5株H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及HA基因的序列分析

侯娟娟，王 艷，高亞東，李春秀，李山峰，孫景昱，張 越，尹建華

(青島匯豐動物保健品有限公司，山東青島 266109)

禽流感(avian influenza，AI)俗稱“雞瘟”，從1878年意大利暴發(fā)高致病性禽流感以來[1]，人類對禽流感的認識不斷增加，1955年，sch?fer[2]證實“雞瘟”是由A型流感引起的。低致病性禽流感H9N2亞型毒株自1966年被分離發(fā)現至今已有50余年，1994年在我國廣東首次分離到，臨床表現為產蛋下降，并造成一定的死亡，實驗室復制出典型的臨床癥狀，但不致雞死亡[3]。近年來，禽流感在我國部分地區(qū)時有發(fā)生，對我國養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損失,根據流感病毒囊膜表面有許多糖蛋白凸起，一類為由血凝素(HA)分子的三聚體構成；另一類為由神經氨酸酶(NA)分子的四聚體構成。根據HA和NA的不同，可以分為HA(H1～H16)16種，NA(N1～N10)10種。HA是禽流感病毒表面的糖蛋白,是重要的保護性抗原，其裂解位點的序列可影響AIV致病性的強弱[4]。禽流感病毒會隨著流行和發(fā)病時間的延長，同一病毒可能會從低致病性向高致病性改變，也可能出現因宿主同時感染多種亞型病毒而發(fā)生不同亞型禽流感病毒間的遺傳重組，形成新的禽流感亞型病毒[5]。筆者將山東部分地區(qū)分離的5份疑似H9亞型禽流感的病死雞解剖采集病料，并進行病原分離和鑒定，通過RT-PCR進行HA基因擴增、測序，結合查閱文獻資料[6-7]，從美國國家生物信息中心(NCBI)下載參考株等序列進行基因序列分析，進一步了解所分離的毒株變異情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣品與毒株。青島匯豐動物保健品有限公司于2020—2021年在山東部分地區(qū)養(yǎng)殖場采集疑似H9亞型禽流感發(fā)病雞群病料5份，分別為HFA9-1WF、HFA9-2CY、HFA9-3XT、HFA9-4LW、HFA9-5LC。

1.1.2試劑及引物。 H9亞型禽流感病毒特異性血清、禽流感(H5、H7亞型)陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品檢查所；病毒核酸提取試劑盒購自北京索萊寶公司；RandomPrimer[nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9]、Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、M-MLV、5×Buffer、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye) 購自Takara公司；引物由青島匯豐動物保健品有限公司提供。

1.1.3SPF蛋、SPF雞。購自濟南賽斯家禽科技有限公司。

1.2 儀器超凈工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；臺式高速離心機，購自德國 Sigma公司；渦旋器，購自其林貝爾儀器制造有限公司；梯度 PCR 儀，購自美國 ABI公司；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，購自法國 Vilber Lourmat公司；瓊脂糖水平電泳槽，購自北京六一儀器廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自天津市萊玻特瑞設備有限公司；金屬浴，購自杭州博日科技股份有限公司；各種量程移液槍，購自 Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1病料采集與處理。從發(fā)病雞群中挑出有典型臨床癥狀的雞,解剖采集病雞氣管、肝臟、肺臟等病變嚴重的部位，用滅菌生理鹽水沖洗，再剪碎，以1∶5(W/V)加入滅菌生理鹽水,用研磨器研磨勻漿后，反復凍融3次,6 000 r/min離心10 min,取上清過濾除菌后加雙抗,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病毒分離-雞胚接種。將“1.3.1”中制備的組織液分別經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每份組織液接種5枚雞胚，接后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵化，將24 h內死亡的雞胚棄去，收獲24～96 h死亡的雞胚，測定其HA效價，并通過PCR方法進行鑒定。

1.4 血凝試驗

1.4.1紅細胞懸液制備。選2～4只2～6月齡公雞，將血液采集到含有抗凝劑的溶液中混合均勻，以1 500 r/min離心5 min，吸棄上清，再加入原體積生理鹽水懸浮紅細胞并離心洗滌，共離心洗滌3～4次，直至上清液無色清亮。最后一次離心以2 000 r/min離心5 min。吸棄上清液，將沉淀的紅細胞搖勻后吸取1 mL加入99 mL生理鹽水搖勻配制成1%紅細胞懸液。

1.4.2紅細胞凝集價(HA)。將“1.3.1”中收取的尿囊液分別進行血凝試驗，在96孔微量板上每孔加入25 μL生理鹽水，再用加樣器吸取25 μL待檢樣品加入第1孔中，吹打混勻后吸取25 μL加入第2孔中依次作倍比稀釋直至所需倍數孔，并吸棄25 μL，最后孔留作陰性對照。稀釋完成后，每孔加入25 μL 1%紅細胞懸液，并振蕩混勻，于37 ℃ 15 min觀察結果。

1.5 血凝抑制試驗將分離株分別與抗H9亞型禽流感病毒特異性血清、禽流感(H5、H7亞型)陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清反應。

1.5.1四單位配制。4個100%血凝單位(即4HAU)血凝素的配制根據現行《中國獸藥典》附錄方法。

1.5.2血凝抑制試驗(HI)。用生理鹽水將被檢血清2倍比稀釋，吹吸7±2次混勻，加入含4HAU的血凝素液，并設立生理鹽水(即紅細胞)和血凝素對照，充分振蕩后在37 ℃作用15 min；再加入1%紅細胞懸液，靜置室溫40 min或37 ℃ 15 min，判定結果,以100%紅細胞凝集抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(即血清凝集抑制價)。

1.6 樣品病毒RNA提取用索萊寶總RNA提取試劑盒(Total RNA Extraction Kit)提取樣品RNA。

1.7 病毒RNA反轉錄(RT)和PCR擴增

1.7.1反轉錄體系?？傮w積 20 μL:2.0 μL dNTP Mixture、4.0 μL 5×Buffer、0.5 μL M-MLV、1.0 μL RandomPrimer(nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9)、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor、12.0 μL RNA。反轉錄程序:30 ℃ 10 min 、42 ℃ 1 h。

1.7.2PCR擴增體系?？傮w積 25 μL:9.5 μL ddH2O、12.5 μL PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物、2.0 μL DNA。PCR程序:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.8 電泳鑒定配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠，在電泳槽中加入TAE溶液，分別在凝膠孔中加入PCR擴增樣品、DNA Marker 2 000 bp、對照，電泳30 min后，通過紫外凝膠成像儀觀察結果。

1.9 基因序列測定與Blast分析將擴增并經電泳鑒定后的PCR產物送往擎科生物科技有限公司測序，將測序結果拼接后在美國國家生物技術信息中心(NCBI)在線Blast系統(tǒng)比對序列。

1.10 序列分析在美國國家生物信息中心(NCBI)網站下載H9亞型毒株參考株和疫苗株的HA基因序列，同分離株樣品測序結果用MegAlign進行HA基因序列分析，繪制進化樹，并進行核苷酸同源性比較。

2 結果與分析

2.1 病料在雞胚上的分離結果將采集于各地的5份病料組織液經尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，連續(xù)觀察72 h，結果發(fā)現5份樣品在60～72 h出現不同數量的死亡，分別收取各組雞胚尿囊液進行鑒定，結果見表1 。

表1 5份病料在雞胚上的分離結果

2.2 血凝抑制試驗結果5份尿囊液樣品HA效價均在1∶128～1∶256，各組樣品對H9亞型禽流感病毒特異性血清的HI效價在1∶102 4～1∶512 0，對禽流感(H5、H7亞型)陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清HI效價均為0(表2)。

表2 血凝抑制(HI)試驗結果

2.3 PCR擴增與電泳結果將5份尿囊液樣品提取RNA，經反轉錄、PCR擴增后，結果見圖1。從圖1可以看出，5份樣品均在1 600 bp處出現目的條帶，與預期片段大小相符，并無其他雜帶，說明擴增的目的基因產物特異性較高。

2.4 測序與Blast結果將擴增的PCR產物送至青島擎科梓熙生物技術有限公司測序，5份樣品均測序成功。分別將基因序列經Seqman軟件拼接后，在美國國家生物技術信息中心NCBI上進行Blast分析，結果顯示，與5份樣品同源性最高的均為H9N2 亞型禽流感病毒。

2.5HA基因核苷酸序列分析根據相關研究報道[8],H9亞型禽流感分為歐亞系、北美系兩大分支，北美系的代表株是A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)，歐亞系分支分為 Ⅰ 群、Ⅱ 群和Ⅲ群3個亞系，分別以A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)、A/Quail/HongKong/G1/97 (H9N2)、A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)為代表株。將分離的6個毒株的HA基因序列與從GenBank 中選出并下載的H9亞型毒株參考株和疫苗株的HA基因序列進行比對(表3)，并繪制進化樹。經過序列比對分析，結果顯示，分離的6個毒株之間的H9 亞型禽流感病毒HA基因核苷酸同源性為 93.3%～97.2%，并且它們處于同一分支，與參考株A/chicken/Beijing/1/1994(H9N2)的核苷酸同源性在85.9%～87.1%，與A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性較高，在89.2%～89.8%，與北美系代表株A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)的同源性較低，在74.7%～76.2%；與疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的核苷酸同源性最高，在92.1%～93.5%，與A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)的同源性在90.3%～91.7%。由圖2可知，A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)、A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)與歐亞系 Ⅰ 群的A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)在同一分支，A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)是歐亞系Ⅰ群h9.4.2.5的代表株，而6個分離株與A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)在同一支，且同源性較高，因此該試驗所分離的5個毒株均屬于歐亞系Ⅰ 群h9.4.2.5分支。

注：M.DL 2000D Marker;1.HFA9-1WF;2.HFA9-2CY;3.HFA9-3XT;4.HFA9-4LW;5.HFA9-5LC;A.陽性對照；B.陰性對照；C.空白對照Note:M.DL 2000D Marker; 1.HFA9-1WF; 2.HFA9-2CY; 3.HFA9-3XT; 4.HFA9-4LW; 5.HFA9-5LC; A.Positive control; B.Negative control; C.Blank control圖1 5份分離株PCR電泳結果Fig.1 PCR electrophoresis results of 5 isolates

表3 選取的H9亞型AIV參考株和疫苗株的情況

圖2 5株H9N2亞型AIV分離株HA基因進化樹分析Fig.2 Analysis of HA gene evolution tree of 5 H9N2 subtype AIV isolates

3 討論與小結

(1)該研究對5份疑似H9亞型禽流感病料進行分離、鑒定，確定所分離的5份毒株均為H9N2亞型禽流感，并對5個毒株進行測序，與從美國國家生物信息中心(NCBI)下載的序列進行比對分析，并繪制進化樹，通過分析顯示，所分離的5個毒株均屬于歐亞系 Ⅰ 群h9.4.2.5分支，5個毒株的H9 亞型禽流感病毒HA基因核苷酸同源性為 93.3%～97.2%，分離株與參考株A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性在89.2%～89.8%，與其親緣關系最近的疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的同源性在92.1%～93.5%，說明分離株與參考株和傳統(tǒng)的疫苗株產生了一定的遺傳距離，出現了抗原差異。

(2)對于H9亞型禽流感病毒的防控，免疫接種仍是有效的防控措施，然而隨著疫苗的長期使用，免疫壓力的出現，使H9N2亞型禽流感毒株發(fā)生變異和重組[9-10]，如果疫苗株與流行株匹配度不高，就會導致疫苗株的保護率下降。因此，對于H9N2亞型禽流感的流行、變異情況的持續(xù)跟蹤和監(jiān)測，對篩選疫苗候選株有重要意義，今后可繼續(xù)推進疫苗的研發(fā)，使H9N2亞型禽流感得到更有效的防控，這對了解該地區(qū)的H9亞型禽流感流行的變異情況及疫情防控對策具有重要意義。