yīng)的順式作用元件及功能區(qū), 有望進(jìn)一步應(yīng)用于植物遺傳育種改良研究。

4 結(jié)論

從陸地棉品種Coker 312基因組DNA中克隆了GhGalT1基因的啟動(dòng)子 pGhGalT1, 長(zhǎng)度為 539 bp,該區(qū)域包含響應(yīng)干旱、熱、脫水、防御與脅迫應(yīng)答的順式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif。NaCl、甘露醇或MeJA處理后, 轉(zhuǎn)基因株系中 GUS活性顯著降低, BL或6-BA處理后, GUS活性顯著升高, 驗(yàn)證了啟動(dòng)子活性區(qū)的功能。本研究結(jié)果為選用啟動(dòng)子改良作物提供了依據(jù)。

[1]Campbell J A, Davies G J, Bulone V V, Henrissat B. A classification of nucleotide-diphospho-sugar glycosyltransferases based on amino acid sequence similarities. Biochem J, 1997, 326:929–939

[2]Lao J, Oikawa A, Bromley J R, McInerney P, Suttangkakul A,Smith-Moritz A M, Plahar H, Chiu T Y, Gonzalez Fernandez-Nino S M, Ebert B, Yang F, Christiansen K M, Hansen S F,Stonebloom S, Adams P D, Ronald P C, Hillson N J, Hadi M Z,Vega-Sanchez M E, Loque D, Scheller H V, Heazlewood J L.The plant glycosyltransferase clone collection for functional genomics. Plant J, 2014, 79: 517–529

[3]Coutinho P M, Deleury E, Davies G J, Henrissat B. An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases. J Mol Biol, 2003, 328: 307–317

[4]Jackson R G, Kowalczyk M, Li Y, Higgins G, Ross J, Saiidberg G, Bowles D J. Overexpression of an Arabidopsis gene encoding a glucosyltransferase of indole-3-acetic acid: phenotypic characterisation of transgenic lines. Plant J, 2002, 32: 573–583

[5]Jackson R Q, Lim E K, Li Y, Kowalczyk M, Saiidberg G, Hoggett J, Ashford D A, Bowles D J. Identification and biochemical characterization of an Arabidopsis indole-3-acetic acid glucosyltransferase. J Biol Chem, 2001, 276: 4350–4356

[6]Tognetti V B, Van Aken O, Morreel K, Vandenbroucke K, van de Cotte B, De Clercq I, Chiwocha S, Fenske R, Prinsen E,Boerjan W, Genty B, Stubbs K A, Inze D, Van-Breusegem F.Perturbation of indole-3-butyric acid homeostasis by the UDP-glucosyltransferase UGT74E2 modulates Arabidopsis architecture and water stress tolerance. Plant Cell, 2010, 22:2660–2679

[7]Martin R C, Mok D W, Sniels R, Van Oiickelen H A, Mok M C.Development of transgenic tobacco harboring a zeatin O-glucosyltransferase gene from Phaseolus. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 2001, 37: 354–360

[8]Wang J, Ma X M, Kojima M, Sakakibara H, Hou B K.N-glucosyltransferase UGT76C2 is involved in cytokinin homeostasis and cytokinin response in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, 2011, 52: 2200–2213

[9]Wang J, Ma X M, Kojima M, Sakakibara H, Hon B K. Glucosyltransferase UGT76C1 finely modulates cytokinin responses via cytokinin N-glucosylation in Arabidopsis thahana. Plant Physiol Biochem, 2013, 65: 9–16

[10]Poppenberger B, Fujioka S, Soeno K, George G L, Vaistij F E,Hiranuma S, Seto H, Takatsuto S, Adam G, Yoshida S, Bowles D J. The UGT73C5 of Arabidopsis thaliana glucosylates brassinosteroids. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102: 15253–15258

[11]Suzuki H, Fujioka S, Takatsuto S, Yokota T, Murofushi N, Sakurai A. Biosynthesis of brassinolide from teasterone via typhasterol and castaserone in cultured cells of Catharanthus roseus. J Plant Growth Regul, 1993, 13: 21–26

[12]Husar S, Berthiller F, Fujioka S, Rozhon W, Khan M, Kalaivanan F, Elias L, Higgins G S, Li Y, Schuhmacher R, Krska R, Seto H,Vaistij F E, Bowles D, Poppenberger B. Overexpression of the UGT73C6 alters brassinosteroid glucoside formation in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol, 2011, 11: 51

[13]Glauser G, Boccard J, Rudaz S, Wolfender J L. Mass spectrometry-based metabolomics oriented by correlation analysis for wound-induced molecule discovery: identification of a novel jasmonate glucoside. Phytochem Anal, 2010, 21: 95–101

[14]Lim C E, Ahn J H, Lim J. Molecular genetic analysis of tandemly located glycosyltransferase genes, UGT73BI, UGT73B2, and UG17383, in Arabidopsis thaliana. J Plant Biol, 2006, 49:309–314

[15]Lim C E, Choi N J, Kim A, Lee S A, Huang Y S, Lee C H, Lim J.Improved resistance to oxidative stress by a loss-of-function mutation in the Arabidopsis UGT71C1 gene. Mol Cells, 2008, 25:368–375

[16]Kim A, Heo J O, Chang K S, Lee S A, Lee M H, Lim C E, Lim J.Overexpression and inactivation of UGT73B2 modulate tolerance to oxidative stress in Arabidopsis. J Plant Biol, 2010, 53:233–239

[17]Song J T, Koo Y J, Seo H S, Kim M C, Choi Y D, Kim J H.Overexpression of AtSGTl, an Arabidopsis salicylic acid glucosyltransferase, leads to increased susceptibility to Pseudomonas syringae. Phytochemistry, 2008, 69: 1128–1134

[18]李田, 孫景寬, 劉京濤. 植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào),2015, 31(2): 18–25 Li T, Sun J K, Liu J T. Research advances on plant promoter.Biotechnol Bull, 2015, 31(2): 18–25 (in Chinese with English abstract)

[19]Li F, Han Y Y, Feng Y N, Xing S C, Zhao M R, Chen Y H,Wang W. Expression of wheat expansin driven by the RD29 promoter in tobacco confers water-stress tolerance without impacting growth and development. J Biotechnol, 2013, 163:281–291

[20]Pino M T, Skinner J S, Park E J, Jeknic Z, Hayes P M,Thomashow M F, Chen T H. Use of a stress inducible promoter to drive ectopic AtCBF expression improves potato freezing tolerance while minimizing negative effects on tuber yield. Plant Biotechnol J, 2007, 5: 591–604

[21]Qin L X, Rao Y, Li L, Huang J F, Xu W L, Li X B. Cotton GalT1 encoding a putative glycosyltransferase is involved in regulation of cell wall pectin biosynthesis during plant development. PLoS One, 2013, 8: e59115

[22]Li X B, Lin C, Cheng N H, Liu J W. Molecular characterization of the cotton GhTUB1 gene that is preferentially expressed in fibers. Plant Physiol, 2002, 130: 666–674

[23]Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J, 1998, 16: 735–743

[24]Qin L X, Li Y, Li D D, Xu W L, Zheng Y, Li X B. Arabidopsis drought-induced protein Di19-3 participates in plant response to drought and high salinity stresses. Plant Mol Biol, 2014, 86:609–625

[25]Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: the Gus gene fusion system. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5: 387–405

[26]Li X B, Fan X P, Wang X L, Cai L, Yang W C. The cotton Actin1 gene is functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation. Plant Cell, 2005, 17: 859–875

[27]Wang X, Tan Y P, Zhou J, Wang C T, Liu X Q. Expression of a tobacco glycosyltransferase gene driving promoter in transgenic tobacco. Agric Sci Technol, 2010, 11: 83–85

[28]Luo K, Zhang G, Deng W, Luo F, Qiu K, Pei Y. Functional characterization of a cotton late embryogenesis-abundant D113 gene promoter in transgenic tobacco. Plant Cell Rep, 2008, 27:707–717

[29]Singh H, Sen R, Baltimore D, Sharp P A. A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes. Nature, 1986, 319: 154–158

[30]Li J J, Herskowitz I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science,1993, 262: 1870–1874

[31]賈笑英, 向云, 張金文, 王蒂. 馬鈴薯?yè)p傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Wun1基因的克隆及其GFP表達(dá)活性. 分子植物育種, 2006, 4:333–338 Jia X Y, Xiang Y, Zhang J W, Wang D. Cloning of potato wound-inducible promoter Wun1 and its GFP express activity.Mol Plant Breed, 2006, 4: 333–338 (in Chinese with English abstract)

[32]周瀟, 姜航, 屈漢金, 鄧子牛, Gentile A, 龍桂友. 柑橘冷誘導(dǎo)基因及其啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá)分析. 果樹(shù)學(xué)報(bào),2015, 32: 353–358 Zhou X, Jiang H, Qu H J, Deng Z N, Gentile A, Long G Y. Construction of plant vectors with promoter and cold-induced genes in citrus and transient expression verification. J Fruit Sci, 2015,32: 353–358 (in Chinese with English abstract)

[33]魏桂民, 張金文, 王蒂, 張俊蓮, 陸艷梅, 高宜峰. 馬鈴薯Sgt1基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及功能分析. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2013, 29: 969–977 Wei G M, Zhang J W, Wang D, Zhang J L, Lu Y M, Gao Y F.Promoter analysis of potato Sgt1 gene. J Biochem Mol Biol, 2013,29: 969–977 (in Chinese with English abstract)

[34]郭新勇, 程晨, 張選, 祝建波. 擬南芥冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 CBF3驅(qū)動(dòng) IPT基因在煙草中的表達(dá). 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21:123–131 Guo X Y, Cheng C, Zhang X, Zhu J B. Expression of IPT gene linked with cold-induced promoter CBF3 from Arabidopsis thaliana in tobacco. Acta Agric Boreali-Occident Sin, 2012, 21:123–131 (in Chinese with English abstract)

[35]楊春霞, 陳英, 黃敏仁, 李火根. 擬南芥逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A的克隆及活性檢測(cè). 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008, 32: 6–10 Yang C X, Chen Y, Huang M R, Li H G. Cloning of stress-inducible promoter rd29A from Arabidopsis thaliana and its activity detection in transgenic tobacco. J Nanjing For Univ(Nat Sci Edn), 2008, 32: 6–10 (in Chinese with English abstract)

[36]杜皓, 丁林云, 何曼林, 蔡彩平, 郭旺珍. 受多逆境誘導(dǎo)表達(dá)的 GhWRKY64基因啟動(dòng)子克隆與功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2015,41: 593–600 Du H, Ding L Y, He M L, Cai C P, Guo W Z. Cloning and functional identification of promoter region of GhWRKY64 induced by multi-stresses in cotton (Gossypium hirsutum). Acta Agron Sin,2015, 41: 593–600 (in Chinese with English abstract)

[37]扆珩, 李昂, 劉惠民, 景蕊蓮. 小麥蛋白磷酸酶 2A 基因TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42:1282–1290 Yi H, Li A, Liu H M, Jing R L. Cloning and expression analysis of protein phosphatase 2A gene TaPP2AbB″-α promoter in wheat.Acta Agron Sin, 2016, 42: 1282–1290 (in Chinese with English abstract)