滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎纖維化干預(yù)機(jī)制的研究*

林 麗，徐銳煌，吳 招，鄒楠婷，楊 翔，李 寧，王洪云，萬春平△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.楚雄州中醫(yī)醫(yī)院，云南 楚雄 675099；3.保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，云南 保山 678000）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是我國常見的繼發(fā)性腎臟病，以腎小球、血管、腎小管及其間質(zhì)損害為其病變特征，可因急性或慢性進(jìn)展為腎臟纖維化，嚴(yán)重可致腎功能衰竭，約有20%的LN患者可在5年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病[1]。因此，積極控制狼瘡活動(dòng)、延緩LN病變發(fā)展進(jìn)程、防止腎臟纖維化的發(fā)生具有重要的臨床意義。

課題組前期研究表明，滋陰清熱活血方能顯著減少狼瘡小鼠尿蛋白含量，明顯改善腎臟病理損傷，降低腎組織VEGF含量，從而起到保護(hù)腎臟的作用[2]。然而中藥復(fù)方滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠腎組織纖維化的影響尚未明確，值得進(jìn)一步研究。

激素仍是西醫(yī)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的主要藥物，雖療效顯著，但毒副作用較為常見，如長期或大劑量使用會(huì)引起病毒、細(xì)菌感染和高血糖、骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等一系列副作用和并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡[3]。本研究通過構(gòu)建自發(fā)性MRL/lpr系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型，研究滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠腎組織纖維化的影響，揭示該方抗狼瘡腎纖維化效應(yīng)機(jī)制，為滋陰清熱活血方聯(lián)合激素治療腎纖維化提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 自發(fā)性MRL/lpr系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量 20～22 g，雌性，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：scxk（京）2019-0010。飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度22℃±1℃，濕度55%±5%，12 h光暗循環(huán)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性養(yǎng)殖1周后使用。飼料和水均經(jīng)過高溫消毒殺菌處理，動(dòng)物自由啃食。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例嚴(yán)格進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方案通過昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥物及試劑 中藥復(fù)方“滋陰清熱活血方”由生地、知母、丹參、川芎、墨旱蓮、黃柏等組成。中藥飲片常規(guī)浸泡煎煮，過濾去雜質(zhì)后，將藥液裝入旋蒸儀進(jìn)行蒸餾水分處理，制成浸膏（1 g浸膏相當(dāng)于2.8 g生藥），置于冰箱4℃冷藏備用。醋酸潑尼松片購于浙江仙琚制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)201056。Smad4、Smad7蛋白抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ECL顯色液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、麗春紅染色液購于北京索萊寶科技有限公司；內(nèi)參一抗：β-actin抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；檢測(cè)二抗：HRP標(biāo)記通用型二抗購自美國CST公司；蛋白酶抑制劑cocktail、Phostop磷酸化蛋白酶抑制劑購自Roche；PVDF膜（0.45 m）、PVDF膜（0.22 m）均購自Millipore公司。

1.3 主要儀器 BRE05旋蒸儀購自佛山予華儀器科技有限公司；離心機(jī)購自德國Thermo Scientific Hearers；超低溫冰箱（-80℃）由 Thermo公司提供；低溫離心機(jī)HITACH由CF-16RX公司提供；水浴鍋由SANYO公司提供；紫外分光光度計(jì)由IMPLEN公司提供；垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜槽由BIO-RAD公司提供；凝膠成像儀由Tanon公司提供。LEICA DM LS2正置顯微鏡購自德國萊卡儀器有限公司；BM-IX生物組織包埋機(jī)、CS-IV型攤片烤片機(jī)、RS-18生物組織全自動(dòng)染色機(jī)購自湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；Epoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；自動(dòng)熒光免疫分析儀購自上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)

2.1 動(dòng)物分組與給藥 MRL/lpr為系統(tǒng)性紅斑狼瘡自發(fā)小鼠模型，12周發(fā)病，16周疾病發(fā)病達(dá)高峰[4]。于是在飼養(yǎng)11周后，根據(jù)尿蛋白濃度，平均分為5組，即模型組、激素（醋酸潑尼松）組、中藥（滋陰清熱活血方）組、中藥加激素全量組、中藥加激素半量組，10只/組。其中，激素組、中藥組分別予醋酸潑尼松6 mg/kg和滋陰清熱活血方37.5 g/kg；中藥加激素全量組和中藥加激素半量組分別予醋酸潑尼松6 mg/kg、3 mg/kg基礎(chǔ)上，予滋陰清熱活血方37.5 g/kg灌胃；模型組予等體積的生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)灌胃4周。小鼠給藥劑量依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算公式計(jì)算得出。

2.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 H＆E染色檢測(cè)腎組織病理 將固定的腎組織依次經(jīng)過75%、85%、95%、100%濃度梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm薄片。蘇木素-伊紅（H＆E）染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理損傷程度。

2.2.2 腎臟組織Masson染色檢測(cè)腎纖維化 將腎組織常規(guī)脫蠟至水，37℃ Bouin液中煤染2 h，流水沖洗，依次經(jīng)天青石藍(lán)、Mayer蘇木素滴染，酸性乙醇分化，麗春紅品紅、鉬磷酸處理、苯胺藍(lán)染色，分色，脫水，脫色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.2.3 免疫熒光檢測(cè)腎組織免疫復(fù)合物沉積 將取出的腎組織OCT包埋，于冰凍切片機(jī)切片，丙酮固定15 min，BSA封閉，PBST置于搖床上洗5次后，滴加Goat anti mouse lgG抗體，室溫避光1 h，封片，熒光拍照。

2.2.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)腎臟Smad4、Smad7的蛋白表達(dá)水平 運(yùn)用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)腎組織蛋白進(jìn)行定量分析后，滴入上樣緩沖液，100℃水浴15 min讓蛋白變性。按順序?qū)κ榛撬徕c-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離；在280 mA、65 min條件下，移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；室溫下用5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜1 h；稀釋一抗（1∶1 000）后，置于4℃冰箱孵育過夜，TBST漂洗，5 min/次，共 3 次；稀釋二抗（1∶2 000）后，在室溫下孵育120 min，TBST漂洗，方法同一抗。以GAPDH為內(nèi)參，用ECL試劑盒顯影成像，測(cè)定條帶灰度值采用Image J軟件，通過計(jì)算目的條帶與內(nèi)參的灰度值比值對(duì)Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)，全部數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)MRL/lpr小鼠腎組織病理變化的影響 H＆E染色結(jié)果顯示，模型組腎小球萎縮或增生，大小不均勻，形態(tài)多不正常，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性或壞死，部分腎小管為透明管型，間質(zhì)水腫擴(kuò)張明顯，可見大量出血，炎性細(xì)胞浸潤明顯。與模型組比較，激素組腎小球大小不一，部分腎小球充血擴(kuò)張，有少量腎小管為透明管型，間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤；滋陰清熱活血方組腎皮質(zhì)有少量腎小球萎縮，間質(zhì)有少量血管輕微充血擴(kuò)張，腎臟病理較激素組輕；滋陰清熱活血方加激素全量組腎小球結(jié)構(gòu)比較完整，未見明顯炎癥、水腫，偶見輕微出血；滋陰清熱活血方加激素半量組腎小球萎縮，腎小球內(nèi)可見少量玻璃樣變性，腎間質(zhì)內(nèi)有少量血管充血，病理情況略優(yōu)于中藥組，但次于中藥加激素全量組。見圖1。

圖1 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠的腎臟病理變化的影響

3.2 滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)MRL/lpr小鼠腎組織膠原沉積的影響 Masson三色染色是評(píng)估腎臟纖維化程度的常用方法。為明確滋陰清熱活血方對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型腎組織纖維化的影響，我們進(jìn)一步采用Masson染色法檢測(cè)腎組織膠原沉積。結(jié)果顯示，模型組出現(xiàn)大面積藍(lán)染區(qū)，滋陰清熱活血干預(yù)后，膠原沉積減少；與模型組和中藥組比較，激素組、滋陰清熱活血方加激素全量組和滋陰清熱活血方加激素半劑量組膠原沉積均有減少。見圖2。

圖2 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr小鼠腎組織纖維化的影響

3.3 滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)MRL/lpr小鼠腎臟IgG沉積的影響 免疫熒光觀察腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積結(jié)果顯示，模型組大部分腎小球毛細(xì)血管襻可見片狀沉積的大量IgG，以致幾乎整個(gè)腎小球都受累，且熒光強(qiáng)度高，并可見熒光染色強(qiáng)陽性的腎小球；而各個(gè)治療組腎組織IgG沉積均有不同程度減少，熒光強(qiáng)度減弱，熒光面積縮小，僅少部分腎小球可見熒光染色陽性。與模型組比較，滋陰清熱活血方加激素全量組腎臟的IgG熒光面積縮小、熒光強(qiáng)度減弱尤為明顯，其次為滋陰清熱活血方加激素半量組和中藥組，激素組腎臟的IgG熒光面積略有縮小、熒光強(qiáng)度略有減弱。與激素組比較，滋陰清熱活血方組、滋陰清熱活血方加激素全量組和滋陰清熱活血方加激素半量組腎臟的IgG熒光面積明顯縮小、熒光強(qiáng)度明顯減弱。見圖3。

圖3 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr小鼠腎臟IgG沉積的影響

3.4 滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)MRL/lpr小鼠腎組織Smad4和Smad7蛋白表達(dá)的影響 蛋白印跡雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，滋陰清熱活血方組、滋陰清熱活血方加激素全量組和滋陰清熱活血方加激素半劑量組腎組織Smad4蛋白下降，其中滋陰清熱活血方加激素全量組和滋陰清熱活血方加激素半劑量組下調(diào)尤為明顯。Smad7蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型比較，滋陰清熱活血方組、滋陰清熱活血方加激素全量組和滋陰清熱活血方加激素半劑量組顯著上調(diào)，其中以滋陰清熱活血方聯(lián)合激素2組增加更為顯著。見圖4。

圖4 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr小鼠腎組織Smad4、Smad7蛋白表達(dá)的影響

4 討論

中醫(yī)傳統(tǒng)古籍中無狼瘡腎的病名記載，也無“腎纖維化”這一說法，而從該病患者常見臨床表現(xiàn)看，可歸屬中醫(yī)“虛勞”“水腫”等病證。對(duì)該病病機(jī)的認(rèn)識(shí)，有研究認(rèn)為，腎臟纖維化是慢性腎臟疾病中一個(gè)漫長的形成過程，該病遷延難治，據(jù)中醫(yī)學(xué)“因虛致實(shí)”“久病必瘀”之理論，人體正氣因病久而漸致虛損，體內(nèi)邪毒瘀濁漸盛，積而不散，虛實(shí)夾雜，從而形成以正氣虛損為本，瘀毒內(nèi)結(jié)為標(biāo)的基本病機(jī)[5-8]。腎臟纖維化與中醫(yī)所說的“腎臟多虛”“內(nèi)結(jié)為瘀”的理論相符合。大量實(shí)驗(yàn)與臨床研究也證實(shí)，活血、補(bǔ)益為主的中藥和中藥復(fù)方可以通過不同途徑調(diào)控腎臟纖維化的進(jìn)程[9-13]。

本研究通過觀察自擬中藥復(fù)方“滋陰清熱活血方”對(duì)狼瘡腎發(fā)生發(fā)展起重要作用的Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平等指標(biāo)的影響，探討該方對(duì)防治腎纖維化的腎保護(hù)作用及其機(jī)制。滋陰清熱活血方繼承了全國名中醫(yī)孟如教授的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)，并在宏觀辨證與微觀辨證相結(jié)合的基礎(chǔ)上，經(jīng)長期臨床實(shí)踐創(chuàng)制而成。由于LN患者素有稟賦不足，腎陰虧虛，易感邪熱外襲，內(nèi)外合邪，致腎陰進(jìn)一步耗損，虛熱內(nèi)生化火，致熱壅血瘀，故而發(fā)??；從微觀看，有形的“腎纖維化”“腎小球萎縮”“腎小球出血情況”以及“腎臟細(xì)胞炎性浸潤”等病理變化均屬中醫(yī)的“瘀”與“熱”，該病的發(fā)展過程符合中醫(yī)學(xué)“久病必虛”“久病必瘀”“瘀久化熱”的病機(jī)理論。故認(rèn)為其基本病機(jī)可為腎陰虧虛、瘀熱互結(jié)，因此，滋陰補(bǔ)腎、清熱活血應(yīng)為基本治法。滋陰清熱活血方的組方中，生地黃、女貞子、墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎，川芎活血行氣，牡丹皮涼血活血，丹參、雞血藤活血祛瘀，知母、黃柏清熱瀉火，大薊涼血祛瘀，全方共奏滋陰補(bǔ)腎、清熱活血、涼血祛瘀之功效。結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究成果看，方中的生地黃能擴(kuò)張血管，降低毛細(xì)血管通透性，抑制血管內(nèi)皮炎癥，具有免疫抑制作用[14]；川芎具有顯著增加腎血流量，抑制腎小球纖維化，減少尿蛋白排泄，防治急性腎功能衰竭等作用[14]；丹參能改善腎功能、保護(hù)缺血性腎損傷[15]，與川芎合用能協(xié)同發(fā)揮改善腎功能作用；黃柏能抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)[14]；牡丹皮有顯著抑制炎癥作用，能抑制血小板聚集，具有抗血栓、調(diào)節(jié)免疫功能[15]等作用。諸藥合用的結(jié)果，均有利于本病的改善。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎臟纖維化既是各型LN進(jìn)展到終末期的共同病理表現(xiàn)，也是患者病情的重要反映指標(biāo)[1]。國內(nèi)外研究表明，Smads信號(hào)通路的功能失調(diào)在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著中心作用[16-17]，其中Smad4和Smad7與之關(guān)系較為密切[18]；而轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及其下游的Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腎纖維化過程中起著至關(guān)重要的作用[19]。大量研究還表明，Smad4和Smad7等是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要下游信號(hào)分子[20]，Smad4是TGF-β1介導(dǎo)纖維化和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過與Smad3和Smad7的相互作用，從而影響它們?cè)谀I組織炎癥和纖維化中的轉(zhuǎn)錄活性[21]。Smad4為通用型Smad蛋白，而Smad7為抑制型Smad蛋白，TGF-β1/Smad信號(hào)通路是TGF-β經(jīng)典途徑調(diào)控腎纖維化進(jìn)展的重要方式[22]。Smad7對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，在腎臟的高表達(dá)可以延緩腎臟纖維化的進(jìn)程[23]。

本研究結(jié)果顯示，滋陰清熱活血方聯(lián)合激素能夠減輕小鼠腎小球萎縮，改善腎小球間質(zhì)水腫，緩解腎小球出血情況，對(duì)腎臟細(xì)胞炎性浸潤有較好的治療作用。說明滋陰清熱活血方聯(lián)合激素對(duì)MRL/lpr小鼠腎組織腎纖維化具有較好的改善作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，滋陰清熱活血方聯(lián)合激素顯著抑制腎組織Smad4蛋白表達(dá)，上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)。提示其抗LN腎纖維化的作用機(jī)制與調(diào)控Smads信號(hào)通路的功能失調(diào)有關(guān)。該研究為臨床滋陰清熱活血方聯(lián)合激素治療系統(tǒng)紅斑狼瘡腎纖維化提供了生物學(xué)依據(jù)。