原花青素對漂白后牙本質(zhì)與復(fù)合樹脂粘接強度的影響

李姝宏， 陳虹西， 周利平， 楊倩， 謝翠柳，2

1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州（646000）； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科，四川 瀘州（646000）

過氧化脲（10%）因其操作方便、低損傷等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于居家牙齒美白治療［1-2］。臨床發(fā)現(xiàn)過氧化脲能夠滲透牙釉質(zhì)到達牙本質(zhì)，降低牙本質(zhì)與樹脂的即刻粘接強度［3］。針對該問題，臨床常推遲4 周再進行漂白后牙體的樹脂粘接修復(fù)［4］。如何快速、高效地獲得漂白后牙齒與樹脂的良好粘接強度，對于減少患者就診次數(shù)，提高診療效率具有重要意義。相較于目前國內(nèi)外學(xué)者研究較多的抗環(huán)血酸鈉［5］，原花青素作為一種天然抗氧化劑［6］，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，作用迅速，安全性能更高，且原花青素清除自由基的活性是抗壞血酸鈉20 倍［7］。研究顯示原花青素可改善漂白后牙本質(zhì)粘接強度降低的問題［8］，但對于使用時間仍存在爭議［9-10］。因此，本實驗擬探討原花青素作用對過氧化脲漂白后牙本質(zhì)粘接強度的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

10%過氧化脲（皓齒公司，美國）；原花青素（solarbio，中國）；Adper Single Bond 2（51202，3M 公司，美國）；無水乙醇（天利公司，中國）；復(fù)合樹脂（Z250，3M 公司，美國）；35%磷酸（heraeus，德國）；場發(fā)射掃描電鏡（MLA650F，F(xiàn)EI，美國）；萬能測試機（WDW-D，恒瑞金試驗機有限公司，中國）；超聲震蕩儀（VGT-173QTD，廣東固特超聲有限公司，中國）；冷熱循環(huán)機（TC-501F，蘇州威爾實驗用品公司，中國）；光固化機（G568E24440F2A1，Dentsply，德國）；游標卡尺（三本精密儀器有限公司，中國）。

1.2 離體牙收集及原花青素預(yù)處理劑的配制

本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準（批號：20191227001），采集120 顆近期完整拔除的無齲壞、缺損的阻生第三磨牙，患者均已簽署知情同意書。清理牙齒表面附著組織，保存于1%氯胺T 溶液中。將原花青素加入無水乙醇中，制備質(zhì)量體積分數(shù)為5%的預(yù)處理劑，用標準氫氧化鈉滴定至pH=7.2。

1.3 實驗分組與試件制備

樣本牙隨機分為12 組（n=10）：W 組（無漂白+去離子水）、Wa 組（無漂白+去離子水+老化）、WT1組（無漂白+5%原花青素1 min）、WT1a 組（無漂白+5%原花青素1 min+老化）、WT2 組（無漂白+5%原花青素5 min）、WT2a 組（無漂白+5%原花青素5 min+老化）、C 組（過氧化脲+去離子水）、Ca 組（過氧化脲+去離子水+老化）、CT1 組（過氧化脲+5%原花青素1 min）、CT1a 組（過氧化脲+5%原花青素1 min+老化）、CT2 組（過氧化脲+5%原花青素5 min）、CT2a 組（過氧化脲+5%原花青素5 min+老化），具體粘接面處理見表1。牙冠橫向切開去除面0.5 cm 厚度牙釉質(zhì)，W、Wa、WT1、WT1a、WT2、WT2a 進行去離子水處理；C、Ca、CT1、CT1a、CT2、CT2a 組使用過氧化脲處理8 h，徹底沖洗后，再去除所有試件面全部牙釉質(zhì)，暴露中層牙本質(zhì)，牙本質(zhì)粘接面使用碳化硅砂紙濕性打磨牙體表面，模擬臨床牙本質(zhì)玷污層，35%磷酸酸蝕15 s，去離子水徹底沖洗30 s。按表1 的分組和預(yù)處理方式使用去離子水或原花青素處理，再使用去離子水沖洗30 s。均勻涂布Single Bond2，輕吹3 s，光固化5 s，采用分層固化技術(shù)通過模具堆塑高為4 mm、直徑為4 mm 的樹脂復(fù)合體。

1.4 試件儲存與冷熱循環(huán)老化實驗

W、WT1、WT2、C、CT1、CT2 組檢測即刻粘接強度。Wa、WT1a、WT2a、Ca、CT1a、CT2a 組試件置于冷熱循環(huán)機內(nèi)，冷水?。? ℃，1 min）與熱水?。?5 ℃，1 min）交替處理樣本，循環(huán)5 000 次。

1.5 粘接強度測試

每組取6 個樣本進行石膏包埋，固定于萬能力學(xué)試驗機。加載頭的加載速度為0.5 mm/min，加載方向平行于粘接面。直至樣本斷裂時，記錄最大剪切力并測量每個試件的實際粘接面積。計算粘接強度：粘接強度（MPa）=最大剪切應(yīng)力值（N）/樣本粘接面積（mm2）。

1.6 掃描電鏡觀察粘接界面微觀形貌

每組取2 顆樣本在流水沖洗下，垂直于粘接界面通過慢速切割機，形成約1 mm 厚薄片，依次用250、400、600、800、1 000 目砂紙流水下拋光切割面，35%磷酸凝膠處理120 s，流水下徹底沖洗，5.25%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，超聲波震蕩清洗表面，乙醇梯度脫水，充分干燥，噴金，掃描電鏡下觀察牙本質(zhì)粘接界面微觀形貌。

1.7 粘接界面納米滲漏觀測

每組取2 顆樣本流水沖洗下，垂直于粘接界面通過慢速切割機，形成約1 mm 厚薄片，超聲震蕩清洗。待樣品完全干燥后，用2 層速干指甲油密封距離粘接界面1 mm 的牙本質(zhì)表面。將樣品浸入50%含氨硝酸銀溶液中避光保存24 h 后徹底沖洗。在顯影液中進行熒光照射8 h，定影液中浸泡4 h，沖洗，干燥。用400、800、1 000、1 500、2 000、2 500 目碳化硅砂紙拋光切割面，超聲波清洗表面。充分干燥、噴金、掃描電鏡的背散射模式下觀察牙本質(zhì)粘接界面納米滲漏。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS26.0 軟件進行Levene’s 方差齊性檢驗后，三因素方差分析過氧化脲、原花青素、老化處理對粘接強度的影響，各組老化前后及有無漂白處理使用t檢驗兩兩比較，不同預(yù)處理方式使用Bonferroni 檢驗兩兩比較，檢驗水準α 為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 粘接強度測試結(jié)果

各組粘接強度測試結(jié)果見表2，不同預(yù)處理方式的Bonferroni 檢驗結(jié)果見表3，三因素方差分析見表4，漂白+原花青素、老化+原花青素之間的牙本質(zhì)粘接強度分析分別見表5、表6。

表2 各組粘接強度測試結(jié)果Table 2 The bond strength results of each group ±s,MPa

表2 各組粘接強度測試結(jié)果Table 2 The bond strength results of each group ±s,MPa

Experimental grouping and bonding surface treatment as shown in Table 1. a, b, c: compared with group W, WT1, WT2, C, CT1 and CT2,the two groups with different symbols have statistical significance (P＜0.05). d, e, f, g: compared with group Wa, WT1a, WT2a, Ca, CT1a and CT2a, the two groups with different symbols have statistical significance(P＜0.05)

Group t P Wa Bond strength 23.00±1.89 23.69±0.55 24.58±0.55 13.80±1.55 19.52±1.69 20.50±1.61 Group Wad WT1ae WT2ae Caf CT1ag CT2ag Bond strength 12.74±0.71 21.73±2.22 22.62±1.74 8.29±2.34 18.04±1.94 19.44±2.22＜0.001 0.064 0.060＜0.001 0.052 0.053 WT1a WT2a Cb CT1c CT2c 11.23 2.54 2.61 12.63 2.73 2.71

表3 不同預(yù)處理方式的Bonferroni 檢驗結(jié)果Table 3 Results of Bonferroni test for different pretreatment methods

表4 三因素方差分析表結(jié)果Table 4 Three factors analysis of variance

表5 漂白與原花青素對牙本質(zhì)粘接強度簡單效應(yīng)分析Table 5 Simple effect analysis of bleaching and procyanidins on dentin bond strength

表6 老化與原花青素對牙本質(zhì)粘接強度簡單效應(yīng)分析Table 6 Simple effect analysis of aging and procyanidins on dentin bond strength

老化：老化后各組粘接強度均下降，其中W 與Wa、C 與Ca 的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而WT1 與WT1a、WT2 與WT2a、CT1 與CT1a、CT2 與CT2a 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

漂白：W 與C、WT1 與CT1、WT2 與CT2 兩兩比較，粘接強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Wa 與Ca、WT1a 與CT1a、WT2a 與CT2a 兩兩比較粘接強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

原花青素預(yù)處理：W 與WT1、W 與WT2、WT1與WT2、CT1 與CT2 之間粘接強度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），C 與CT1、C 與CT2 之間粘接強度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；老化后粘接強度WT1a 與WT2a、CT1a 與CT2a 之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Wa 與WT1a、Wa 與WT2a、Ca 與CT1a、Ca 與CT2a 之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

交互效應(yīng)：“漂白”、“老化”、“原花青素”主效應(yīng)均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二階交互效應(yīng)中“老化*原花青素”、“漂白*老化”、“漂白*原花青素”均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對于拮抗漂白和老化兩個作用因素，原花青素預(yù)處理5 min 均優(yōu)于原花青素預(yù)處理1 min，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），原花青素預(yù)處理1、5 min 均優(yōu)于無原花青素預(yù)處理，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 微觀形貌觀察

各組試件微觀形貌觀察見圖1。W、WT1、WT2混合層結(jié)合嚴密，樹脂密集且較長，規(guī)則排列，C、CT1 和CT2 組混合層結(jié)構(gòu)欠清晰，樹脂突相對較短較細；Wa、WT1a、WT2a、Ca、CT1a、CT2a 組混合層出現(xiàn)不同程度的裂紋，其中WT1a 和WT2a 組混合層結(jié)構(gòu)較清晰，裂紋最少，Wa 組牙本質(zhì)-粘接界面上可見數(shù)個狹窄裂隙，Ca、CT1a 和CT2a 組混合層局部破壞崩解，樹脂突排列稀疏雜亂。

Figure 1 Observation results of the microstructure of the bonding interface(×2 500)圖1 粘接界面微觀形貌觀察結(jié)果（×2 500）

2.3 納米滲漏觀察

各組試件納米滲漏觀察見圖2。圖像顯示各組牙本質(zhì)-粘接劑界面均出現(xiàn)不同程度納米泄漏，Wa、Ca 組混合層存在大量硝酸銀顆粒，經(jīng)原花青素處理后WT1a、WT2a、CT1a、CT2a 組混合層殘留銀離子顯著減少，且原花青素預(yù)處理1 min 和5 min的粘接界面殘留銀離子量相近。

Figure 2 Observation results of the nanoleakage of the bonding interface(×2 500)圖2 粘接界面納米滲漏觀察結(jié)果（×2 500）

3 討 論

漂白后的牙本質(zhì)即刻粘接強度低是一個臨床難題，這與過氧化脲分解產(chǎn)生的不穩(wěn)定自由基易在牙本質(zhì)中殘留有關(guān)［11］。而抗氧化劑含有多個電子供體位點，可有效中和牙本質(zhì)中殘留的氧自由基，迅速恢復(fù)牙本質(zhì)粘接強度［12］。原花青素作為一種天然抗氧化劑［8］，其作用迅速，安全性能高，成為近年研究的熱點。

本研究結(jié)果提示漂白處理后牙本質(zhì)即刻粘接強度與無漂白處理組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明漂白術(shù)后會出現(xiàn)牙本質(zhì)與復(fù)合樹脂即刻粘接強度降低，這與Cavalli 等［13］學(xué)者的研究結(jié)果一致。這可能因為殘留的自由基會干擾樹脂粘接劑的滲透附著和聚合［14］。臨床面對該問題，為了避免推遲修復(fù)時間，國外學(xué)者一直在嘗試使用抗氧化劑提升即刻粘接強度。本研究結(jié)果表明，使用5%原花青素預(yù)處理漂白后牙本質(zhì)，相比于無原花青素預(yù)處理的漂白組，粘接強度明顯升高，且漂白*原花青素有交互作用，說明原花青素對提升漂白后牙本質(zhì)即刻粘接強度具有積極作用。原花青素通過提供氫原子，與自由基結(jié)合，阻斷自由基鏈式反應(yīng)，從而逆轉(zhuǎn)粘接強度的下降［15］。關(guān)于原花青素作用時間上，不同學(xué)者觀點有所差異，Nair 等［8］認為至少需要10 min，Lai等［10］則認為至少需要3 h，而Freire 等［9］認為1 min 也能改善粘接效果。本實驗中，經(jīng)原花青素處理1 min 和5 min 的漂白組，即刻粘接強度提升均具有統(tǒng)計學(xué)意義，分析其原因可能與實驗采取的過氧化脲濃度差異有關(guān)。Vaz等［16］曾提出漂白后牙本質(zhì)殘留的過氧化物與漂白劑濃度呈正相關(guān)，本實驗中過氧化脲濃度為10%，組織中殘留氧較少，對樹脂滲漏和聚合影響小。本實驗中，原花青素作用1 min 后即可顯著提升牙本質(zhì)粘接強度，但隨著時間延長，即使作用時間達到5 min，粘接強度與1 min 相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Freire 等［17］學(xué)者對抗氧化劑反應(yīng)動力學(xué)的研究提示，雖然原花青素和牙本質(zhì)之間的接觸時間越長，氧化劑和抗氧化劑之間的反應(yīng)時間就越長，但還原反應(yīng)速度約在1 min 內(nèi)即可達到峰值，之后還原反應(yīng)速度顯著下降。此外，原花青素使用濃度和漂白次數(shù)是否會引起預(yù)處理時間的差異，有待進一步探討。

漂白劑的氧化性、酸性及試件的老化將觸發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）的自我催化［18］，導(dǎo)致混合層中膠原纖維發(fā)生水解變性，降低粘接耐久性［5,19］。本實驗通過冷熱循環(huán)5 000 轉(zhuǎn)發(fā)現(xiàn)：未使用原花青素預(yù)處理的漂白組中，即刻與老化的粘接強度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而使用原花青素預(yù)處理（1、5 min）預(yù)處理的漂白組中，即刻與老化組的粘接強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明原花青素對漂白后牙本質(zhì)粘接耐久性具有重要意義?？寡趸瘎┰ㄇ嗨啬軌蚩焖偾宄^氧化物，截斷MMP 生成途徑，從而提高混合層的質(zhì)量［20］。同時原花青素還可以發(fā)揮其良好的交聯(lián)能力，不僅可以增加膠原分子間交聯(lián)度，維持膠原纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，還能誘導(dǎo)MMP 三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化，并阻擋分子移動，這對于抑制MMP 活性具有顯著作用［21-22］。

本實驗粘接界面縱剖面微觀形貌顯示，即刻組粘接界面混合層完整均勻，老化組混合層不均，且出現(xiàn)不同程度裂隙，其中不經(jīng)原花青素預(yù)處理的漂白老化組裂隙最大。Van Meerbeek 等［23］認為混合層質(zhì)量決定了牙本質(zhì)粘接的強度和耐久性，這與本實驗結(jié)果一致。Betancourt 等［24］認為，粘接劑并不能完全滲漏牙本質(zhì)脫礦層，這些未封閉結(jié)構(gòu)將形成納米滲漏通道，成為水解牙本質(zhì)中膠原蛋白的途徑。本實驗中，漂白組可以明顯看到在混合層及牙本質(zhì)中存在大量銀離子。在使用了原花青素處理后的混合層中銀離子明顯減少，說明原花青素在提高混合層質(zhì)量，恢復(fù)牙本質(zhì)粘接強度具有積極意義。這可能由于原花青素處理后去除了抑制樹脂聚合和滲透的過氧化物，另外原花青素通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶從而保證了完整的混合層結(jié)構(gòu)，使得混合層中未封閉結(jié)構(gòu)減少，納米滲漏通道明顯減少。

綜上，5%原花青素預(yù)處理對牙本質(zhì)粘接具有積極作用，能夠提高漂白后即刻粘接強度，不能提高無漂白處理組即刻粘接強度，但均能改善二者的粘接耐久性，且5%原花青素預(yù)處理1 min 即可達到較理想的效果。因此，原花青素對于當(dāng)臨床上不能等待過氧化脲被消除，需要即刻修復(fù)的患者具有積極的應(yīng)用前景。

【Author contributions】 Li SH wrote the article. Chen HX, Zhou LP performed the experiments. Yang Q collected and analyzed the data.Xie CL revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.