miRNA和MMP在椎間盤退變中作用的研究進(jìn)展

郭濤文 ，藺茂強(qiáng) ，張曉勃 ，胡一村 ，張芮浩 ，周海宇

1 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，蘭州 730030；2 甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室；3 西安紅會醫(yī)院骨科

下腰痛（LBP）是脊柱外科的常見疾病，嚴(yán)重影響人們的正常工作和生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致殘疾，給社會公共衛(wèi)生工作和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大負(fù)擔(dān)。椎間盤退變（IVDD）被認(rèn)為是導(dǎo)致LBP 的主要原因，其病因機(jī)制至今不明，是遺傳、年齡、機(jī)械負(fù)荷和不良習(xí)慣（如吸煙、酗酒）等因素綜合作用的結(jié)果［1］。近年來，隨著分子和細(xì)胞水平檢測技術(shù)的發(fā)展以及IVDD 病因?qū)W機(jī)制研究的不斷深入，微小RNA（miRNA）作為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在生物體新陳代謝、細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［2］。與健康髓核（NP）組織相比，miRNA 在退變NP 組織中異常表達(dá)，這對IVDD進(jìn)程具有不可忽視的調(diào)控作用［3-4］。研究表明，miRNA 可參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑、炎癥作用、細(xì)胞凋亡和增殖等病理生理過程，從而影響IVDD的發(fā)生發(fā)展［4-7］。而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）主要通過促進(jìn)基質(zhì)中蛋白成分的降解，打破合成和分解代謝之間的平衡狀態(tài)，進(jìn)而推動IVDD 進(jìn)展。除單獨發(fā)揮作用外，miRNA 還可調(diào)控MMP 的表達(dá)，以此參與 IVDD［8-9］。因此，本文對 miRNA 和 MMP 在 IVDD中的作用進(jìn)行綜述，旨在為IVDD 的臨床診斷和靶向治療提供指導(dǎo)。

1 miRNA在IVDD中的作用

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，由莖環(huán)前體miRNA經(jīng)Ⅲ型核糖核酸酶Dicer加工修飾后生成，參與生物轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，且對大部分細(xì)胞mRNA 的表達(dá)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。基于這種生物學(xué)特性，miRNA在機(jī)體正常和病理狀態(tài)下均可發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。這或許為抑制甚至逆轉(zhuǎn)機(jī)體疾病狀態(tài)提供了靶標(biāo)，特別是在IVDD 中，一些異常表達(dá)的miRNA 通過下游途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和過度增殖、ECM 成分降解等，調(diào)節(jié)椎間盤（IVD）組織的生物活性，參與 IVDD 的發(fā)生和進(jìn)展［2-7，10-15］。但目前 miRNA異常表達(dá)對IVDD 的綜合影響尚不明確，闡明其作用機(jī)制將有利于臨床上病態(tài)IVD的治療。

1.1 miRNA 與炎癥反應(yīng) 眾所周知，炎癥作用是導(dǎo)致IVDD的重要機(jī)制，并且退變IVD組織中腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等促炎細(xì)胞因子的大量增多可能與miRNA的表達(dá)水平密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-2355-5p 在退變IVD 組織和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的NP 炎癥環(huán)境中表達(dá)上調(diào)，其靶基因ERBB 受體反饋抑制劑1（ERRFI1）表達(dá)減少，并且ERRFI1抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）產(chǎn)生和抑制NP細(xì)胞（NPC）異常增殖的有利作用被miR-2355-5p所阻斷［5］?？梢?，過表達(dá)的miR-2355-5p 可促進(jìn)NPC過度增殖和炎癥作用，加速IVDD 的進(jìn)程。另外，炎癥因子的存在影響了 miRNA 的表達(dá)。LIN 等［13］發(fā)現(xiàn)，TNF-α 可抑制人 NPC 的活力，增加 IL-1β 表達(dá)同時還可減少miR-495-3p mRNA 的表達(dá)量，具有抑制NPC 增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)炎癥等作用。但miR-495-3p 表達(dá)上調(diào)逆轉(zhuǎn)了TNF-α 的這種負(fù)性效應(yīng)，這可能與 miR-495-3p 靶向作用于 IL-5 受體 α 亞基有關(guān)。說明調(diào)整miRNA 表達(dá)可能是調(diào)控NP 組織中炎性因子分泌的可靠手段，有望成為治療IVDD的策略。

1.2 miRNA 與細(xì)胞凋亡 凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，時刻發(fā)生于機(jī)體的生理和病理過程中，而IVD細(xì)胞（包括NPC、纖維環(huán)細(xì)胞、軟骨終板細(xì)胞）凋亡被認(rèn)為是 IVDD 最重要的特征。SUN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p 在IVDD 組織中過表達(dá)，并通過靶向調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（SIRT1）的水平介導(dǎo)了p21 的高表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如裂解半胱天冬酶-3 和B 細(xì)胞淋巴瘤2 相關(guān)X 蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-199a-5p 可通過促進(jìn)NPC 的凋亡來推動IVDD 過程。與之相反的是，miR-19b-3p和miR-499a-5p 等miRNA 分子在退變的IVD 組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)它們的表達(dá)量被上調(diào)時，可作用于其下游靶點或通路發(fā)揮抑制NPC 凋亡的作用［7，14］。可見，miRNA 可通過促進(jìn)或抑制 IVD 細(xì)胞凋亡影響整個IVDD 過程，恢復(fù)其正常表達(dá)水平和針對靶點的調(diào)控方式或可有效抑制IVD常駐細(xì)胞的凋亡，減緩?fù)俗冞M(jìn)程。

1.3 miRNA 與 ECM 穩(wěn)態(tài) 正常情況下，IVD 中的ECM 成分經(jīng)過合成代謝和分解代謝而不斷更新，總體上維持穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)分解作用強(qiáng)于合成作用時，平衡狀態(tài)的打破將引發(fā)IVDD。研究發(fā)現(xiàn)，高水平的miR-30d 與NP 組織的退行性變密切相關(guān)，且抑制miR-30d 可靶向上調(diào)SRY 相關(guān)高遷移率組框9（SOX9）的表達(dá)，從而促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白（Col Ⅱ）和蛋白聚糖的表達(dá)并減少了MMP-3 和MMP-13 的合成，對維持ECM 的穩(wěn)態(tài)有積極作用［6］。由此可知，退變NP 組織中miR-30d 的高表達(dá)可抑制SOX9 的表達(dá)而阻止ECM組分的合成，同時促進(jìn)了基質(zhì)成分的水解，這無疑加重了IVDD。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-499a-5p在人退變NP組織中表達(dá)水平和作用機(jī)制與miR-30d幾乎完全相反，即miR-499a-5p 在過表達(dá)時可促進(jìn)Col Ⅱ和蛋白聚糖的合成并抑制MMP-3 和MMP-13的表達(dá)，在一定程度上扭轉(zhuǎn)了合成和分解代謝之間的失衡［14］。鑒于 ECM 中蛋白成分的丟失是 IVDD 發(fā)生過程中最為重要的病理變化，通過調(diào)整miRNA 表達(dá)維持ECM 成分相對穩(wěn)定對于臨床治療IVDD 具有一定的潛力。

綜上所述，miRNA 在退行性IVD 組織的復(fù)雜環(huán)境中表達(dá)異常，其異常表達(dá)與IVDD 有關(guān)。因此，及時調(diào)整使其表達(dá)水平恢復(fù)正常對IVDD 有一定的延緩甚至逆轉(zhuǎn)作用，這為臨床研究IVDD 的基因靶點治療提供了途徑。

2 MMP在IVDD中的作用

MMP是一類依賴鋅的蛋白水解酶，可降解ECM中的多類蛋白質(zhì)。迄今為止，已鑒別出多種MMP，包括膠原酶、明膠酶、溶基質(zhì)素、基質(zhì)溶解素、膜型MMP（MT-MMP）和其他類型六種。作為組織重塑和修復(fù)的重要調(diào)節(jié)因子，MMP 能夠以“一對多”或“多對一”的方式參與多種ECM 成分的降解，以此重建ECM 結(jié)構(gòu)，進(jìn)而維持細(xì)胞外微環(huán)境的相對穩(wěn)定狀態(tài)。研究表明，MMP 可通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、ECM 成分重塑等過程，參與IVD退化、動脈粥樣硬化和腫瘤等多種疾病的病理生理活動［16］。

如前文所述，IVDD的起始和發(fā)展過程涉及諸多因素，其病因機(jī)制尚未完全闡明，但不可否認(rèn)的是，IVD 組織中ECM 穩(wěn)態(tài)的破壞是IVDD 發(fā)生的重要標(biāo)志。目前已知，在各種復(fù)雜病理因素的刺激下，IVD細(xì)胞中分解代謝基因的激活導(dǎo)致MMP的異常高表達(dá)，造成Col Ⅱ、蛋白聚糖等ECM重要組分的減少，加快了IVDD的發(fā)展速度。KWON等［17］發(fā)現(xiàn)，在缺氧和IL-1β的共刺激作用下，MMP-1和MMP-3在NPC 和纖維環(huán)細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，并通過增加ECM降解促進(jìn)了IVDD發(fā)展。另外，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1能夠以劑量依賴性方式促進(jìn) MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13 在人終板軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，加速了軟骨終板組織ECM 的降解［18］。此外，下調(diào)胰島素樣生長因子1受體的表達(dá)可增加MMP-13表達(dá)量，繼而引起Col Ⅱ和蛋白聚糖的水解，最終導(dǎo)致小鼠IVDD 加速［19］。可見，IVD 細(xì)胞中 MMP 過表達(dá)增強(qiáng)了對 ECM的分解代謝作用，從而造成IVDD 的惡化，這可能與IVD 細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境被破壞密切相關(guān)。此外，還有大量的研究證實，MMP與IVDD具有相關(guān)性。如MMP-1 的免疫組織化學(xué)評分可作為頸、腰IVDD嚴(yán)重程度的獨立預(yù)測指標(biāo)［20］；MMP-3、MMP-9 被發(fā)現(xiàn)在LBP患者的退化軟骨終板樣本中過表達(dá)［21］。鑒于遺傳因素在IVDD 中的關(guān)鍵作用，MMP 的基因多態(tài)性也可影響其在IVD 組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而作用于 IVDD［22］。除此之外，IVD 細(xì)胞 MMP 的表達(dá)水平還受到miRNA 的調(diào)控，這將在下文中做詳細(xì)闡述。總之，MMP-1、-2、-3、-9、-13 等作為ECM 重塑的直接效應(yīng)分子，它們的過表達(dá)在IVDD 的進(jìn)展過程中具有至關(guān)重要的作用。

3 miRNA/MMP軸在IVDD中的作用

3.1 miRNA/MMP 軸概述 miRNA 作為一種高度保守的組織特異性小分子RNA，其具有廣泛的靶基因，幾乎可影響所有基因的表達(dá)，可通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控過程。部分miRNA 可與MMP mRNA 的3'-未翻譯區(qū)域（3'-UTR）互補(bǔ)序列結(jié)合，以此調(diào)控MMP 的表達(dá)，構(gòu)成miRNA/MMP 軸。在IVDD 發(fā)生時，軸內(nèi)miRNA的低表達(dá)使得相應(yīng)MMP 高表達(dá)，造成ECM 蛋白成分的丟失，加劇了IVDD［8-9，23-28］。

3.2 miR-155/MMP-16 軸 miR-155 是一種相對保守的多功能miRNA，其異常表達(dá)參與免疫應(yīng)答反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等機(jī)體生理和病理過程［8］。MMP-16 作為MT-MMP 的一員，被發(fā)現(xiàn)在正常生理過程如胚胎發(fā)育和組織重塑中發(fā)揮一定作用，并可參與 IVDD 中 ECM 成分的降解［29］。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，miR-155 靶向調(diào)節(jié)MMP-16 的作用被發(fā)現(xiàn)。

ZHANG 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 在退變 NP 組織中的表達(dá)水平明顯降低，而MMP-16的表達(dá)量與IVD組織退變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。實驗結(jié)果表明，miR-155 水平的上調(diào)在抑制MMP-16 表達(dá)的同時增加了小鼠NP 組織中蛋白聚糖和Col Ⅱ的表達(dá)；相反，抑制miR-155 的表達(dá)導(dǎo)致MMP-16 表達(dá)上調(diào)和NP 組織中蛋白聚糖的減少，從而加速IVDD?？芍贗VDD 過程中，miR-155 表達(dá)下調(diào)使得它靶向抑制MMP-16 表達(dá)的作用被減弱，導(dǎo)致了MMP-16 高表達(dá)，進(jìn)而造成IVD 細(xì)胞生存的微環(huán)境發(fā)生改變，如ECM 成分、含量變化。通過內(nèi)源性上調(diào)和外源性補(bǔ)充miR-155，以及抑制靶點MMP-16 的方式有望為逆轉(zhuǎn)IVDD提供新的思路。

3.3 miR-127-5p/MMP-13 軸 miR-127-5p 與 多 種疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程有關(guān)，包括骨關(guān)節(jié)炎（OA）和惡性腫瘤等，其參與細(xì)胞的增殖、凋亡等過程，同時也在ECM 降解過程中發(fā)揮一定作用［30］。MMP-13作為一種基質(zhì)降解酶，在IVDD 過程、OA 進(jìn)展及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色［23］。特別是近年來，miRNA 和MMP 在IVDD 過程中的重要作用不斷被學(xué)者證實，miR-127-5p/MMP-13軸可能在IVDD過程中發(fā)揮重要作用。

有研究表明，在退變IVD 組織中，miR-127-5p過表達(dá)引起NPC 中Col Ⅱ表達(dá)上調(diào)，MMP-13 表達(dá)降低；而抑制miR-127-5p 表達(dá)后，Col Ⅱ表達(dá)降低，MMP-13 表達(dá)則增加，即 MMP-13 和 miR-127-5p 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［23］?？梢姡琺iR-127-5p/MMP-13 軸對IVDD 的發(fā)生發(fā)展具備調(diào)控能力。此外，Col Ⅱ丟失是IVDD 的早期標(biāo)志，而低表達(dá)miR-127-5p 引發(fā)的MMP-13 高表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致的Col Ⅱ減少可能是IVDD發(fā)生的重要機(jī)制，因此miR-127-5p 表達(dá)水平的恢復(fù)可能在人類NPC 中發(fā)揮保護(hù)作用，從而維持IVD 組織正常的生理活性。

3.4 miR-193a-3p/MMP-14 軸 miR-193a-3p 是 機(jī)體細(xì)胞完成生長、增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)活動的重要參與者。并且，miR-193a-3p還可通過控制局部細(xì)胞促炎因子的釋放來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，參與機(jī)體多種病理生理過程［31］。MMP-14 也屬于MT-MMP 中的一種，參與腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且在 IVDD 過程中可降解 ECM 成分，如Col、彈性蛋白、蛋白聚糖等，從而加速其進(jìn)程［32］。與正常IVD 組織不同，退變IVD 組織中出現(xiàn)了miR-193a-3p的異常表達(dá)，并存在miR-193a-3p 與MMP-14 之間的軸向作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-193a-3p 的過表達(dá)可增加NPC中Col Ⅱ的合成，且生物信息學(xué)靶點預(yù)測、Western blotting 和相關(guān)基因檢測結(jié)果都顯示MMP-14 為miR-193a-3p的靶標(biāo)；與此同時，抑制miR-193a-3p的表達(dá)可導(dǎo)致MMP-14表達(dá)上調(diào)，從而降解Col Ⅱ等重要ECM組分，促進(jìn)IVDD的發(fā)生［24］。

上述研究證實，miR-193a-3p/MMP-14 軸在IVDD 過程中發(fā)揮了作用，且維持miR-193a-3p 的表達(dá)或抑制其下調(diào)可阻止ECM 成分的丟失，從病因?qū)W機(jī)制上延緩或逆轉(zhuǎn)IVD結(jié)構(gòu)變性，為IVDD疾病的臨床診斷及防治提供新的方向。

3.5 miR-874-3p/MMP-2、miR-874-3p/MMP-3 軸miR-874-3p在機(jī)體細(xì)胞凋亡和生長等生理過程中扮演重要角色，如通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移或促使其凋亡在骨肉瘤等惡性腫瘤中發(fā)揮一種負(fù)性調(diào)節(jié)作用［33］。而且，miR-874-3p 還可能在抑制 NPC 凋亡中起橋梁作用。MMP-2 是一種明膠酶，它可降解基底膜的主要成分而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移及進(jìn)展，同時在各種細(xì)胞的ECM 重塑中發(fā)揮不可忽視的作用，MMP-3也具有類似作用［34］。因此，miR-874-3p 抑制 NPC 凋亡和 MMP-2、MMP-3 所具備的 ECM 降解等作用，但它們是否共同參與IVDD 過程及其作用機(jī)制依然值得探索。

當(dāng)IVD 組織發(fā)生退變時，miR-874-3p 表達(dá)量降低。SONG 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，28 例 IVDD 患者的 NP 組織中miR-874-3p 表達(dá)均出現(xiàn)顯著降低，且其表達(dá)下調(diào)可能在IVDD 過程中發(fā)揮重要作用。miR-874-3p在正常IVD 中可直接靶向下調(diào)MMP2、MMP3 在NP組織中的表達(dá)，避免了ECM 的降解，維持NP 結(jié)構(gòu)的完整性，起到保護(hù)IVD 的作用。眾所周知，IVD 組織在承載復(fù)雜機(jī)械應(yīng)力和維持脊柱穩(wěn)定性方面有至關(guān)重要的作用，且NP 組織變性及NPC 數(shù)量減少是IVDD 的重要內(nèi)容。因此，這種表現(xiàn)為miR-874-3p表達(dá)減少和MMP-2、MMP-3 表達(dá)增加的軸向作用會推動IVDD 的進(jìn)展，針對該軸的靶向療法可為IVDD的治療提供新的希望。

3.6 miR-202-3p/MMP-1軸 研究發(fā)現(xiàn)，miR-202-3p可靶向抑制MMP-1 的表達(dá)，并且其表達(dá)缺失可通過上調(diào)MMP-1 的表達(dá)和破壞內(nèi)皮間連接增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞在腦內(nèi)皮的遷移，表明miR-202-3p/MMP-1軸在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［35］。盡管MMP-1因具備ECM 降解作用而與IVD 退變和突出的發(fā)病過程密切相關(guān)，但miR-202-3p 在IVDD 中的作用卻鮮有研究。因此，miR-202-3p/MMP-1 軸是否在IVDD發(fā)生發(fā)展過程中具備類似的調(diào)控作用需要進(jìn)一步探討。

既往研究表明，NP組織退變越嚴(yán)重，miR-202-3p的表達(dá)量越低。SHI 等［25］發(fā)現(xiàn)，miR-202-3p 在退變NP組織中表達(dá)下調(diào)，且miR-202-3p的過表達(dá)抑制了IL-1β 誘導(dǎo)的 MMP-1 表達(dá)，阻止了 Col Ⅱ的降解；而miR-202-3p被抑制后，MMP-1的表達(dá)顯著上調(diào)，并造成Col Ⅱ的丟失。值得注意的是，IL-1β 的刺激可顯著下調(diào)miR-202-3p 的表達(dá)并誘導(dǎo)MMP-1 的表達(dá)，而miR-202-3p的過表達(dá)也可反過來抑制IL-1β對MMP-1的這種誘導(dǎo)作用，從而阻止IVDD 過程。這表明，miR-202-3p 表達(dá)上調(diào)可降低人NPC 中MMP-1 的表達(dá)量，維持ECM 穩(wěn)態(tài)，在IVDD 發(fā)生過程中具有保護(hù)基質(zhì)的作用，或可作為預(yù)防及治療IVDD 的特殊靶點。

綜上所述，miRNA 通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和ECM 降解等途徑以及MMP直接參與ECM 蛋白成分降解而在IVDD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，miRNA和MMP之間存在特殊的軸向關(guān)系。因此，基于miRNA和MMP在IVDD過程中這種不可替代的作用，或可開發(fā)早期診斷方法以及針對miRNA、miRNA靶基因和miRNA/MMP 軸的靶向治療方式。這為臨床早期識別IVDD 提供了可能，并且在運用無創(chuàng)方法延緩甚至逆轉(zhuǎn)IVDD方面展現(xiàn)出巨大的潛力。