尿酸酶缺失大鼠的血細胞和血液流變學變化*

萬緒蓮，李律宇，李 丹，羅光云，李 寧，云 宇，段為鋼△

（1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明，650500；2.云南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學，云南 昆明 650500）

高尿酸血癥已經(jīng)成了危害人類健康的“第四高”[1]，與痛風、高血壓、糖尿病等疾病高度關聯(lián)[2-3]。為了研究高尿酸血癥的發(fā)病機制以及相關疾病的防治新策略，我們前期以SD大鼠為試驗大鼠，采用CRISPR/Cas9技術成功研制了尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY大鼠）[4]。該大鼠血尿酸明顯升高，與成年男性血尿酸相似或略高，可以穩(wěn)定繁殖，成年后的1年生存率可達90%[4-5]，盡管具有輕度的多器官損傷[6]。由于該大鼠無尿酸酶活性，其尿酸代謝與人進一步相似，可以避免造模劑帶來的干擾，有望為高尿酸血癥和相關疾病的防治研究提供更好的模型動物[5]，同時該模型動物在研究高尿酸血癥方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢[7-9]。為此，本研究以45 d日齡SD大鼠為對照，特觀察同齡尿酸酶缺失大鼠血細胞和血液流變學變化。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 雄性尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY大鼠）由實驗室自制，按照SFP標準繁育。雄性SD大鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）K2015-0002）由昆明醫(yī)科大學按照SPF標準繁育。尿酸檢測試劑盒（磷鎢酸法）（南京建成生物工程研究所）、氨丁三醇（Tris堿，>99.9%）（德國 BioFroxx公司）、全自動動物血細胞分析儀（型號：PE-3070VET）（深圳市普康電子有限公司）、全自動動物血液流變儀（型號：HL5000）（康宇醫(yī)療器械有限公司）、酶標儀（型33號：K6600-A）（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 隨機選取10只40 d日齡的SD大鼠（WT）和7只尿酸酶缺失大鼠（Uox-/-），適應性飼養(yǎng)到第45 d日齡稱重置于代謝籠記錄24 h出入量。實驗后置于固定器從尾部采抗凝血（EDTA-K2抗凝）0.2 mL用于血細胞分析。動物用烏拉坦（1.0 g/kg）麻醉后從腹主動脈采抗凝血（肝素抗凝）3 mL用于血液流變學檢測，同時采不抗凝血0.5 mL用于血尿酸檢測。

1.2.2 血細胞檢測 按照說明書操作開啟全自動動物血細胞分析儀，選擇大鼠模塊，將采到的EDTA-K2抗凝血混勻后直接進樣檢測，收集檢測數(shù)據(jù)。2 h內(nèi)完成血樣收集和血細胞檢測。

1.2.3 血液流變學檢測 按照說明書操作開啟全自動動物血液流變儀，選擇大鼠模塊，將采到的肝素抗凝血混勻后置于預定的進樣盤，自動檢測，收集檢測數(shù)據(jù)。2 h內(nèi)完成血樣收集和血液流變檢測。

1.2.4 尿酸檢測 血液樣品凝固后于3 000 r/min，離心5 min制備血清，制備的血清直接用于尿酸檢測。尿酸的含量測定方法則按照廠家提供的說明書進行。

2 結果

2.1 尿酸酶缺失大鼠的血尿酸水平、體質(zhì)量和出入量變化 45 d日齡尿酸酶缺失大鼠的血尿酸明顯高于野生型SD大鼠（圖1A），但體質(zhì)量略低于同齡野生型大鼠（圖1B），且差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這與我們的前期研究結果一致。

不考慮體質(zhì)量因素時，45 d日齡的尿酸酶缺失大鼠的24 h進食量無明顯變化（圖1C），但24 h飲水量（圖1D）和24 h排尿量（圖1E）明顯增加，同時24 h排便量卻有所減少（圖1F）?？紤]到體質(zhì)量因素時，校正后的指標尿酸酶缺失大鼠24 h進食量則明顯增加（圖1G），且24 h飲水量（圖1H）和24 h排尿量（圖1I）進一步增加，同時24 h排便量卻無明顯差異（圖1J）。見圖 1。

圖1 尿酸酶缺失大鼠的血尿酸水平、體質(zhì)量和出入量變化

2.2 尿酸酶缺失大鼠的血細胞指標變化 45 d日齡尿酸酶缺失大鼠的白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和中間細胞（主要包含單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）數(shù)目明顯低于野生型SD大鼠（圖2A）；但尿酸酶缺失大鼠的淋巴細胞比例高于野生型SD大鼠，中性粒細胞略低，而中間細胞比例無明顯變化（圖2B）。

與野生型SD大鼠相比，45 d日齡尿酸酶缺失大鼠的紅細胞數(shù)目無明顯改變（圖2C），紅細胞壓積和紅細胞分布寬度CV（變異系數(shù)）無明顯改變（圖2D）；但血紅蛋白濃度、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量、平均紅細胞血紅蛋白濃度以及紅細胞分布寬度SD（標準差）明顯減?。▓D2D）。

與野生型SD大鼠相比，尿酸酶缺失大鼠血小板數(shù)目、大血小板數(shù)目（圖2E），血小板分布寬度和血小板壓積（圖2F）無明顯改變；但血小板體積和大血小板比率明顯減?。▓D2F）。見圖2。

圖2 尿酸酶缺失大鼠的血細胞指標變化

2.3 尿酸酶缺失大鼠的血液流變學指標變化 與野生型SD大鼠相比，45 d日齡尿酸酶缺失大鼠全血高切、中切和低切黏度以及血漿黏度均減小（圖3A），但相應的相對黏度增加（圖3B），相應的還原黏度則進一步顯著增加（圖3C）。

與野生型SD大鼠相比，45 d日齡尿酸酶缺失大鼠的血液屈服應力減?。▓D3D），相應的低切、中切和高切流阻減少（圖3E）。與血細胞檢測結果類似，尿酸酶缺失大鼠的血沉減慢（圖3F），其方程K值也減?。▓D3G）；紅細胞壓積（圖3H）、紅細胞剛性指數(shù)（圖3I）和紅細胞內(nèi)黏度（圖3J）減小，而紅細胞聚集指數(shù)、紅細胞變形指數(shù)和紅細胞電泳指數(shù)（圖3I）則增加。見圖3。

圖3 尿酸酶缺失大鼠的血液流變學指標變化

3 討論

野生型SD大鼠正常表達尿酸酶，表達豐度最高部位是肝臟。與傳統(tǒng)的基因敲除不同，Kunming-DY大鼠是基于封閉群大鼠，即SD大鼠，采用CRISPR/Cas9技術敲除尿酸酶基因2～4號外顯子區(qū)域[4]。先獲得雜合子，通過不斷交配獲得純合子，純合子再相互交配選種獲得性狀較為穩(wěn)定的尿酸酶缺失大鼠。

尿酸酶缺失后，該大鼠的血尿酸明顯升高，但比文獻報道的基于近交系C57/6J小鼠研制的尿酸酶缺失小鼠要明顯的低[10]，成年后的1年生存率達90%以上，雖然表現(xiàn)出生長略有減慢，多飲多尿現(xiàn)象，但表型基本健康，也能正常繁育[4-6，11]。這些現(xiàn)象也在本研究中得到重現(xiàn)，說明該大鼠生長略有減慢，多飲多尿現(xiàn)象能夠穩(wěn)定重現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與同齡野生SD大鼠不同，尿酸酶缺失大鼠的白細胞數(shù)量偏少，且淋巴細胞比例增高，說明該大鼠可能存在慢性感染。尿酸酶缺失大鼠的紅細胞數(shù)量無明顯變化，但血紅蛋白、紅細胞體積、紅細胞血紅蛋白含量及濃度以及紅細胞分布寬度SD明顯減少，說明該大鼠具有營養(yǎng)性貧血傾向，可能存在一定的鐵利用障礙，具有小細胞低色素特征的“貧血”傾向。尿酸酶缺失對血小板數(shù)量影響較小，但血小板體積和大血小板比率均減少，說明該大鼠的血小板功能更傾向于成熟，有利于止血。

從血液流變學指標看，尿酸酶缺失后，大鼠的全血黏度、血液屈服應力、血液流阻、血沉均出現(xiàn)明顯下降。由于血液黏度主要受紅細胞影響，變小的紅細胞有利于全血黏度下降。由于紅細胞內(nèi)的血紅蛋白濃度也是下降的，因此紅細胞內(nèi)的黏度也由此減小。與相關黏度指標下降不同，尿酸酶缺失大鼠的還原黏度是增加的。全血還原黏度是指單位紅細胞壓積時的全血黏度值，考察的是單位紅細胞壓積對全血相對黏度的貢獻。這提示在尿酸酶缺失大鼠中，單位紅細胞壓積對血液的黏度貢獻是增加的。由于紅細胞內(nèi)的血紅蛋白含量有所減小，紅細胞的剛性也有所減弱。因為紅細胞體積變小，紅細胞的流動性有所改善，在電場的作用下更容易發(fā)生遷移。本研究結果表明雄性尿酸酶缺失大鼠在45 d日齡時，血尿酸水平明顯升高，且具有多飲多尿現(xiàn)象，但其白細胞數(shù)量略有減少，多個血液流變學指標也總體改善。