甘藍(lán)型油菜BnGS3和BnGhd7的同源克隆及其與油菜產(chǎn)量相關(guān)性狀的關(guān)系

薛志飛 王 夏 李付鵬 馬朝芝

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 / 作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢 430070

油菜是世界上最主要的油料作物之一, 提高產(chǎn)量始終是油菜育種的一個(gè)重要目標(biāo)。研究產(chǎn)量相關(guān)性狀、發(fā)展分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇將是提高產(chǎn)量的有效途徑。現(xiàn)已完成甘藍(lán)型冬油菜品種 Tapidor全基因組測(cè)序, 預(yù)測(cè)有101 040個(gè)基因, 在測(cè)序植物中基因數(shù)目最多[1]。甘藍(lán)型油菜(Brassica napus, AACC=38)是由白菜(Brassica rapa,AA=20)和甘藍(lán)(Brassica oleracea, CC=18)自然雜交、加倍而成的異源四倍體[2], A/C基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生了大量的重組和突變, 增加了基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性, 導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜功能基因組研究難度加大。油菜與水稻(Oryza sativa)基因組雖然差異大, 但仍然具有共線性[3]。作為高等模式生物, 水稻的大量功能基因已被克隆, 利用水稻基因序列克隆油菜同源基因, 很可能是研究油菜基因功能的有效手段。

無論水稻還是油菜, 生育期、千粒重和籽粒大小都是重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀, 控制這些性狀的很多基因或 QTL已在水稻中被克隆。其中, GS3是控制粒長(zhǎng)與千粒重的主效QTL, 同時(shí)也是粒寬和粒厚相關(guān)的微效QTL[4]; Ghd7同時(shí)影響株高、穗粒數(shù)和抽穗期等多個(gè)性狀, 是一個(gè)控制水稻產(chǎn)量的多效基因[5]。GS3全長(zhǎng)5363 bp, 其編碼蛋白包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域, 分別是磷脂酞乙醇胺結(jié)合蛋白區(qū)域(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP-like)、跨膜區(qū)域、生長(zhǎng)因子受體家族富半胱氨酸同源區(qū)域(tumour necrosis factor receptor, TNFR或nerve growth factor receptor, NGFR)和 von Willebrand因子 C型結(jié)構(gòu)域(von Willebrand factor type C, VWFC)[6]。Ghd7編碼 257個(gè)氨基酸殘基, 其蛋白 C端具有一個(gè)明顯的 CCT (constans,constans-like, TOCl)結(jié)構(gòu)域, 對(duì)控制植物花期的重要基因CO發(fā)揮核心功能, Ghd7缺少位于CO基因N端的另一個(gè)重要的B-BOX結(jié)構(gòu)域[7]。甘藍(lán)型油菜是否有GS3和Ghd7的同源基因, 其同源基因是否與生育期和千粒重等產(chǎn)量性狀有關(guān), 目前還未見相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究根據(jù)水稻GS3和Ghd7基因序列, 通過比較基因組學(xué)方法, 克隆甘藍(lán)型油菜的同源基因, 并對(duì)候選基因進(jìn)行比較測(cè)序, 分析其與產(chǎn)量性狀的相關(guān)性, 目的在于探究利用模式植物水稻功能基因信息研究油菜相關(guān)基因的可行性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選用58份甘藍(lán)型油菜自交系和由Tapidor × Ningyou 7創(chuàng)建而來具有202個(gè)DH系(double haploid)的TN群體[8]。58份材料中, 自交不親和系 SI-1300用于同源基因克隆,57份自交親和系用于表型性狀的相關(guān)分析, TN群體用于連鎖圖譜分析和基因定位。

1.2 表型調(diào)查與分析

2009年10月上旬, 將57份自交親和系分別在湖北武漢和黃岡兩地種植, 均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 3行區(qū), 行距0.27 m, 行長(zhǎng)3.50 m, 小區(qū)面積2.84 m2, 定苗后每行20株、每小區(qū)60株。記錄初花期(小區(qū)內(nèi)50%植株開第1朵花)和終花期日期, 分別計(jì)算播種–初花期、初花期–終花期的天數(shù)。成熟后隨機(jī)連續(xù)取 10株, 考察株高、一次有效分枝數(shù)、單株角果總數(shù)、角果粒數(shù)、單株產(chǎn)量、千粒重和小區(qū)產(chǎn)量。

利用 SAS 9.4軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)以及表型與基因型的簡(jiǎn)單相關(guān)分析(simple correlation analysis)。

1.3 引物設(shè)計(jì)及同源基因克隆

使用天根公司植物基因組 DNA提取試劑盒(OSRM301)提取油菜苗期幼嫩葉片總DNA。

使用軟件Oligo v. 7設(shè)計(jì)同源克隆引物。根據(jù)水稻GS3的 DNA序列(GenBank登錄號(hào)為 AB743898.1)設(shè)計(jì)引物bngs-1-1、bngs-1-2和bngs-1-3 (見附表1), 但是該3對(duì)引物在甘藍(lán)型油菜中沒有特異擴(kuò)增, 因此利用 GS3蛋白序列重新進(jìn)行同源搜索, 獲得同源的擬南芥NP_680175.2蛋白序列, 利用其對(duì)應(yīng)的基因序列信息在NCBI中再次進(jìn)行同源比對(duì), 獲得白菜型油菜的同源序列 AC189411.2。根據(jù)擬南芥NP_680175.2基因序列設(shè)計(jì)引物gs3-1和gs3-4,根據(jù)白菜型油菜AC189411.2的基因序列設(shè)計(jì)了3對(duì)引物,分別是gs3-2、gs3-3和gs3-5 (見附表1)。

水稻 Ghd7具有保守的 CCT結(jié)構(gòu)域, CCT結(jié)構(gòu)域是CO基因家族編碼蛋白的核心功能域。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)Ghd7與甘藍(lán)型油菜AY280868.2序列和擬南芥CO基因具有相似的同源性。根據(jù)水稻 Ghd7 (GenBank登錄號(hào)為JF926542.1)、甘藍(lán)型油菜AY280868.2的序列信息設(shè)計(jì)12對(duì)引物(見附表1)。

PCR體系使用1×擴(kuò)增緩沖液配制, 加入2 mmol L–1的 MgCl2、0.1 mmol L–1的 dNTP、左右引物各 0.2 μmol L–1、0.5 U Taq酶、50 ng模板DNA, ddH2O定容至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C運(yùn)行2 min, 94°C運(yùn)行1 min, 55°C運(yùn)行30 s, 72°C 運(yùn)行 45 s, 35 個(gè)循環(huán); 72°C 運(yùn)行 5 min; 于 4°C保存產(chǎn)物。

1.4 候選基因及其編碼產(chǎn)物的序列分析

用SSCP (single-strand conformation polymorphism)技術(shù)可以有效檢測(cè)InDel和SNP所造成的序列差異, 但PCR產(chǎn)物需要經(jīng)高溫變性后才能檢測(cè)到單鏈折疊的構(gòu)象差異,已經(jīng)被用來開發(fā)甘藍(lán)型油菜分子標(biāo)記[9]?？紤]到SSCP對(duì)檢測(cè)片段大小有嚴(yán)格要求, 在 8%聚丙烯酰胺凝膠的基礎(chǔ)上, 又配制了3.5%和6%非變性聚丙烯酰胺凝膠, 分別檢測(cè)＞800 bp和400～500 bp的片段。使用天根公司純化回收試劑盒(DP214)回收 PCR產(chǎn)物, 使用 pMD18-T Vector(TaKaRa)進(jìn)行T-A克隆, 挑選轉(zhuǎn)化的大腸桿菌感受態(tài)(K12菌株制備)陽性單克隆送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司測(cè)序,使用軟件SeqMan Pro (http://www.dnastar.com/)分析測(cè)序結(jié)果。

通過數(shù)據(jù)庫 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分別對(duì)GS3、Ghd7的序列進(jìn)行同源比對(duì)。用ClustalW完成多序列對(duì)位排列分析[10]; 利用在線軟件 Softberry (http://www.softberry.com/)[11]和Genscan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu), 用在線軟件 InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)[12-13]和 Conserved Domain Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)預(yù)測(cè)同源蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.5 基因型分析

參照 MapMaker/Exp 3.0[14-15]的方法記載分子標(biāo)記的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS3在甘藍(lán)型油菜中的同源克隆

2.1.1 GS3在甘藍(lán)型油菜中的同源克隆 根據(jù)水稻GS3基因序列設(shè)計(jì)的引物bngs-1-1、bngs-1-2和bngs-1-3,在甘藍(lán)型油菜 SI-1300中為非特異擴(kuò)增(圖 1-A), 說明直接利用水稻序列設(shè)計(jì)引物不能在油菜上得到有效擴(kuò)增。而根據(jù)白菜型油菜AC189411.2序列設(shè)計(jì)的3對(duì)引物則可檢測(cè)到特異擴(kuò)增產(chǎn)物(圖 1-B)。擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果與白菜型油菜AC189411.2序列一致, 拼接產(chǎn)生3040 bp的DNA片段。預(yù)測(cè)基因BnGS3位于拼接片段的1271～2965 bp處,有 6個(gè)外顯子, 開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng) 666 bp, 編碼 222個(gè)氨基酸(圖2)。

圖1 根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Amplification results of primers designed according to homologous sequences

圖2 BnGS3基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Prediction of BnGS3 gene construction by FGENSH 2.0

根據(jù) BnGS3序列信息進(jìn)行同源搜索, 發(fā)現(xiàn)與甘藍(lán)型油菜EST序列DY004631同源性較高, 而BnGS3蛋白與GS3蛋白的序列同源性較低。借助預(yù)測(cè)蛋白的保守序列進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn) BnGS3蛋白缺少跨膜區(qū)域、TNFR/NGFR和 PEBP-like的功能結(jié)構(gòu)域, 只具有屬于VWF結(jié)構(gòu)域中的VWFA型的Iso_dh super family結(jié)構(gòu), 而GS3為VWFC型。甘藍(lán)型油菜BnGS3與水稻GS3有一定的同源性, 但序列差異大。

2.1.2 Ghd7在甘藍(lán)型油菜中的同源克隆 以甘藍(lán)型油菜AY280868.2為模板設(shè)計(jì)的引物ghd7-2、ghd7-5、ghd7-6、ghd7-7和ghd7-9 (見附表1), 在甘藍(lán)型油菜SI-1300中均有一條清晰擴(kuò)增帶(圖3)。

圖3 引物ghd7-2、ghd7-5、ghd7-6、ghd7-7和ghd7-9在甘藍(lán)型油菜SI-1300中的擴(kuò)增Fig. 3 Amplification of primers ghd7-2, ghd7-5, ghd7-6,ghd7-7, and ghd7-9 in B. napus SI-1300

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 2725 bp, 測(cè)序結(jié)果與甘藍(lán)型油菜AY280868.2一致。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在714～2700 bp處存在一個(gè)候選基因 BnGhd7, 含有 1個(gè)外顯子,ORF全長(zhǎng)1014 bp, 編碼337個(gè)氨基酸(圖4)。

圖4 BnGhd7基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4 Prediction of BnGhd7 gene construction by FGENSH 2.0

根據(jù)BnGhd7的ORF序列進(jìn)行同源搜索, 發(fā)現(xiàn)了多個(gè)高度同源的甘藍(lán)型油菜EST序列。使用InterProScan軟件對(duì)預(yù)測(cè)蛋白 BnGhd7進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域,其中N端存在1個(gè)B-Box結(jié)構(gòu)域, C端存在1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域, 與水稻Ghd7有高度同源性, 屬于典型的CO基因家族。

2.2 甘藍(lán)型油菜BnGS3和BnGhd7基因的變異位點(diǎn)檢測(cè)

2.2.1 BnGS3基因的變異位點(diǎn)檢測(cè) 在 TN群體中隨機(jī)選取15份材料, 通過引物gs3-2、gs3-3和gs3-5發(fā)現(xiàn)疑似變異位點(diǎn), 但甘藍(lán)型油菜作為異源四倍體存在基因多拷貝現(xiàn)象, 直接測(cè)序不能有效發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)了18對(duì)引物(編號(hào)brgs-1至brgs-18), 擴(kuò)增范圍介于400～1500 bp, 與引物gs3-2、gs3-3和gs3-5共同覆蓋BnGS3的全長(zhǎng)并形成有效重疊(見附表2)。通過SSCP技術(shù)在 57份材料中發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn), 篩選突變頻率大于5的位點(diǎn), 繪制BnGS3的比較測(cè)序結(jié)果(圖5)。

圖5 BnGS3比較測(cè)序結(jié)果示意圖Fig. 5 Schematic diagram of BnGS3 comparative sequencing

引物brgs-16擴(kuò)增片段長(zhǎng)851 bp, 具有突變頻率最高的多態(tài)性位點(diǎn), 位于BnGS3第4個(gè)外顯子區(qū)域的1010 bp到1050 bp處, 屬于缺失突變位點(diǎn)(圖6)。brgs-16擴(kuò)增片段完全包含在引物gs3-5的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi), 且測(cè)序結(jié)果一致,證明結(jié)果可靠。

圖6 引物brgs-16擴(kuò)增片段序列比較Fig. 6 Sequence alignment of amplified fragments in accessions by primer brgs-16

2.2.2 BnGhd7基因的變異位點(diǎn)檢測(cè) 設(shè)計(jì)可以有效覆蓋目標(biāo)區(qū)段的 10對(duì)引物 ghd7-2、ghd7-5～ghd7-7、ghd7-9、brghd-1～brghd-3、brghd-7和 brghd-8 (見附表 2), 在 15份材料進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段測(cè)序, 僅有 2個(gè)有效突變位點(diǎn),引物ghd7-7擴(kuò)增片段在BnGhd7編碼區(qū)下游有1個(gè)300 bp的缺失突變位點(diǎn), 引物 brghd-3擴(kuò)增片段在 BnGhd7起始位點(diǎn)上游700 bp處有1個(gè)突變位點(diǎn)(圖7)。

圖7 BnGhd7比較測(cè)序結(jié)果示意圖Fig. 7 Schematic diagram of BnGhd7 comparative sequencing

引物ghd7-7擴(kuò)增片段長(zhǎng) 1578 bp, 該缺失位點(diǎn)介于 BnGhd7下游非編碼區(qū)的 1488～1783 bp處。引物brghd-3位于 BnGhd7起始位點(diǎn)上游 700 bp處, 引物ghd7-2與brghd-3的重疊范圍序列一致, 證明結(jié)果可靠(圖 8)。

圖8 不同材料中brghd-3測(cè)序結(jié)果的比較Fig. 8 Alignment of the sequencing results of brghd-3

表1 57份甘藍(lán)型油菜自交系9個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的變異Table 1 Variations of nine yield-related traits in 57 B. napus inbred lines

2.3 變異位點(diǎn)與產(chǎn)量相關(guān)性狀的相關(guān)性分析

在武漢和黃岡兩地, 分別對(duì) 57份甘藍(lán)型油菜自交系進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀的表型鑒定, 除武漢點(diǎn)播種至初花期天數(shù)外, 各性狀的變異系數(shù)都超過5% (表1)。材料之間差異明顯, 能夠用來進(jìn)行相關(guān)性分析。

分別將 3個(gè)標(biāo)記brgs-16、ghd7-7和brghd-3與黃岡測(cè)得的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。BnGS3的標(biāo)記brgs-16與表型數(shù)據(jù)不存在相關(guān)性。BnGhd7的標(biāo)記brghd-3與千粒重顯著相關(guān), ghd7-7與花期顯著負(fù)相關(guān), 與株高極顯著相關(guān)(表 2)。

表2 標(biāo)記與產(chǎn)量等相關(guān)性狀之間的相關(guān)分析結(jié)果(黃岡)Table 2 Correlation coefficients between markers and traits (site: Huanggang)

以 TN群體作為定位群體, 引物 brgs-15和引物ghd7-7在兩親本間具有多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。brgs-15是1個(gè)SSCP標(biāo)記, 定位于A2連鎖群(見附圖1); ghd7-7是1個(gè)顯性標(biāo)記, 定位于A10連鎖群(見附圖2)。因而BnGS3和BnGhd7被分別定位于油菜A2和A10連鎖群。

3 討論

作為第1個(gè)基因組被完整測(cè)序的植物, 擬南芥成為遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的典型研究對(duì)象[16]。對(duì)模式生物擬南芥的深入解析曾加速了水稻等一些更高等植物的研究[17]。近年來水稻作為高等模式生物成為新的研究熱點(diǎn)并在基因組和功能基因的研究中取得了巨大成果[18]。禾本科作物水稻和十字花科蕓薹屬甘藍(lán)型油菜在進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 在基因組結(jié)構(gòu)和組成上存在很大差異, 缺乏利用水稻基因信息在甘藍(lán)型油菜中克隆同源基因的報(bào)道, 但比較基因組學(xué)研究結(jié)果表明, 兩種作物基因組仍然具有共線性。本研究利用水稻GS3和Ghd7的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增油菜基因組 DNA, 沒有擴(kuò)增產(chǎn)物或無特異擴(kuò)增。因而,嘗試將擬南芥作為同源克隆的媒介, 首先通過 GS3的序列信息分別在擬南芥和白菜中發(fā)現(xiàn)了同源序列 NP_680175.2和AC189411.2, 分別設(shè)計(jì)引物, 但是, 只有依據(jù)白菜AC189411.2設(shè)計(jì)引物gs3-2、gs3-3和gs3-5在甘藍(lán)型油菜 SI-1300中能有效擴(kuò)增。同樣地, 根據(jù)與 Ghd7同源的甘藍(lán)型油菜AY280868.2序列設(shè)計(jì)引物, 在SI-1300有特異擴(kuò)增帶。說明利用遠(yuǎn)緣物種如水稻的功能基因進(jìn)行油菜基因功能研究時(shí), 借助擬南芥為媒介, 搜索油菜或其兩個(gè)祖先種甘藍(lán)和白菜序列的同源片段, 設(shè)計(jì)引物進(jìn)行同源克隆, 是一種有效的途徑。

本研究克隆到油菜基因BnGS3和BnGhd7, 比較基因變異位點(diǎn)得到BnGS3的多態(tài)性標(biāo)記brgs-16、Bghd7的多態(tài)性標(biāo)記brghd-3和brgs-16。BnGS3有6個(gè)外顯子, ORF全長(zhǎng)666 bp, 編碼222個(gè)氨基酸。水稻GS3全長(zhǎng)5363 bp,包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子, 閱讀框長(zhǎng)699 bp。GS3編碼的蛋白由 232個(gè)氨基酸組成, 包含 4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,分別為磷脂酞乙醇胺結(jié)合蛋白區(qū)域(PEBP-like)、跨膜區(qū)域、生長(zhǎng)因子受體家族富半胱氨酸同源區(qū)域(TNFR)/(NGFR)和von Willebrand因子C型結(jié)構(gòu)域(VWFC)[19-20]。BnGS3雖然只具有水稻 GS3四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域中的 von Willebrand factor(VWF)結(jié)構(gòu), 且屬于 A型(水稻為 C型),但該結(jié)構(gòu)域已被發(fā)現(xiàn)存在于許多胞外蛋白中, 參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)[21-22]。BnGS3的標(biāo)記brgs-16與產(chǎn)量性狀不存在相關(guān)性。因而甘藍(lán)型油菜BnGS3與水稻GS3有一定的同源性, 但基因功能上的相似性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

BnGhd7含有1個(gè)外顯子, ORF全長(zhǎng)1014 bp, 編碼337個(gè)氨基酸。BnGhd7蛋白具有N端的B-Box和C端的CCT兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域, 據(jù)此認(rèn)為屬于CO基因家族, 與水稻Ghd7有高度同源性, 植物中 CO基因家族在調(diào)控開花期上發(fā)揮重要功能[23-24]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)BnGhd7不僅與花期相關(guān), 也與株高和千粒重相關(guān), BnGhd7很可能與水稻Ghd7具有相似的功能。

BnGS3和BnGhd7被分別定位在油菜A2連鎖群、A10連鎖群。A2連鎖群存在大量產(chǎn)量及相關(guān)性狀的 QTL, 包括花期、株高、全株角果數(shù)、角果粒數(shù)、千粒重、種子產(chǎn)量等[25]。由于 brgs-15標(biāo)記位于連鎖群末端, 與 A2連鎖群包含的產(chǎn)量性狀相關(guān)性低, 因而BnGS3的標(biāo)記brgs-16與產(chǎn)量性狀不存在相關(guān)性。ghd7-7被定位到A10連鎖群,該區(qū)域同樣存在大量產(chǎn)量及相關(guān)性狀QTL, 包括產(chǎn)量、花期、成熟期、株高、全株角果數(shù)、千粒重和種子產(chǎn)量等性狀[26-27]。A10連鎖群上與花期相關(guān)的QTL區(qū)間與擬南芥第5染色體頂端的區(qū)間具有共線性, 在該區(qū)域具有擬南芥開花基因CO、FY和FLC等, 而ghd7-7也被定位于該區(qū)間內(nèi)。

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