α5-GABAA受體對(duì)認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)作用及其在突觸內(nèi)外分布雙錨靠機(jī)制研究進(jìn)展

王準(zhǔn)，尹毅青

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院麻醉科 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指手術(shù)后新出現(xiàn)的學(xué)習(xí)和記憶等能力下降的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，發(fā)病率可因手術(shù)類型以及患者的情況而有所差異，老年人的發(fā)病率要明顯高于青年人［1］。盡管已經(jīng)受到越來越多人的關(guān)注，但是由于大腦的學(xué)習(xí)和記憶過程的復(fù)雜性以及影響因素的混雜性，POCD 的發(fā)病機(jī)制仍不明確。在學(xué)習(xí)和記憶的形成過程中，突觸可塑性一直被認(rèn)為起到關(guān)鍵性作用［2］，在抑制性突觸的作用下，興奮性突觸的可塑性可以發(fā)生改變，而影響大腦的學(xué)習(xí)和記憶能力。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與GABA 受體結(jié)合而起到調(diào)節(jié)神經(jīng)信號(hào)傳遞的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GABA 受體主要分為GABAA受體、GABAB受體和GABAC受體三類。含有α5 亞單位的GABAA受體被稱為α5-GABAA受體，它不僅可以為多種麻醉藥物提供作用位點(diǎn)從而產(chǎn)生麻醉效應(yīng)，而且還在突觸內(nèi)外的錨靠蛋白作用下參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)，因此該受體類型有可能是POCD 發(fā)生過程中的關(guān)鍵位點(diǎn)，而且隨著研究的深入，其在學(xué)習(xí)和記憶過程中的重要作用也逐漸被發(fā)掘［3-6］。現(xiàn)將α5-GABAA受體對(duì)認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)作用及其在突觸內(nèi)外分布的雙錨靠機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下，為臨床探究預(yù)防和治療POCD 提供新的思路。

1 α5-GABAA受體的結(jié)構(gòu)及其在突觸內(nèi)外的分布

1.1 α5-GABAA受體的結(jié)構(gòu) 在GABA 的三種類型受體中，GABAA受體是由同源亞單位構(gòu)成的異五聚體，從而形成配體門控的氯離子通道受體，通過與配體結(jié)合，該類受體可以發(fā)揮離子通道的作用允許氯離子通過，從而產(chǎn)生快速的抑制性應(yīng)答。GABAA受體的每種亞單位均具備相同的結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)較大的N 末端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)較小的C 末端結(jié)構(gòu)域和四個(gè)跨膜區(qū)域（transmembrane，TM）1～4。在TM3與TM4之間形成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracellular domain，ICD）是多種形式的翻譯后修飾（post-translation modification，PTM）的重要位點(diǎn)，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)蛋白與受體結(jié)合的作用位點(diǎn)，在調(diào)節(jié)受體的定位中起到非常重要的作用。迄今為止，人們?cè)贕ABAA受體中一共發(fā)現(xiàn)了八大類共計(jì)19種亞單位，分別為：α1～6、β1～3、γ1～3、θ、δ、ε、π、ρ1～3［6］。而α5-GABAA受體則是指包含有α5 亞單位的GABAA受體類型。不同亞單位裝配成的受體可以發(fā)揮不同的功能，比如α5/γ2結(jié)合后可以為苯二氮卓類藥物提供作用位點(diǎn)。隨著電子顯微鏡等新技術(shù)的應(yīng)用［7-8］，對(duì)于受體的構(gòu)成及相關(guān)藥物作用位點(diǎn)等問題可以更好地被進(jìn)一步研究和解決。

1.2 α5-GABAA受體在突觸內(nèi)外的分布 α5-GABAA受體在大腦中表達(dá)量不多，僅占腦內(nèi)全部受體的5%，但是在海馬區(qū)，這一比例可上升至25%，并且較多分布在海馬區(qū)的CA1和CA3區(qū)域［9］。在大腦的其他區(qū)域雖然也有α5-GABAA受體的分布，如大腦皮質(zhì)、杏仁核、下丘腦等，但是這些區(qū)域受體的表達(dá)水平都較低［10］。隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成GABAA受體的亞單位不同，不僅影響著受體在組織上的空間定位，而且還影響受體在更細(xì)微的亞細(xì)胞水平的分布。GABAA受體在細(xì)胞膜上的分布可以分為突觸內(nèi)分布和突觸外分布，其中含有α1、α2和α3亞單位的GABAA受體主要分布在突觸內(nèi)，由于對(duì)GABA的親和力低，因此介導(dǎo)快速而短暫的phasic 抑制。而突觸外含有α4 和/或α6 亞單位的GABAA受體對(duì)GABA 具有更強(qiáng)的親和力，可以介導(dǎo)緩慢但持久的tonic 抑制［10-11］。初始人們認(rèn)為α5-GABAA受體主要定位在突觸外，并在海馬中產(chǎn)生tonic 抑制而發(fā)揮作用。但近些年的研究則發(fā)現(xiàn)，α5-GABAA受體在突觸內(nèi)也有一定分布。通過分布位點(diǎn)不同，α5-GABAA受體可同時(shí)發(fā)揮phasic 抑制和tonic 抑制兩種作用［9］。對(duì)于受體來說，其位置的分布并非一成不變，而是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的過程。受體可在細(xì)胞內(nèi)合成并被分泌至細(xì)胞膜，并在受體的合成分泌過程中受到多種受體相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不同類型的亞單位被裝配組合成GABA 受體，成功合成的GABAA受體則被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w。通過與Plic-1 的結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的受體亞基會(huì)停留一定時(shí)間，從而使得未組裝的受體亞單位有足夠的時(shí)間發(fā)生多泛素化而被降解。當(dāng)受體被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體內(nèi)后，受體會(huì)與GABARAP/NSF 復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)其向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)［12］。但是有研究發(fā)現(xiàn)，α5-GABAA受體在突觸內(nèi)外的分布并不固定，通過受體在質(zhì)膜上的移動(dòng)，即橫向擴(kuò)散作用，可以實(shí)現(xiàn)受體在突觸內(nèi)外表達(dá)的再分布［13-14］。

2 α5-GABAA受體對(duì)認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)作用

大腦的海馬區(qū)一直被認(rèn)為是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，而α5-GABAA受體在海馬區(qū)大量分布的特點(diǎn)，使得人們將該受體與學(xué)習(xí)記憶聯(lián)系在一起［14］。隨著研究的深入，的確發(fā)現(xiàn)α5-GABAA受體的改變可以影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。在部分敲低海馬區(qū)α5-GABAA受體的小鼠中可以發(fā)現(xiàn)，小鼠在一些海馬依賴的行為如在痕跡條件恐懼試驗(yàn)、新事物識(shí)別試驗(yàn)中會(huì)發(fā)生改變，通過影響SST +/α 5-GABAA受體這一通路來改變受體的表達(dá)后，老年動(dòng)物模型的認(rèn)知功能發(fā)生了明顯的改善［15-16］。這些研究都表明，α5-GABAA受體在學(xué)習(xí)和記憶的過程中確實(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。但是α5-GABAA受體功能的調(diào)節(jié)具有雙向性。作為α5-GABAA受體的競爭性拮抗劑，S44819 可以使小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力可以得到明顯的改善［17］。而在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，L-655，708 雖然是α5-GABAA受體的反向激動(dòng)劑，但是卻并不總能夠改善實(shí)驗(yàn)小鼠的認(rèn)知能力，而是表現(xiàn)出一種年齡相關(guān)性：在青年小鼠異氟醚麻醉前和麻醉后應(yīng)用L-655，708 均可改善小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，但是對(duì)于老年小鼠來說，僅在麻醉前給予L-655，708 有改善認(rèn)知的作用，麻醉后再給予L-655，708 則對(duì)于小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響［18］。近些年來，在老年動(dòng)物如阿爾茲海默癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過正向激動(dòng)α5-GABAA受體，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的認(rèn)知能力也可得以提高［19］。激動(dòng)或者拮抗α5-GABAA受體的功能均可能改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的認(rèn)知功能。

3 調(diào)節(jié)α5-GABAA受體在突觸內(nèi)外分布的雙錨靠機(jī)制

興奮性突觸的可塑性如長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potential，LTP）一直被認(rèn)為是在哺乳動(dòng)物大腦中進(jìn)行學(xué)習(xí)和形成記憶的機(jī)制，通過調(diào)整突觸可塑性可以改變動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力［20］。但是LTP是一個(gè)正反饋過程，興奮性信號(hào)傳遞至突觸后部位發(fā)生去極化后刺激機(jī)體產(chǎn)生興奮活動(dòng)，從而再次出現(xiàn)興奮性信號(hào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)下一次LTP 的產(chǎn)生。因此在此過程中，抑制性突觸可以通過其抑制作用避免LTP 的累積，在改變抑制性突觸的強(qiáng)度后，LTP 的發(fā)生可以被影響和改變［21］。由于突觸內(nèi)外受體產(chǎn)生抑制的性質(zhì)上的差異，tonic 抑制和phasic 抑制對(duì)興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potential，EPSP）改變的程度也有所差異［22］，因此對(duì)LTP 的抑制程度也有不同。最新研究發(fā)現(xiàn)，在刺激誘發(fā)LTP 產(chǎn)生的過程中，突觸外的α5-GABAA受體可以進(jìn)入抑制性突觸，并對(duì)興奮性突觸反應(yīng)進(jìn)行抑制，進(jìn)而影響動(dòng)物的反向?qū)W習(xí)能力［14］。先前也有研究［23］報(bào)道，通過橫向擴(kuò)散作用，突觸外α5-GABAA受體進(jìn)入突觸后可以使動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生改變。因此，在學(xué)習(xí)和記憶產(chǎn)生的過程中，除α5-GABAA受體的表達(dá)量及總體功能之外，其在突觸內(nèi)外分布的調(diào)節(jié)可能是發(fā)揮其影響認(rèn)知功能的更為關(guān)鍵的機(jī)制。α5-GABAA受體在質(zhì)膜表達(dá)時(shí)存在不定向的流動(dòng)性，使得受體在突觸內(nèi)外均有分布具備了條件基礎(chǔ)，不同分布的GABAA受體可以分別產(chǎn)生不同的抑制電流來干擾突觸可塑性，進(jìn)而可以影響學(xué)習(xí)和記憶的形成。目前認(rèn)為，在突觸外主要依靠radixin蛋白將α5-GABAA受體錨靠在質(zhì)膜上，從而降低受體的流動(dòng)性［23-24］，而在突觸內(nèi)，α5-GABAA受體聚集則主要?dú)w功于gephyrin 蛋白［14］。這種在突觸內(nèi)外分別由不同的錨靠蛋白對(duì)α5-GABAA受體的分布進(jìn)行調(diào)節(jié)的機(jī)制，我們稱之為雙錨靠機(jī)制。

3.1 錨靠蛋白radixin 在突觸外對(duì)α5-GABAA受體的錨靠作用及其調(diào)控機(jī)制 Radixin 是ERM（ezrin，radixin，meosin）蛋白家族中的一員，最初在大鼠的肝臟組織中被發(fā)現(xiàn)。Radixin 蛋白主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：FERM 結(jié)構(gòu)域、C 末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）以及連接以上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的中間α結(jié)構(gòu)域。FERM 結(jié)構(gòu)域和CTD 可以分別與膜蛋白和肌動(dòng)蛋白作用，從而將蛋白固定在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上發(fā)揮錨靠作用［25］。2006 年，LOEBRICH 團(tuán)隊(duì)通過酵母雙雜交篩選的方式首次在大鼠大腦中發(fā)現(xiàn)radixin蛋白與α5-GABAA受體存在相互作用，并證實(shí)radixin可將α5-GABAA受體錨定在突觸外位點(diǎn)［26］。在特異干擾radixin 的表達(dá)后，突觸外的α5-GABAA受體簇?cái)?shù)量明顯減少，而穩(wěn)定radixin 與α5-GABAA受體結(jié)合后，可以阻止α5-GABAA受體再分布于抑制性突觸內(nèi)則進(jìn)一步證明了radixin 在突觸外對(duì)α5-GABAA受體的錨靠作用［14，23］。

但是radixin 的錨靠作用是磷酸化依賴性的，必須要經(jīng)過磷酸化修飾發(fā)生構(gòu)象變化被激活后，radixin 才能實(shí)現(xiàn)對(duì)α5-GABAA受體的錨靠。靜息狀態(tài)下，radixin 處于磷酸化狀態(tài)，α5-GABAA受體可與radixin 蛋白結(jié)合并因此錨靠在細(xì)胞骨架，當(dāng)有興奮信號(hào)傳遞時(shí)，radixin 的磷酸化水平下降，α5-GABAA受體結(jié)合不穩(wěn)定，從而使更多受體進(jìn)入突觸內(nèi)實(shí)現(xiàn)再分布過程［14，23］。然而目前對(duì)于磷酸化radixin 的信號(hào)通路存在一定爭議，認(rèn)為可能與蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和RhoA/Rock 信號(hào)通路有關(guān)［27-28］。

PKC 是一種Ca2+依賴的蛋白激酶，最初在非神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)可以參與ERM 蛋白家族的磷酸化過程。α5-GABAA受體再分布過程具有活動(dòng)依賴性，當(dāng)興奮性突觸活動(dòng)時(shí)可以增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度并促使radixin 蛋白發(fā)生去磷酸化，從而介導(dǎo)α5-GABAA受體的再分布［14］。因此，與Ca2+相關(guān)的可調(diào)控radixin 磷酸化過程的PKC 進(jìn)入人們的視野。當(dāng)使用抑制劑Go 6976 阻斷PKC 的活性后，ERM 蛋白的磷酸化水平增加［27］更加可以證明，Ca2+依賴性的PKC可以影響radixin 的磷酸化過程。Rho 具有調(diào)節(jié)如Rho激酶/ROKα等絲/蘇氨酸激酶活性的作用，通過對(duì)radixin 蛋白C 末端T564 位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，Rho 激酶可以改變r(jià)adixin 蛋白的頭尾相連的構(gòu)象從而使radixin 蛋白被激活［29］。但是當(dāng)神經(jīng)元活性發(fā)生變化時(shí)，RhoA/ROCK 信號(hào)通路可以使radixin 發(fā)生去磷酸化，而喪失對(duì)α5-GABAA受體的錨靠作用，從細(xì)胞骨架釋放的α5-GABAA受體橫向擴(kuò)散速度增加，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)突觸和突觸外α5-GABAA受體的再分布過程［23］。

3.2 錨靠蛋白gephyrin 在突觸內(nèi)對(duì)α5-GABAA受體的錨靠作用及其調(diào)控機(jī)制 Radixin 發(fā)生去磷酸化使α5-GABAA受體從突觸外位點(diǎn)被釋放，釋放后的受體流動(dòng)性增加并擴(kuò)散至突觸而被位于突觸內(nèi)的gephyrin 蛋白捕獲，實(shí)現(xiàn)受體從突觸外向突觸內(nèi)的再分布［23］。研究［30］顯示，與正常對(duì)照組相比，降低gephyrin 的表達(dá)可以顯著增加GABAA受體的流動(dòng)性，縮短受體在突觸部位的停留時(shí)間，這足以說明gephyrin 蛋白對(duì)受體的捕獲在GABAA受體再分布過程中的重要意義。Gephyrin 最初在與甘氨酸受體（glycine receptor，GlyR）共純化時(shí)被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)gephyrin 與GABA 能抑制性突觸存在共定位現(xiàn)象，而通過與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，gephyrin 可以將膜蛋白與細(xì)胞骨架連接發(fā)揮其錨靠作用。Gephyrin 主要由G-結(jié)構(gòu)域、E-結(jié)構(gòu)域和C-結(jié)構(gòu)域三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，各單體之間可以互相作用形成多聚體，并經(jīng)PTM 而發(fā)揮其錨靠功能［31］。但是與radixin 不同，gephyrin 的PTM 不僅形式多樣，而且調(diào)節(jié)相同PTM 方式的作用位點(diǎn)也并不單一，因此目前對(duì)于gephyrin 如何發(fā)揮其對(duì)α5-GABAA受體的錨靠作用尚不明確。

Gephyrin 的C-結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生磷酸化修飾，在全身各系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的gephyrin 蛋白中，其C-結(jié)構(gòu)域大約存在40個(gè)可磷酸化的位點(diǎn)，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，這一數(shù)目減少至個(gè)位數(shù)，其中與gephyrin 的成簇聚集現(xiàn)象密切相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)之一即Ser270 氨基酸殘基。Ser270 位點(diǎn)的磷酸化可以受GAK3β 的調(diào)節(jié)。在GSK3β 的作用下，該位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾而減少gephyrin-GABAA受體簇的形成，當(dāng)使用抑制劑將GSK3β 活性抑制后，Ser270 殘基發(fā)生了去磷酸化，同時(shí)gephyrin-GABAA受體簇的密度相應(yīng)增加。與GSK3β 的作用相同，CDK5 也可以調(diào)節(jié)Ser270 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾［32-33］，但令人不解的是，在CDK5的作用下發(fā)生磷酸化修飾后對(duì)gephyrin-GABAA受體簇造成的影響與GSK3β 完全相反［32］，在這兩條信號(hào)通路中雖然蛋白發(fā)生相同的磷酸化，但最終產(chǎn)生不同結(jié)局的原因仍值得進(jìn)一步探究。除Ser270 位點(diǎn)外，gephyrin 的Ser303和Ser305殘基在PKA 和CaMKⅡ的作用下也可以發(fā)生磷酸化。同前所述，α5-GABAA受體再分布的發(fā)生需要興奮活動(dòng)的刺激，同時(shí)radixin 構(gòu)象的改變也與興奮信號(hào)密切相關(guān)。與此相一致的是，PKA 和CaMKⅡ作為Ca2+依賴的蛋白激酶，在調(diào)節(jié)Ser303 和Ser305 位點(diǎn)的磷酸化修飾時(shí)也需要興奮信號(hào)的刺激［34］，因此，Ca2+依賴的PKA和CaMKⅡ在調(diào)節(jié)gephyrin 發(fā)揮對(duì)GABAA受體的錨靠作用中可能扮演了非常關(guān)鍵的角色。

與上述通路介導(dǎo)的磷酸化修飾不同，DHHC-3可以介導(dǎo)gephyrin 的棕櫚?；揎?。棕櫚?；菍㈤L鏈脂肪酸通過共價(jià)鍵連接至半胱氨酸殘基而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾的一種作用機(jī)制，通過棕櫚?；揎?，蛋白與細(xì)胞膜的結(jié)合程度可以發(fā)生改變。目前對(duì)抑制性突觸中可進(jìn)行棕櫚?；揎椀牡鞍籽芯枯^少，其中g(shù)ephyrin 蛋白就是可以發(fā)生棕櫚?；牡鞍字唬?5］。在DHHC-3酶的作用下，gephyrin的C-結(jié)構(gòu)域中的Cys212和Cys284兩個(gè)位點(diǎn)可以被棕櫚?；?，使得gephyrin 蛋白與突觸后膜的連接更加緊密，進(jìn)而對(duì)質(zhì)膜表面流動(dòng)的GABAA受體進(jìn)行捕獲而改變突觸的可塑性［36］。隨著研究的深入，更多調(diào)節(jié)gephyrin 修飾的信號(hào)通路進(jìn)入人們的探討范圍，比如對(duì)gephyrin 聚集有負(fù)性調(diào)控作用的S-亞硝基化，對(duì)賴氨酸殘基Lys148 和Lys724 進(jìn)行小泛素樣修飾物（Small Ubiquitin-like Modifier，SUMO）添加的SUMO化以及乙?；龋急话l(fā)現(xiàn)可以改變突觸后膜上gephyrin蛋白簇的表達(dá)量［37-38］。更為復(fù)雜的是，在多條信號(hào)通路中，不同的修飾方式可能會(huì)相互作用、互為補(bǔ)充，這種復(fù)雜性使得人們對(duì)gephyrin 蛋白的研究變得愈發(fā)困難。

綜上所述，在雙錨靠機(jī)制的作用下，α5-GABAA受體可以完成在突觸內(nèi)外的再分布進(jìn)而影響學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能，這可能是探究POCD 發(fā)生機(jī)制的重要靶點(diǎn)。但是在雙錨靠機(jī)制發(fā)揮作用的過程中，radixin 和gephyrin 似乎存在完全獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于是否存在一些共同的作用機(jī)制影響兩者的活性以及兩者在α5-GABAA受體的再分布中如何協(xié)調(diào)配合發(fā)揮作用等問題目前均無研究。因此，研究radixin 和gephyrin 在α5-GABAA受體再分布過程中的雙錨靠機(jī)制在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用將會(huì)是接下來研究的重點(diǎn)，可能為治療相關(guān)疾病提供新的思路和方法。